DNA-Reparatur und Zelltod nach gentoxischem Stress in Monozyten, dendritischen Zellen und Makrophagen

Monozyten wie auch dendritische Zellen (DCs) und Makrophagen sind ein wichtiger Bestandteil des angeborenenen unspezifischen Immunsystems. Ein Kennzeichen dieser Zellen ist die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) zur Abtötung von Pathogenen. Im Fall von chronischen Entzündungen oder Infekten kann es zu einer explosionsartigen Freisetzung freier Radikale kommen ('Oxidative Burst'). Aus vorangegangenen Untersuchungen war bekannt, dass die Expression der beiden Basen Exziosions Reparatur (BER)-Proteine XRCC1 und Ligase III während der Ausreifung humaner Monozyten zu DCs induziert wird (Briegert and Kaina, 2007). Dies lies vermuten, dass Monozyten aufgrund einer defekten BER eine hohe Sensitivität gegenüber ROS aufweisen. Um diese Hypothese zu überprüfen, wurde die Wirkung von ROS auf humane Monozyten und daraus abgeleiteten DCs und Makrophagen untersucht. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass Monozyten eine hohe Sensitivität gegenüber oxidativem Stress aufweisen, was auf eine höhere Einzelstrangbruch-Rate zurückzuführen war. Ursache hierfür ist das Fehlen der BER-Proteine XRCC1, Ligase III und PARP-1. Die fehlende Expression dieser Proteine resultierte letztendlich in Monozyten in einem Defekt der BER und DNA-Einzelstrangbruchreparatur. rnDie Proteine XRCC1, Ligase III und PARP-1 sind auch Bestandteil des Apparats des B-NHEJ ('backup-non homologous end joining'), was auf eine Beeinträchtigung der Monozyten hinsichtlich der Prozessierung von Doppelstrangbrüchen (DSBs) schließen lässt. Zur Untersuchung dieser Vermutung, wurde die Wirkung von Ionisierender Strahlung ('ionizing radiation'; IR) auf Monozyten, DCs und Makrophagen bestimmt. Monozyten zeigten eine signifikant höhere Sensitivität gegenüber IR als DCs und Makrophagen, was auf eine erhöhte DSB-Rate in den Monozyten nach IR zurückzuführen war. Expressionsanalysen und ein DNA-PK-Aktivitäts-Assay zeigten zusätzlich, dass Monozyten keine DNA-PKcs, ein bedeutender Faktor des C-NHEJ, exprimieren. Somit haben Monozyten sowohl einen Defekt im B-NHEJ als auch im C-NHEJ und sind demnach nicht in der Lage, DSBs zu reparieren.rnAuch gegenüber dem Alkylanz und Chemotherapeutikum Temozolomid bewirken die Reparaturdefekte eine hohe Sensitivität der Monozyten. Zur Therapie von Hirntumoren werden neben der Operation, die Bestrahlung und Chemotherapie mit Temozolomid angewendet. Die hohe Sensitivität von Monozyten gegenüber IR und Temozolomid könnte eine Erklärung für die starke Immunsuppression bei einer derartigen Therapie sein.rn

Mechanistic study of cell death induction by O 6-methylating agents, focusing on the role of homologous recombination as a molecular target for sensitization of tumor cells to chemotherapeutic alkylating agents

Chemotherapeutic SN1‑methylating agents are important anticancer drugs. They induce several covalent modifications in the DNA, from which O6‑methylguanine (O6MeG) is the main toxic lesion. In this work, different hypotheses that have been proposed to explain the mechanism of O6MeG‑triggered cell death were tested. The results of this work support the abortive processing model, which states that abortive post‑replicative processing of O6MeG‑driven mispairs by the DNA mismatch repair (MMR) machinery results in single‑strand gaps in the DNA that, upon a 2nd round of DNA replication, leads to DNA double‑strand break (DSB) formation, checkpoint activation and cell death. In this work, it was shown that O6MeG induces an accumulation of cells in the 2nd G2/M‑phase after treatment. This was accompanied by an increase in DSB formation in the 2nd S/G2/M‑phase, and paralleled by activation of the checkpoint kinases ATR and CHK1. Apoptosis was activated in the 2nd cell cycle. A portion of cells continue proliferating past the 2nd cell cycle, and triggers apoptosis in the subsequent generations. An extension to the original model is proposed, where the persistence of O6MeG in the DNA causes new abortive MMR processing in the 2nd and subsequent generations, where new DSB are produced triggering cell death. Interestingly, removal of O6MeG beyond the 2nd generation lead to a significant, but not complete, reduction in apoptosis, pointing to the involvement of additional mechanisms as a cause of apoptosis. We therefore propose that an increase in genomic instability resulting from accumulation of mis‑repaired DNA damage plays a role in cell death induction. Given the central role of DSB formation in toxicity triggered by chemotherapeutic SN1‑alkylating agents, it was aimed in the second part of this thesis to determine whether inhibition of DSB repair by homologous recombination (HR) or non‑homologous end joining (NHEJ) is a reasonable strategy for sensitizing glioblastoma cells to these agents. The results of this work show that HR down‑regulation in glioblastoma cells impairs the repair of temozolomide (TMZ)‑induced DSB. HR down‑regulation greatly sensitizes cells to cell death following O6‑methylating (TMZ) or O6‑chlorethylating (nimustine) treatment, but not following ionizing radiation. The RNAi mediated inhibition in DSB repair and chemo‑sensitization was proportional to the knockdown of the HR protein RAD51. Chemo‑sensitization was demonstrated for several HR proteins, in glioma cell lines proficient and mutated in p53. Evidence is provided showing that O6MeG is the primary lesion responsible for the increased sensitivity of glioblastoma cells following TMZ treatment, and that inhibition of the resistance marker MGMT restores the chemo‑sensitization achieved by HR down‑regulation. Data are also provided to show that inhibition of DNA‑PK dependent NHEJ does not significantly sensitized glioblastoma cells to TMZ treatment. Finally, the data also show that PARP inhibition with olaparib additionally sensitized HR down‑regulated glioma cells to TMZ. Collectively, the data show that processing of O6MeG through two rounds of DNA replication is required for DSB formation, checkpoint activation and apoptosis induction, and that O6MeG‑triggered apoptosis is also executed in subsequent generations. Furthermore, the data provide proof of principle evidence that down‑regulation of HR is a reasonable strategy for sensitizing glioma cells to killing by O6‑alkylating chemotherapeutics.

Regulation der Stress-aktivierten Proteinkinasen durch den gentoxischen Benzo[a]pyren-Metaboliten BPDE

Polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAK) sind ubiquitäre Verschmutzungen der Umwelt und entstehen während der unvollständigen Verbrennung organischen Materials wie Holz, Kohle und Erdöl. Werden diese chemisch nicht reaktiven PAK in den Körper aufgenommen, durchlaufen sie eine Reihe von enzymatischen Umsetzungen, die unter der Bezeichnung Fremdstoffmetabolismus zusammengefasst werden. Die chemische Umsetzung des PAK und Prokarzinogens Benzo[a]pyren (B[a]P) führt u.a. zur Bildung des reaktiven Metaboliten B[a]P-7,8-dihydrodiol-9,10-epoxid (BPDE). BPDE ist stark elektrophil und kann auf Grund dieser Eigenschaft an nukleophile Makromoleküle wie Proteine und DNA binden. Die Bildung von BPDE-DNA-Addukten resultiert in der Entstehung von Mutationen und kann zur Tumorbildung führen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte die Wirkung von BPDE als Modellsubstanz für gentoxische Agenzien auf intrazelluläre Signalkaskaden und die Konsequenzen der BPDE-Exposition bezüglich der Zellaktivität untersucht werden. Es konnte gezeigt werden, dass BPDE-Behandlung von Mausfibroblasten eine intrazelluläre Signalkaskade induziert, welche zur Aktivierung der Stressaktivierten Proteinkinasen (SAPK) JNK und p38 führt. An dieser Signalkaskade sind Src-ähnliche Kinasen beteiligt. BPDE-Behandlung führt in den untersuchten Mausfibroblasten zur Induktion von DNA-Einzelstrangbrüchen, deren Auftreten zeitlich mit der SAPK-Aktivierung korreliert. Die BPDEinduzierten DNA-Strangbrüche sind die Folge der Entfernung dieser Läsionen aus dem Genom durch die Nukleotidexzisionsreparatur (NER). Erkannt werden BPDE-DNA-Addukte durch die NERProteine XPA und XPC (Xeroderma Pigmentosum Komplementationsgruppe A und C). Nach der Erkennung von BPDE-DNA-Addukten kommt es zur Rekrutierung von Nukleasen, welche die vorliegende Läsion und umliegende Nukleotide aus dem Genom entfernen. In XPA- und XPCdefizienten Mausfibroblasten induziert BPDE daher keine DNA-Strangbrüche. Jedoch ist nur in XPCdefizienten Zellen, aber nicht in XPA-defizienten Zellen, die SAPK-Aktivierung drastisch reduziert. Behandlung von Mausfibroblasten mit Benzo[c]phenanthren-3,4-Diol-1,2-Epoxid, einem PAK, dessen DNA-Addukte schlecht durch NER-Faktoren erkannt und repariert werden, führt zu keiner SAPKAktivierung. Die Aktivierung von p38 und JNK scheint demnach abhängig zu sein von der Erkennung des primären DNA-Schadens. Die XPC-abhängige SAPK-Aktivierung schützt die Zellen vor BPDEabhängiger Toxizität, da sowohl XPC- als auch p38-defiziente Mausfibroblasten eine höhere Sensitivität gegenüber BPDE zeigen als korrespondierende Wildtypzellen. Zusamenfassend konnte in dieser Arbeit ein neuer Signalweg beschrieben werden, in dem DNASchäden, verursacht durch BPDE, über die XPC-abhängige DNA-Schadenserkennung, die Aktivierung der SAPK induziert. Diese Aktivierung der SAPK schützt vor BPDE-induzierter Toxizität.

Untersuchungen zur Chemosensitivität von testikulären Tumorzellen gegenüber Cisplatin

Metastasierender Krebs ist bei Erwachsenen in der Regel nicht heilbar. Eine Ausnahme stellen testikuläre Keimzelltumoren (TKZT) dar, da über 75 % der Patienten mit fortgeschrittenen metastasierenden TKZT mit einer auf Cisplatin basierenden Kombinations-Chemotherapie geheilt werden können. Zelllinien, die aus TKZT isoliert wurden, behalten diese Cisplatin-Sensitivität in vitro bei. Somit spiegeln Testistumorzelllinien die klinische Situation wider und sind deswegen ein gutes Modellsystem um zu untersuchen, welche Faktoren der Cisplatin-Sensitivität zugrunde liegen. Die Ursachen der Cisplatin-Sensitivität in Testistumoren sind nicht bekannt. Es wurde bereits gezeigt, dass Testistumorzellen eine geringe Kapazität für die Entfernung von Cisplatin-induzierten DNA-Platinierungen aufweisen. Dieser Defekt in der DNA-Reparatur könnte ein Faktor für die beobachtete Cisplatin-Sensitivität sein. Cisplatin induziert sowohl Intrastrang-Vernetzungen als auch Interstrang-Vernetzungen (ICLs). Die Bildung und Reparatur der Cisplatin-induzierten Intrastrang-Vernetzungen wurde mittels DNA-Slot-Blot, die Bildung und Entfernung von Interstrang-Vernetzungen wurde mithilfe des Comet-Assays untersucht. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass die Reparatur von Intrastrang-Vernetzungen in Testis- und Blasentumorzelllinien vergleichbar ist. Somit sind Testistumorzellen in diesem Reparaturweg nicht beeinträchtigt. Im Unterschied dazu zeigte sich, dass Testistumorzellen die ICLs nicht oder nur mit einer reduzierten Kapazität entfernen können.Da die ICL-Reparatur über die Bildung von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSB) mit anschließender DSB-Reparatur verläuft, wurde die Kinetik der DSB-Reparatur anhand der Immundetektion der Histon-Variante γH2AX, die zur Visualisierung von DSB verwendet wird, verfolgt. γH2AX Foci wurden nach Behandlung mit Cisplatin in Testistumorzellen und Blasentumorzellen gebildet. Anders als in Blasentumorzellen blieb der Prozentsatz an γH2AX-positiven Zellen in Testistumorzellen bestehen. Offensichtlich konnten die Testistumorzellen die Cisplatin-induzierten ICLs nicht korrekt prozessieren, was dazu führte, dass γH2AX Foci persistierten. Da unreparierte DNA-Läsionen eine DNA-schadensabhängige Antwort einleiten können, wurde die Aktivierung der Hauptfaktoren dieser Signalwege untersucht. In den Testistumorzellen zeigte sich eine Erhöhung der p53 Proteinmenge nach Cisplatin-Behandlung. Des Weiteren wurde die durch Cisplatin induzierte Aktivierung von ATM/ATR, Chk1/Chk2, Bax und Noxa in Testis- und Blasentumorzellen vergleichend untersucht. Es wurde bereits gezeigt, dass der Reparaturfaktor ERCC1-XPF in Testistumorzelllinien reduziert vorliegt. Um eine mögliche Rolle von ERCC1-XPF für die Reparatur-Defizienz der ICLs und Cisplatin-Sensitivität in Testistumorzellen zu analysieren, wurde ERCC1-XPF in der Testistumorenzelllinie 833K mithilfe eines Expressionsvektors überexprimiert, und der Einfluss von ERCC1-XPF auf ICL-Reparatur sowie Cisplatin-Sensitivität wurde ermittelt. Überexpression von ERCC1-XPF führte zur Reparatur der ICLs in 833K-Zellen und verminderte die Cisplatinsensitivität. Somit scheint die Cisplatinsensitivität der Testistumorzellen, zumindest zum Teil, auf einer verminderten ICL-Reparatur zu beruhen. Des Weiteren wurde in „proof of principle“ Experimenten ERCC1-XPF in der Cisplatin-resistenten Blasentumorzelllinie MGH-U1 mittels siRNA herunterreguliert, und die Auswirkung der Herunterregulation auf die ICL-Reparatur und die Cisplatinsensitivität wurde geprüft. RNA-Interferenz-vermittelte Herunterregulierung von ERCC1-XPF reduzierte die Prozessierung der Cisplatin-induzierten ICLs und verstärkte die Cisplatinsensitivität in MGH-U1 Zellen. Somit wurde in dieser Arbeit zum ersten Mal gezeigt, dass die Testistumorzellen in Vergleich zu Blasentumorzellen in der Reparatur von ICLs defizient sind, wobei die verminderte ICL-Reparatur auf die geringe Expression von ERCC1-XPF zurückgeführt werden konnte. Diese ICL-Reparatur-Defizienz könnte, zumindest zu einem Teil, für die Sensitivität der Testistumoren gegenüber Cisplatin verantwortlich sein.

Consequences of DNA damage for gene transcription : direct effects of modified nucleobases and the role of base excision repair = Folgen von DNA-Schäden für die Gentranskription

The presence of damaged nucleobases in DNA can negatively influence transcription of genes. One of the mechanisms by which DNA damage interferes with reading of genetic information is a direct blockage of the elongating RNA polymerase complexes – an effect well described for bulky adducts induced by several chemical substances and UV-irradiation. However, other mechanisms must exist as well because many of the endogenously occurring non-bulky DNA base modifications have transcription-inhibitory properties in cells, whilstrnnot constituting a roadblock for RNA polymerases under cell free conditions. The inhibition of transcription by non-blocking DNA damage was investigated in this work by employing the reporter gene-based assays. Comparison between various types of DNA damage (UV-induced pyrimidine photoproducts, oxidative purine modifications induced by photosensitisation, defined synthetic modified bases such as 8-oxoguanine and uracil, and sequence-specific single-strand breaks) showed that distinct mechanisms of inhibition of transcription can be engaged, and that DNA repair can influence transcription of the affectedrngenes in several different ways.rnQuantitative expression analyses of reporter genes damaged either by the exposure of cells to UV or delivered into cells by transient transfection supported the earlier evidence that transcription arrest at the damage sites is the major mechanism for the inhibition of transcription by this kind of DNA lesions and that recovery of transcription requires a functional nucleotide excision repair gene Csb (ERCC6) in mouse cells. In contrast, oxidisedrnpurines generated by photosensitisation do not cause transcriptional blockage by a direct mechanism, but rather lead to transcriptional repression of the damaged gene which is associated with altered histone acetylation in the promoter region. The whole chain of events leading to transcriptional silencing in response to DNA damage remains to be uncovered. Yet, the data presented here identify repair-induced single-strand breaks – which arise from excision of damaged bases by the DNA repair glycosylases or endonucleases – as arnputative initiatory factor in this process. Such an indirect mechanism was supported by requirement of the 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) for the inhibition of transcription by synthetic 8-oxodG incorporated into a reporter gene and by the delays observed for the inhibition of transcription caused by structurally unrelated base modifications (8-oxoguanine and uracil). It is thereby hypothesized that excision of the modified bases could be a generalrnmechanism for inhibition of transcription by DNA damage which is processed by the base excision repair (BER) pathway. Further gene expression analyses of plasmids containing single-strand breaks or abasic sites in the transcribed sequences revealed strong transcription inhibitory potentials of these lesions, in agreement with the presumption that BER intermediates are largely responsible for the observed effects. Experiments with synthetic base modifications positioned within the defined DNA sequences showed thatrninhibition of transcription did not require the localisation of the lesion in the transcribed DNA strand; therefore the damage sensing mechanism has to be different from the direct encounters of transcribing RNA polymerase complexes with DNA damage.rnAltogether, this work provides new evidence that processing of various DNA basernmodifications by BER can perturb transcription of damaged genes by triggering a gene silencing mechanism. As gene expression can be influenced even by a single DNA damage event, this mechanism could have relevance for the endogenous DNA damage induced in cells under normal physiological conditions, with a possible link to gene silencing in general.

Bedeutung endogener Faktoren für Steady-State-Level und Reparatur oxidativer DNA-Modifikationen in Säugerzellen

Die endogene Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) - wie beispielsweise Hydroxyl-Radikale, Superoxid-Radikalanionen, Wasserstoffperoxid und Singulett-Sauerstoff - bei essentiellen Stoffwechselreaktionen in allen aeroben Lebewesen stellt eine potentielle Gefahr für die Integrität der DNA in jeder Zelle dar. ROS generieren in der DNA unter anderem oxidative DNA-Modifikationen (zum größten Teil wahrscheinlich 8-Hydroxyguanin (8-oxoG)), welche wiederum zu einem Teil zu Mutationen führen.In dieser Arbeit wurden Untersuchungen vorgenommen, in welchem Ausmaß zum einen die Steady-State-Level oxidativer DNA-Schäden in Säugerzellen zum anderen die Reparaturgeschwindig-keiten solcher DNA-Modifikationen durch verschiedene endogene Faktoren beeinflußt werden.Im Mittelpunkt der Arbeit stand dabei die Charakterisierung der 8-Hydroxyguaninglykosylase der Säugerzellen. Sie ist das Produkt des OGG1-Gens, das erst 1997 kloniert wurde. In transfizierten Zellinien konnte durch eine konstitutive Überexpression des menschlichen OGG1-Gens demonstriert werden, daß die Reparatur von induzierten oxidativen Basenmodifikationen bis zu dreifach beschleunigt wird und daß eine Korrelation zwischen dem Grad der Überexpression und der Reparaturrate besteht. Dagegen waren die Steady-State-Level der oxidativen DNA-Schäden durch die Überexpression unbeeinflußt. Sowohl bei den spontanen Mutationsraten als auch bei den durch oxidative Schädigungen induzierten Mutationsfrequenzen konnte keine Erniedrigung bedingt durch die hOGG1-Überexpression beobachtet werden.Weitere Untersuchungen zur Bedeutung von Ogg1-Protein konnten in Mäusezellen durchgeführt werden, in denen das OGG1-homologe Mäusegen, mOGG1, homozygot inaktiviert (mOGG1(-/-)) worden war. Hierbei konnte gezeigt werden, daß in den mOGG1-defizienten Zellen im Vergleich zu den entsprechenden Wildtyp-Zellen (mOGG1(+/+)) eine Reparatur induzierter oxidativer Basenmodifikationen erst nach 8 h einsetzt, während in den Kontrollzellen schon nach 3-4 h 50 % der Modifikationen repariert waren. Die Steady-State-Level oxidativer Modifikationen in mOGG1(-/-)-Zellen waren in immortalisierten, schnell proliferierenden Mäusefibroblasten nur um den Faktor 1.4, in primären Mäusehepatocyten jedoch um den Faktor 2.5 gegenüber den Wildtyp-Zellen erhöht.Inwieweit das menschliche Reparaturprotein Xrcc1 (X-ray repair cross complementing group 1) auch an der Prozessierung oxidativer DNA-Modifikationen beteiligt ist, und ob dabei möglicherweise eine Interaktion mit Ogg1 vorliegt, wurde in der XRCC1-defizienten CHO-Zellinie EM9 untersucht. Dabei wurde ermittelt, daß weder die Steady-State-Level noch die Reparaturkinetiken der oxidativen Basenmodifikationen durch die XRCC1-Defizienz beeinflußt werden. Aufgrund weiterer Ergebnisse kann jedoch nicht ausgeschlossen werden, daß das Xrcc1-Protein zumindest am Ligationsschritt während der Reparatur oxidativer DNA-Schäden beteiligt ist.In einem weiteren Schwerpunkt der Arbeit wurde untersucht, ob Unterschiede im Steady-State-Level in Abhängigkeit von Organ-, Gewebe- und Zelltyp auftreten. Dazu wurden Untersuchungen in Bronchialkarzinom-Zellinien verschiedener Subtypen durchgeführt. Des weiteren wurde zur Frage der Zelltyp-Abhängigkeit in der menschlichen Zellinie HL60 der Einfluß des Zelldifferenzierungsstadiums auf die Steady-State-Level untersucht.

DNA-Doppelstrangbrüche als zentrales Ereignis alkylierungsinduzierter Zytotoxizität

DNA-Doppelstrangbrüche als zentrales Ereignis alkylierungsinduzierter Zytotoxizität Die vorliegende Arbeit befaßt sich mit der Entstehung von DNA-Doppelstrangbrüchen durch gentoxische Agenzien sowie den zytotoxischen Auswirkungen, die DNA-Doppelstrangbrüche für die Säuger-Zelle haben. Im ersten Teil der Arbeit wurden die molekularen Mechanismen untersucht, die am O6-Methylguanin (O6-MeG)-DNA-Schaden, hervorgerufen durch alkylierende Agenzien, ablaufen. Dabei konnte gezeigt werden, das O6-Methylguanin DNA-Methyltransferase (MGMT) O6-MeG/C und O6-MeG/T in vitro mit gleicher Effizienz repariert und daß die Reparatur von O6-MeG nach dem ersten Zellzyklus protektive Auswirkung auf das zelluläre Überleben hat. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit stand die Induktion von DNA-Doppelstrangbrüchen durch gentoxische Agenzien in Mausfibroblasten und CHO-Zellen im Mittelpunkt. Mit Hilfe der Einzelzellgelelektrophorese (SCGE, Comet Assay) wurde gezeigt, daß alkylierende Substanzen und die durch Elektroporation in Zellen hineingebrachten Restriktionsenzyme PvuII und EcoRI DNA-Doppelstrangbrüche zu induzieren vermögen. Die Induktion und Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen nach Elektroporation von PvuII war vom p53-Status der Zellen abhängig, da p53-defiziente Zellen im Gegensatz zu p53-profizienten Zellen höhere DNA-Doppelstrangbruchraten über einen längeren Zeitraum aufwiesen. Im dritten Teil wurden die physiologischen Auswirkungen einer Behandlung von Zellen mit Induktoren von DNA-Doppelstrangbrüchen untersucht. Es wurde gezeigt, daß Alkylanzien in Abhängigkeit vom Vorhandensein von MGMT Apoptose induzieren. Mit PvuII elektroporierte p53-knockout Mausfibroblasten zeigten infolgedessen und im Gegensatz zu p53-wildtyp Zellen hohe Apoptoseraten. Die Induktion der Apoptose nach Behandlung mit PvuII wie auch nach g-Bestrahlung ging einher mit einem Abfall der Proteinmenge des antiapoptotischen Bcl-2. Zusammengenommen weisen die Versuchsergebnisse dieser Arbeit darauf hin, daß nach Behandlung von Zellen mit O6-MeG-generierenden Agenzien wie auch nach g-Bestrahlung DNA-Doppelstrangbrüche das ultimative Signal darstellen können.

Mechanismus der Apoptose, Gentoxizität und DNA-Reparatur in Herpesvirus-Thymidinkinase-exprimierenden Säugerzellen nach Behandlung mit Antiherpes-Virustatika vom Typ der Nukleosidanaloga

Um Cytotoxizität und Gentoxizität nukleosidischer Antiherpes-Virustatika zu untersuchen, wurden stabile CHO-Klone etabliert, die Thymidinkinase (TK) des Herpes simplex-Virus Typ 1 (HSV-TK) oder des Varicella zoster-Virus (VZV-TK) exprimieren. In HSV-TK-exprimierenden Zellen wurde das Purinanalogon Ganciclovir (GCV) effizient in die genomische DNA eingebaut, worauf in den nächsten Replikationsrunden DNA-Strangbrüche und Aberrationen entstehen und Apoptose ausgelöst wird. GCV-induzierte Apoptose wird hauptsächlich über den mitochondrialen Weg vermittelt, wobei das anti-apoptotische Protein Bcl-2 im Mittelpunkt steht. Nach GCV-Behandlung konnte eine Caspase-9-vermittelte post-translationale Spaltung von Bcl-2 nachgewiesen werden. Das 23 kDa-großes Bcl-2-Fragment wirkt im Gegensatz zum intakten Bcl-2-Protein pro-apoptotisch und verstärkt die Cytochrom C-Freisetzung und damit die Aktivierung der Caspase-9, die Bcl-2 spaltet, was zu einem positiven 'Amplifikationsloop' des mitochondrialen apoptotischen Weges führt. In weiteren Experimenten wurde gezeigt, daß in die DNA inkorporiertes GCV durch Basenexzisionsreparatur repariert wird, wobei die DNA-Polymerase ß eine entscheidende Rolle spielt. Diese Reparatur führte zu einer signifikanten Reduktion der Apoptose und Klastogenität und damit zur Resistenzsteigerung gegenüber GCV. In VZV-TK-exprimierenden Zellen wurde gezeigt, daß Brivudin (BVDU), gleichermaßen Apoptose und Nekrose induzierte. Für die BVDU-induzierte Cytotoxizität konnte die Hemmung der Thymidylatsynthetase als Ursache identifiziert werden. Im Gegensatz zur GCV-induzierten Apoptose war für die BVDU-induzierte Apoptose der Rezeptor (Fas/CD95/APO-1)-vermittelte Weg von vorrangiger Bedeutung.

Einfluss von Stickstoffmonoxid, Hydroxylradikalen und Peroxynitrit auf DNA-Schäden, DNA-Reparatur und Mutationen

Im Rahmen dieser Arbeit wurde untersucht über welche Mechanismen und unter welchen Bedingungen Stickstoffmonoxid (NO) und verwandte reaktive Spezies wie Peroxynitrit und Hydroxylradikale zur Krebsentstehung beitragen können. NO führte an zellfreier DNA kaum zu oxidativen DNA-Schäden. Peroxynitrit, generiert aus 3-Morpholinosydnonimin (SIN-1), induzierte neben Einzel-strangbrüchen und AP-Läsionen vor allem oxidierte Purinmodifikationen (50 % 8-Hydroxyguanin (8-oxoG)). Hydroxylradikale, freigesetzt aus 4-Hydroxypyridinthion, induzierten neben Einzelstrangbrüchen und AP-Läsionen oxidierte Pyrimidinmodifikationen in der DNA. Nach Transformation und Replikation der geschädigten DNA in E. coli DT-2 wurden überwiegend GC nach AT Transitionen (Hydroxylradikalschädigung), wahrscheinlich verursacht durch das in der DNA induzierte 5-Hydroxycytidin, bzw. GC nach TA Transversionen (Peroxynitrit), verursacht durch das induzierte 8-oxoG, detektiert. In Zellkulturexperimenten führte endogenes NO, freigesetzt von B6-INOS-Zellen (8µM) nicht zu einem Anstieg der Gleichgewichtsspiegel oxidativer DNA-Schäden, hatte keinen Einfluss auf deren Induzierbarkeit und Reparatur, die Zellpro-liferation und den Glutathionspiegel, schützte jedoch vor der Induktion von Einzelstrangbrüchen und Mikrokernen durch Wasserstoffperoxid. Exogenes NO, freigesetzt durch den Zerfall von Dipropylentriamin-NONOat, hemmte in Konzentrationen ab 0,5 mM spezifisch die Reparatur oxidativer DNA-Schäden, nicht jedoch die von Pyrimidindimeren, AP-Läsionen und Einzelstrangbrüchen,und führte in Konzentrationen > 1 mM zu einer Induktion von DNA-Schäden in den B6-Mausfibroblasten. Dabei ähnelte das induzierte Schadensprofil sehr dem von SIN-1.

Untersuchungen zur Beeinflussung der Reparatur oxidativer DNA-Schäden durch Poly(ADP-Ribose)-Polymerase, AP-Endonuklease 1 und das Xeroderma pigmentosum A Protein

Gegenstand dieser Arbeit war die Untersuchung der Bedeutung der Poly(ADP-Ribose)-Polymerase 1 (PARP 1), der AP Endonuklease 1 (Ape 1) und des Xeroderma pigmentosum A (XPA) Proteins für die DNA-Reparatur in Säugerzellen.Zunächst wurde der Einfluss der PARP 1-Aktivität auf die Reparatur verschiedener DNA-Modifikationen untersucht. Die Ergebnisse zeigen erstmalig, dass eine Hemmung der PARP-Aktivität nicht nur eine deutliche Verlangsamung der Reparatur von Einzelstrangbrüchen, sondern auch von oxidativen Purinmodifikationen und Pyrimidindimeren zur Folge hat. Interessanterweise erfolgte diese Verlangsamung der DNA-Reparatur nicht in Csb-defizienten Zellen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Aktivierung der PARP 1 und das Csb-Protein zusammen an einem neuartigen Mechanismus beteiligt sind, der die globale Reparatur verschiedener DNA-Modifikationen beschleunigt.Weiterhin wurde die Bedeutung der Nukleotidexcisionsreparatur als back-up Reparatur von 8 Hydroxyguanin untersucht. Dazu wurden normale und XPA-defiziente Fibroblasten des Menschen mit einem hOgg1-anitsense Konstrukt transfiziert und dann in diesen Zellen die Reparaturkinetiken oxidativer Basenmodifikationen bestimmt. Dadurch konnte eine Beteiligung des XPA-Proteins an diesem Reparaturweg ausgeschlossen werden.Außerdem wurden die Auswirkungen einer AP Endonuklease-1-Überexpression in XRCC1-defizienten Zellen auf die Reparatur von Einzelstrangbrüchen untersucht. Die Reparatur der induzierten Einzelstrangbrüche war in XRCC1-defizienten Zellen erwartungsgemäß deutlich langsamer als in XRCC1-profizienten Zellen. Die Überexpression der AP Endonuklease 1 in XRCC1-defizienten Zellen führte zu einer teilweisen Beschleunigung der Einzelstrangbruchreparatur.

Endogene DNA-Schädigung als Ursache genetischer Instabilität

Zusammenfassung Diese Arbeit beschreibt Untersuchungen über die zellulären Mechanismen, die zur Bildung dieser DNA-Schäden führen, sowie über die biologischen Auswirkungen dieser Schäden. Die Untersuchungen zu Uracil in der DNA wurden in ung-knockout-MEFs und Mäusen durchgeführt, die es erlauben, die Konsequenzen eines Ausfalls der wichtigsten Reparaturglykosylase für Uracil zu beleuchten. Die Ergebnisse zeigen eine deutliche Akkumulation von Uracil in den ung-/--Mausfibroblasten im Vergleich zum Wildtyp. In frisch isolierten Leber- und Milzzellen der Mäuse konnte dieser genotypspezifische Unterschied, wenn auch weniger ausgeprägt, ebenso beobachtet werden, nicht jedoch in reifen Spermien. Dieser gewebespezifische Unterschied und die quantitativ stärker ausgeprägte Akkumulation in ung-/--Mausfibroblasten im Vergleich zu den Mäusegeweben gab Anlass zur Vermutung, dass die Proliferation der Zellen für den Haupteintrag an Uracil in die DNA verantwortlich ist. Erstmals konnte in Versuche mit konfluenten (nicht mehr proliferierenden) ung-/--Mausfibroblasten gezeigt werden, dass nicht die spontane hydrolytische Desaminierung von Cytosin, sondern der Fehleinbau von dUMP während der DNA-Replikation die Hauptquelle für Uracil in der DNA von Säugerzellen darstellt. Da der Uracilmetabolismus ein wichtiges Target in der Chemotherapie ist, lag es nahe, das zur Verfügung stehende ung-knockout-Modell der MEFs zur Untersuchung mit Fluorpyrimidinen, die als Zytostatika verwendet werden, einzusetzen. Da bisher die Ursachen der beobachteten Apoptose der Tumorzellen und aller anderen metabolisch hochaktiven Zellen eines behandelten Organismus noch nicht vollständig verstanden ist, wurden diese Zellen mit verschiedenen Fluorpyrimidinen behandelt, die als Thymidylatsynthasehemmer die de novo Synthese von Thymidin unterbinden. Es konnte gezeigt werden, dass ung-/- Mausfibroblasten, im Gegensatz zu ung+/+ Mausfibroblasten, verstärkt Uracil in der DNA akkumulieren. Obwohl die ung+/+ Mausfibroblasten keine erhöhten Uracil-Spiegel in der DNA aufwiesen, zeigten sie bei Inkubation mit einem der beiden Thymidylatsynthasehemmern, 5-Fluoruracil (5-FU), die gleiche Sensitivität in einem nachfolgenden Proliferationsversuch wie die ung-/- Mausfibroblasten. Dies lässt darauf schließen, dass weder Reparatur noch Einbau von Uracil in die DNA für die beobachtete Toxizität dieser Zytostatika notwendig sind. Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit war die Untersuchung des DNA-schädigenden Potenzials endogener ROS, die aus dem Fremdstoffmetabolismus stammen. Dazu wurden V79-Zellen verwendet, die mit dem humanen Enzym Cytochrom 2E1 (CYP2E1) transfiziert wurden (V79 CYP2E1) sowie Zellen, die ebenfalls durch Transfektion das humane Enzym Cytochromreduktase (auch Oxidoreduktase genannt) überexprimieren (V79 hOR). Beide Enzyme sind zusammen an der Hydroxylierung von Fremdstoffen beteiligt, bei der die Reduktion von molekularem Sauerstoff durch Übertragung von zwei Elektronen notwendig ist. Wird anstatt zweier Elektronen in Folge nur eines auf den Sauerstoff übertragen, so führt dieser von der Substratoxygenierung enkoppelte Vorgang zur Bildung von Superoxid. Daher galt es zu klären, ob das so erzeugte Superoxid und daraus gebildete ROS in der Lage sind, die DNA zu schädigen. Es konnte gezeigt werden, dass die Überexpression von CYP2E1 nicht zu einem erhöhten basalen Gleichgewichtsspiegel oxidativer DNA-Schäden führt und die Metabolisierung von Ethanol durch dieses Enzym ebenfalls keine DNA-Modifikationen verursacht. Die Überexpression der Cytochromreduktase hingegen führte gegenüber dem Wildtyp zu einem erhöhten basalen Gleichgewichtsspiegel oxidativer Basenmodifikationen nach Depletion von Glutathion, einem wichtigen zellulären Antioxidans. Im Mikrokerntest, der gentoxische Ereignisse wie Chromosomenbrüche in Zellen aufzeigt, zeigte sich schon ohne Glutathion-Depletion eine doppelt so hohe Mikrokernrate im Vergleich zum Wildtyp. In weiteren Versuchen wurden die V79-hOR-Zellen mit dem chinoiden Redoxcycler Durochinon inkubiert, um zu untersuchen, ob das vermutlich durch die Reduktase vermittelte Redoxcycling über Generierung von ROS in der Lage ist, einen oxidativen DNA-Schaden und Toxizität zu verursachen. Hier zeigte sich, dass die Überexpression der Reduktase Voraussetzung für Toxizität und den beobachteten DNA-Schaden ist. Die Wildtyp-Zellen zeigten weder einen DNA-Schaden noch Zytotoxizität, auch eine zusätzliche Glutathion-Depletion änderte nichts an dem Befund. Die V79-hOR-Zellen hingegen reagierten auf die Inkubation mit Durochinon mit einer konzentrationsabhängigen Zunahme der Einzelstrangbrüche und oxidativen Basenmodifikationen, wobei sich der DNA-Schaden durch vorherige Glutathion-Depletion verdoppeln ließ.

Untersuchungen zum Mechanismus der zellulären und zellfreien DNA-Schädigung durch photosensibilisierende Arzneistoffe

Einige Arzneistoffe verursachen unter dem Einfluss von Sonnenlichtstrahlung folgenschwere Hautveränderungen. In der Arbeit wurden für sechs Photosensibilisatoren erstmals „Fingerabdrücke“ des zellfreien und zellulären photoinduzierten DNA Schadens in Form von Schadensprofilen erstellt. Untersucht wurden das Phenothiazin Chlorpromazin, sowie dessen Derivate 2-Hydroxypromazin, Chlorpromazinsulfoxid und Promazin; die Fluorchinolone Ciprofloxacin und Lomefloxacin; sowie Doxycyclin und Methylenblau unter Bestrahlung mit künstlich erzeugtem Sonnenlicht. Neben Strangbrüchen in der DNA konnten durch den Einsatz von spezifischen DNA-Reparaturendonukleasen als Sonden die Mengen an oxidativen Purinmodifikationen, oxidative Pyrimidinmodifikationen und abasische Stellen bestimmt werden. Durch Verwendung von modulierenden Zusätzen wurde die Beteiligung von reaktiven Sauerstoffspezies überprüft. Besonders bei den Phenothiazinen zeigten sich Besonderheiten hinsichtlich der DNA-Schädigung. Promazin induziert unter Photoaktivierung, vermutlich über einen reduktiven Angriff an der DNA, eine hohe Anzahl sonst selten beobachteter Läsionen, nämlich abasischen Stellen und Dihydropyrimidine. Photoaktiviertes Chlorpromazin konnte in Zellen unerwarteterweise wahrscheinlich über die Reaktion von Photolyseprodukten mit einem endogenen Chromophor sonnenlichtinduzierte oxidative DNA-Modifikationen verhindern. Eine Schädigung zellfreier DNA fand nur statt, wenn der Photosensibilisator im Überschuss gegenüber den DNA-Basenpaaren vorlag, vermutlich weil ansonsten die Photolyse des Chlorpromazins durch Interkalation in die DNA verhindert wurde. Fluorchinolone zeigten eine starke Generierung von DNA-Strangbrüchen in Zellen, welche möglicherweise auf photoinduzierte Reaktionen der Arzneistoffe mit der eukaryotischen Topoisomerase zurückzuführen ist. Die Korrelation der gemessenen DNA-Schäden mit der Mikrokerninduktion führte zu der Annahme, dass besonders abasische Stellen bei der Entstehung von Mikrokernen eine Rolle spielen könnten.

Generierung und Prozessierung oxidativer DNA-Schäden

Generierung und Prozessierung oxidativer DNA Schäden --- Ziel dieser Arbeit war es, adaptive Antworten der Zellen auf einen DNA Schädigung zu untersuchen. Hierzu wurden Experimente zur Reparatur oxidierter Basen (Substrate der Basen Exzisions Reparatur (BER)) oder von Pyrimidindimeren (Substrate der Nukleotid Exzisions Reparatur (NER)) nach einer Vorbehandlung mit DNA-schädigender Agenzien durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass sowohl eine Vorbehandlung mit einer alkylierenden als auch mit einer oxidierenden Substanz zu einer adaptiven Erhöhung des zellulären Glutathionspiegels führte, die 16 h nach der Schädigung ihr Maximum erreichte. Jedoch waren die 8-oxoG Glykosylaseaktivitäten über einen Zeitraum von 18 h konstant. Diese Effekte waren unabhängig davon, ob Maus Embryofibroblasten, primäre oder p53 profiziente menschliche Zellen verwendet wurden. Die BER war ebenfalls in keiner der verschiedenen Zelllinien signifikant verbessert. Die adaptive Antwort bezüglich der Glutathionspiegel war also nicht mit einer entsprechenden Veränderung bei der DNA-Reparatur verbunden. Folglich ist die Reparatur von oxidativen DNA-Schäden durch eine vorausgehende Schädigung nicht induzierbar. Der zweite Teil der Untersuchungen zu der Reparatur beschäftigte sich mit der NER. Hierzu wurde die Reaktivierung eines mit UVB-Strahlung geschädigten Plasmids untersucht. Als Wirtszellen fungierten primäre menschliche Fibroblasten und Keratinozyten, die entweder mit UVB vorbehandelt oder ungeschädigt waren. Auch für die NER konnte keine signifikante Beschleunigung der Reparatur von Pyrimidindimeren durch eine Vorbehandlung festgestellt werden. Die Reaktivierung erfolgte ferner unabhängig vom p53-Status der Zellen, wie Versuche mit p53-siRNA zeigten. Neben der Prozessierung war die Generierung oxidativer DNA Schäden Gegenstand der Arbeit. Die verwendete Substanz Tirapazamin (TPZ) ist ein für hypoxische Zellen selektives, neues Zytostatikum und befindet sich momentan in Phase 2/3 der klinischen Prüfung. Ziel war es die von TPZ verursachten DNA Modifikationen zu charakterisieren, sowie die Toxizität und Genotoxizität zu untersuchen. Da es Hinweise auf eine Aktivierung von TPZ über eine Oxidoreduktase (OR) gab, wurden die Experimente in Wildtyp und hOR überexprimierenden Zellen durchgeführt. Die Quantifizierung der verursachten DNA-Modifikationen zeigte, dass der von TPZ verursachte Schaden in Zellen mit hOR erhöht war. Das erhaltene Schadensprofil der durch TPZ verursachten DNA-Modifikationen war dem Schadensprofil von durch Gamma-Strahlung intrazellulär verursachten Hydroxylradikalen sehr ähnlich. Da es nach der Aktivierung von TPZ durch eine OR zu einer Abspaltung von Hydroxylradikalen kommt, bestätigte dies den vermuteten Mechanismus. Weitere Untersuchungen mit t-Butanol, einem Hydroxylradikal Fänger, ergaben eine verminderte DNA-Schädigung, was ebenfalls für eine DNA-Schädigung durch Hydroxylradikale spricht. Untersuchungen zur Mutagenität zeigten das die Mutationsrate in Zellen mit hOR um das 4 fache erhöht ist. Erstaunlich war jedoch, dass der im gleichen Ausmaß von Gamma-Strahlung verursachte DNA-Schaden für die beobachtete Toxizität dieser verantwortlich war, während bei TPZ unter den gleichen Bedingungen keine Toxizität vorlag. Erklärt werden könnte die erhöhte Toxizität und Mutagenität durch so genannte geclusterte DNA-Schäden, die von Gamma-Strahlen, nicht jedoch von TPZ gebildet werden. Nach einer verlängerten Inkubation wurde sowohl für die Toxizität als auch für die Genotoxizität erneut ein verstärkender Effekt durch die OR bestätigt. Überraschend war weiterhin die von der OR unabhängige Generierung von Doppelstrangbrüchen, für die demnach ein grundsätzlich anderer Mechanismus, wie zum Beispiel eine direkte Interaktion mit der Topoisomerase II, angenommen werden muss.

Nachweis von DNA-Doppelstrangbrüchen über gamma-H2AX: Immunhistochemie nach Einwirkung gentoxischer Agenzien auf Säugerzellen

Wie im Rahmen dieser Arbeit bestätigt werden konnte, eignet sich die Quantifizierung von γ-H2AX-Foci mittels Immunfluoreszenz zur Quantifizierung von DNA-Doppelstrangbrüchen, welche durch ionisierende Strahlung erzeugt werden. Dabei erzeugt ein Gy Strahlung der verwendeten 60Co-Quelle 33,8 ± 2,1 DNA-Doppelstrangbrüche. Durch UV-Strahlung sowie alkylierende Substanzen wie MMS und MNNG werden in CHO-Zellen γ-H2AX-Foci induziert. Die Anzahl der induzierten γ-H2AX-Foci ist Dosis- und replikationsabhängig. Die im Rahmen dieser Arbeit erhobenen Daten sprechen für eine Phosphorylierung von H2AX an Läsionen, welche die DNA-Replikation beeinträchtigen und insbesondere aktive Replikationsgabeln blockieren. Diese Läsionen können zu DNA-Doppelstrangbrüchen an blockierten Replikationsgabeln führen H2AX wird in der unmittelbaren Umgebung von DNA-Doppelstrangbrüchen zu γ-H2AX phosphoryliert und eignet sich damit zur Quantifizierung dieser Läsionen. Ob γ-H2AX ausschließlich an DNA-Doppelstrangbrüchen phosphoryliert wird, oder auch an anderen Läsionen ist in der Literatur umstritten. Die bis dato publizierte Literatur geht mehrheitlich davon aus, dass γ-H2AX einen ausschließlichen Marker von DNA-Doppelstrangbrüchen darstellt (Burma et al., 2001; Fernandez-Capetillo et al., 2004; Foster und Downs, 2005; Furuta et al., 2003; Halicka et al., 2005; Huang et al., 2005; Paull et al., 2000; Redon et al., 2002; Stucki und Jackson, 2006; Takahashi und Ohnishi, 2005; Ward und Chen, 2001). Neuere Arbeiten postulieren jedoch, dass H2AX auch durch andere, bisher nicht genau klassifizierte, Störungen der Chromatinstruktur phosphoryliert wird (Marti et al., 2006; Stojic et al., 2004). Die im Rahmen dieser Arbeit dargestellten Ergebnisse mit UV-Strahlung und den Alkylantien MMS und MNNG lassen sich gut durch die teils direkte, größtenteils jedoch replikationsabhängige Bildung von DNA-Doppelstrangbrüchen an blockierten Replikationsgabeln erklären. Ausschließen lässt sich die Hypothese, dass die beobachteten γ-H2AX-Foci auch aufgrund anderer Läsionen entstehen, auf Grundlage der erhaltenen Daten nicht. Die Quantifizierung von γ-H2AX eignet sich zur Darstellung von durch ionisierende Strahlung, UV-Strahlung sowie Alkylantien erzeugten Effekten. Eine abschließende Klärung, ob durch die hier angewandte Methode selektiv DNA-Doppelstrangbrüche detektiert werden, steht aber weiterhin aus.

Untersuchung der DNA-bindenden Eigenschaften neuer Nukleobasen-gekoppelter Pyrrolcarboxamide, Combilexine und Hetaren[a]carbazol-Derivate: Validierung und Etablierung von in-vitro- und in-silico-Methoden

Da maligne Neoplasien durch Mutationen in Proto-Onko- und/oder Tumorsuppressorgenen ausgelöst werden, stellt die DNA eines der wichtigsten Targets für die Entwicklung neuer Zytostatika dar. Auch bei den im Arbeitskreis Pindur designten und synthetisier-ten Verbindungen der Nukleobasen-gekoppelten Pyrrolcarboxamid-, der Hetaren[a]carbazol- und der Combilexin-Reihe handelt es sich um DNA-Liganden mit potentiell antitumoraktiven Eigenschaf-ten. Die einen dualen Bindemodus aufweisenden Combilexine bestehen aus einem Interkalator (u. a. Naphthalimid, Acridon), der über einen Linker variabler Kettenlänge mit einer rinnenbin-denden, von Netropsin abgeleiteten Bispyrrol-, oder einer bioisosteren Imidazol-, Thiazol- oder Thiophen-pyrrolcarboxamid-struktur verknüpft ist. Das N-terminale Ende der Combilexine wird von einer N,N-Dimethylaminopropyl- oder -ethyl-Seitenkette gebildet. Die DNA-Affinitäten der Liganden wurden mittels Tm-Wert-Messung-en bestimmt. Diese Denaturierungsexperimente wurden sowohl mit poly(dAdT)2- als auch mit Thymus-DNA (~42% GC-Anteil) durchge-führt, um Aussagen zur Stärke und zur Sequenzselektivität der DNA-Bindung machen zu können. Des Weiteren wurden die Bindekon-stanten einiger ausgewählter Vertreter mit Hilfe des Ethidium-bromid-Verdrängungsassays ermittelt; einige Testverbindungen wurden zudem auf potentiell vorhandene, TOPO I-inhibierende Eigenschaften untersucht. Diese biochemischen und biophysika-lischen Tests wurden durch Molecular Modelling-Studien ergänzt, die die Berechnung von molekularen Eigenschaften, die Durch-führung von Konformerenanalysen und die Simulation von DNA-Ligand-Komplexen (Docking) umfassten. Durch Korrelation der in vitro-Befunde mit den in silico-Daten gelang es, vor allem für die Substanzklasse der Combilexine einige richtungweisende Struktur-Wirkungsbeziehungen aufzustellen. So konnte gezeigt werden, dass die Einführung eines Imidazol-Rings in die rinnen-bindende Hetaren-pyrrolcarboxamid-Struktur der Combilexine aufgrund der H-Brücken-Akzeptor-Funktion des sp2-hybridisierten N-Atoms eine Verschiebung der Sequenzselektivität der DNA-Bindung von AT- zu GC-reichen Arealen der DNA bedingt. Zudem erwies sich ein C3-Linker für die Verknüpfung des Naphthalimids mit dem rinnenbindenden Strukturelement als am besten geeignet, während bei den Acridon-Derivaten die Verbindungen mit einem N-terminalen Buttersäure-Linker die höchste DNA-Affinität aufwiesen. Dies ist sehr wahrscheinlich auf die im Vergleich zum Naphthalimid-Molekül geringere y-Achsen-Ausdehnung (bzgl. eines x/y-Koordinatensystems) des Acridons zurückzuführen. Die ermittelten Struktur-Wirkungsbeziehungen können dazu herangezogen werden, das rationale Design neuer DNA-Liganden mit potentiell stärkerer DNA-Bindung zu optimieren.