Charakterisierung verschiedener Reifungsstadien humaner dendritischer Zellen und ihr Einfluss auf die T-Zelldifferenzierung

Diese Zusammenfassung der kumulativen Habilitationsschrift bezieht sich auf folgende Originalarbeiten:

The role of Interleukin-12 in liver inflammation

Chronic liver inflammation during viral hepatitis is a major health problem worldwide. The role of proinflammatory cytokines, like IL-12, in breaking hepatic immune tolerance, and inducing acute liver inflammation and virus clearance is not clear. Nor is clear its role in uncontrolled severe inflammatory response, leading to fulminant hepatitis and hepatic failure. This work, focused in the study of the role of endogenous produced IL-12 in inducing hepatic inflammatory responses, demonstrates: In vitro, using adenovirus coding for IL-12, that hepatocytes stimulate CD4+ T cells in a tolerogenic manner, and that endogenous IL-12 is able to switch the immune response into Th1; and in vivo, that endogenous IL-12 induces hepatocyte damage and virus elimination in mice infected with adenovirus. In addition, and in order to study in vivo the relevance of IL-12 in acute inflammation, conditional IL-12 transgenic mice expressing IL-12 in the liver after cre-recombinase mediated induction were generated. For this purpose, an IL-12 fusion protein was created, which demonstrated high levels of bioactivity. Induction of IL-12 expression during embryonic development was achieved by crossbreeding with Act-Cre transgenic mice; induction of IL-12 expression in adult mice was achieved by a plasmid coding for the cre-recombinase. This study demonstrates that after induction, IL-12 is expressed in the liver of the transgenic mice. It also demonstrates that hepatic expression of IL-12 induces splenomegaly and liver inflammation, characterized by large infiltrations in portal tracts and veins, associated with hepatic damage, necrosis areas and lethality. Furthermore, constitutive hepatic IL-12 expression does not lead to abortion, but to total lethality, short after delivery. In conclusion, in this study, a transgenic mouse model has been generated, in which the expression of active IL-12 in the liver can be induced at any time; this model will be very helpful for studying hepatic pathologies. This study has also demonstrated that hepatic produced IL-12 is able of breaking liver tolerance inducing inflammation, virus elimination, severe hepatocyte damage, and lethality. These findings suggest IL-12 as a key cytokine in acute liver inflammation and fulminant hepatic failure. 5.1 Future studies Once the importance of IL-12 in inducing hepatic inflammation and virus elimination was demonstrated in this study, understanding the mechanisms of the IL-12 induced liver damage, and more important, how to avoid it will be the main focus in the future. It is very important to achieve hepatic inflammation for a more effective and faster viral elimination, but avoiding the toxicity of IL-12, which leads to massive liver injury and lethality is obviously necessary to allow IL-12 as therapy. For that purpose, future studies will be mainly base on three different points: 1. The determination of different cell populations present in the hepatic infiltration, which of them are responsible for liver injury, and as well their state of activation. 2. The measure of other pro- and anti-inflammatory cytokines and chemokines, which can play a role in IL-12-induced liver inflammation and hepatocyte damage. For these purposes, specific blocking antibodies (anti TNF-alpha, anti IL-12, anti IFN-g) will be used. The study with different transgenic mice: TNF-alpha Receptor knockout, TGF-b, will also help in determining the role of those cytokines during IL-12-induced liver damage and lethality. 3. The establishing of liver pathology models (viral infection, tumours, auto-antigens) in mice. Induction of IL-12 at any time of the pathology development will help in clarifying the role of IL-12 in those models. Finally, the transgenic mice expressing IL-23 in the liver will be generated.

Entwicklung und Anwendung molekularbiologischer Methoden zur Art- und Stamm-Identifizierung pro- und eukaryotischer Organismen

Das Wachstum von Milchsäurebakterien-Arten der Gattungen Lactobacillus, Pediococcus und Leuconostoc während der Weinfermentation kann durch die Bildung verschiedener Stoffwechselprodukte zu Weinfehlern führen. Um rechtzeitig Gegenmaßnahmen ergreifen zu können und einem Weinverderb vorzubeugen, bedarf es geeigneter Identifizierungsmethoden. Klassische mikrobiologische Methoden reichen oft nicht aus, um Mikroorganismen auf Art- und Stammniveau gezielt zu identifizieren. Wegen ihrer schnellen Durchführbarkeit und Zuverlässigkeit sind molekularbiologische Identifizierungsmethoden zur Kontrolle der mikrobiellen Flora während der Lebensmittelfermentierung in der heutigen Zeit unabdingbar. In der vorliegenden Forschungsarbeit wurden die 23S rRNA-Gensequenzen von neun Pediococcus-Typstämmen sequenziert, analysiert und phylogenetische Analysen durchgeführt. Zur Art-Identifizierung der Pediokokken wurden PCR-Primer generiert und ein Multiplex PCR System entwickelt, mit dem alle typischen Arten simultan in einer Reaktion nachgewiesen werden konnten. Die Ergebnisse der Multiplex PCR-Identifizierung von 62 Pediococcus-Stämmen aus Kulturensammlungen und 47 neu isolierten Stämmen aus Wein zeigten, dass einige Stämme unter falschen Artnamen hinterlegt waren, und dass P. parvulus im Weinanbaugebiet Rheinhessen weit verbreitet war. Die Fähigkeit der Pediococcus-Stämme zur Exopolysaccharid-Synthese wurde durch den Nachweis zweier Gene überprüft. Auf Basis der 23S rDNA-Sequenzen wurden rRNA-Sekundärstrukturen mit der neu entwickelten Software Structure Star generiert, die zum Auffinden von Zielbereichen für fluoreszenzmarkierte DNA-Sonden geeignet waren. Die Sequenzunterschiede zwischen den Pediococcus-Arten reichten aus, um zwei Gruppen durch Fluoreszenz in situ Hybridisierung differenzieren zu können. Die Verwendung unmarkierter Helfer-sonden verbesserte die Zugänglichkeit der Sonden an die rRNA, wodurch das Fluoreszenz-Signal verstärkt wurde. Um Milchsäurebakterien durch Denaturierende Gradienten Gel Elektrophorese differenzieren zu können, wurden Primer entwickelt, mit denen ein hochvariabler 23S rDNA-Bereich amplifiziert werden konnte. Die Nested Specifically Amplified Polymorphic DNA (nSAPD)-PCR wurde in der vorliegenden Arbeit zur Art- und Stamm-Differenzierung pro- und eukaryotischer Organismen angewandt. Es wurden vor allem weinrelevante Milchsäurebakterien der Gattungen Oenococcus, Lactobacillus, Pediococcus und Leuconostoc und Hefen der Gattungen Dekkera / Brettanomyces und Saccharomyces untersucht. Die Cluster-Analyse der Pediococcus-Typstämme führte zu einer unterschiedlichen Baum-Topologie im Vergleich zum phylogenetischen 23S rDNA-Stammbaum. Die Verwandtschaftsverhältnisse der untersuchten O. oeni-Stämme aus Starterkulturen konnten in Bezug auf eine frühere Cluster-Analyse reproduziert werden. Die Untersuchung von 40 B. bruxellensis-Stämmen aus rheinhessischen Weinproben zeigte eine Gruppierung der Stämme gemäß dem Ort der Probennahme. Beim Vergleich der Verwandtschaftsverhältnisse von Stämmen der Arten P. parvulus und B. bruxellensis, die aus denselben Weinproben isoliert wurden, konnte eine hohe Übereinstimmung der beiden Baum-Topologien beobachtet werden. Anhand der SAPD-PCR Untersuchung von Sekthefen aus Starterkulturen konnten alle Stämme der Art S. cerevisiae zugeordnet werden. Die nSAPD-PCR war darüber hinaus geeignet, um höhere Eukaryoten wie Weinreben zu differenzieren und es konnten die Verwandtschaftsverhältnisse von Mäusen und menschlichen Individuen durch Cluster-Analysen nachvollzogen werden. Mit Hilfe der Sequence Characterized Amplified Region (SCAR)-Technik wurden (n)SAPD-Marker in SCAR-Marker konvertiert. Die neu generierten SCAR-Primer konnten zur simultanen Art-Identifizierung von sieben weinschädlichen Milchsäurebakterien in einer Multiplex PCR erfolgreich eingesetzt werden. Die in dieser Arbeit entwickelten molekularbiologischen Identifizierungsmethoden können zum Beispiel in der mikrobiologischen Qualitätskontrolle Anwendung finden.

Gen knockdown der Metalloproteasen Meprin alpha 1, alpha 2 und beta im Zebrabärbling Danio rerio

Die Metalloproteasen Meprin α und β übernehmen Schlüsselfunktionen in vielen (patho-) physiologischenrnProzessen. So sind sie beteiligt an der Umstrukturierung der extrazellulären Matrix, an immunologischenrnReaktionen oder an entzündlichen Gewebserkrankungen. Die beiden Enzyme kommenrnhauptsächlich in den Bürstensaummembranen von Niere und Darm sowie in der Haut von Vertebratenrnvor. Für die Erforschung der biologischen Aktivität der Meprine wurde in dieser Arbeit der ModellorganismusrnDanio rerio verwendet, der vor allem durch die Möglichkeit der gentechnischen Manipulationrnprädestiniert ist. Im Fisch konnten drei homologe Enzyme (Meprin α1, α2 und β) nachgewiesenrnwerden. Während mRNA-Analysen eine nahezu ubiquitäre Verteilung der Meprine offenbarten,rnkonnte ich mittels spezifischer Antikörper die Expression auf Proteinebene nachweisen. WährendrnMeprin α1 und β verstärkt im Darmepithel und in der Epidermis lokalisiert sind, konnte Meprinrnα2 ausschließlich in der Lamina propria des Darms identifiziert werden.rnDer Hauptteil der vorliegenden Arbeit zielt auf die spezifische Reduzierung des Expressionslevels derrnMeprine in Embryonen des Zebrabärblings. Dies wurde durch die Mikroinjektion von sogenanntenrnMorpholinos in die Zygote erzielt. Morpholinos sind RNA-Moleküle, die spezifisch an die mRNA desrnZielproteins binden können und die Translation verhindern. Die auftretenden Effekte durch das Fehlenrnder Meprine lassen so Rückschlüsse auf ihre physiologische Funktion zu. Nach der Injektion vonrnMorpholinos gegen Meprin α1 zeigten sich lediglich leichte epidermale Deformationen. Bei Meprin βrnhingegen kam es zu einer massiven Fehlbildung von Organen im Rumpf- und Schwanzbereich. Diesesrnführte zu erheblichen Defekten; die Embryonen starben innerhalb der ersten 24 Stunden nach derrnBefruchtung. Demzufolge müssen Meprin α1 und Meprin β insbesondere an der Gewebsdifferenzierungrnbeteiligt sein. Dies korreliert mit verschiedenen Experimenten, u.a. an knockout Mäusen, ausrndenen hervorgeht, dass die Prozessierung und Aktivierung der Cytokine Interleukin-1β oder Interleukin-rn18 durch Meprin β erfolgen kann.rnDie Injektion von Meprin α2-Morpholinos erbrachte ein weiteres, eindrucksvolles Ergebnis: Das Blutgefäßsystemrnvon injizierten Embryonen war vollständig unterbrochen und es sammelten sich Erythrozytenrnim Bereich der Caudalvene an. Diese Phänotypen gleichen den knockdown-Experimenten mitrndem vascular endothelial growth factor VEGF-A, dem entscheidenden Wachstumsfaktor in der Angiogenesern(Blutgefäßbildung). Eine Inkubation des humanen VEGF-A mit (humanem) rekombinantemrnMeprin α bzw. β führte zu einer differenzierten Prozessierung des Moleküls. Diese Ergebnisse legenrnnahe, dass Meprin α pro-angiogenetisch wirkt, indem es VEGF-A prozessiert und damit die Gefäßbildungrnaktiviert. Aus den Daten dieser Arbeit wird die hohe Signifikanz der Meprine für die Proliferationrnund Differenzierung spezieller Gewebe deutlich, welche somit eine wichtige Grundlage für Studienrnan höheren Vertebraten darstellt.

Analyse des anti-inflammatorischen Pilzmetaboliten S-Curvularin in verschiedenen Modellen der rheumatoiden Arthritis

An der Entwicklung und Aufrechterhaltung chronisch-inflammatorischer Erkrankungen wie der rheumatoiden Arthritis (RA) ist die Fehlregulation verschiedener pro-inflammatorischer Gene von entscheidender Bedeutung. Bei der RA führt unter anderem eine erhöhte Expression der induzierbaren NO-Synthase (iNOS) zu einer gesteigerten NO-Produktion, was schließlich zum Knochenabbau beiträgt. Für eine Therapie der RA werden häufig Glukokortikoide eingesetzt, die jedoch viele Nebenwirkungen zeigen. Um eine mögliche Therapiealternative zu identifizieren, sollten die Effekte des anti-inflammatorisch wirksamen Pilzmetaboliten S-Curvularin in verschiedenen Modellen der RA analysiert werden.rnIn humanen C-28/I2-Chondrozyten als in vitro-Modell der RA führte die Inkubation mit einem Zytokingemisch zu einer Induktion der iNOS-Expression, die vom chondrogenen Differenzierungsgrad der Zellen abhängig war. Entscheidend für die iNOS-Induktion in C-28/I2-Zellen ist hauptsächlich der p38-MAPK-, der JAK-STAT- und der NF-kappa B-Signaltransduktionsweg. Eine Inkubation der Zellen mit S-Curvularin führte zu einer deutlichen Hemmung der iNOS-Expression. Dexamethason hatte hingegen keinen Effekt auf die iNOS-Expression, was vermutlich auf die fehlende Expression der Glukokortikoidrezeptor-mRNA zurückgeführt werden kann. Daher können von S-Curvularin abgeleitete Pharmaka möglicherweise auch in Fällen einer Steroidresistenz zur Therapie von RA-Patienten zum Einsatz kommen.rnIm Tiermodell der Kollagen-induzierten Arthritis konnte die anti-inflammatorische Wirkung von S-Curvularin auf mehreren Ebenen bestätigt werden. Die Pilzsubstanz reduzierte sowohl die Schwellung der Pfoten als auch die Expression CII-induzierter pro-inflammatorischer Gene, wie z.B. S100A8, Defb6, Camp und Mpo. Dabei waren die Effekte von S-Curvularin meist deutlicher als in Dexamethason-behandelten Mäusen. Die Analyse von Zytokinen (z.B. TNF-alpha, IL-1beta) und Chemokinen (z.B. MCP-1, MIP-1alpha) zeigte, dass die CII-induzierte Expression dieser pro-inflammatorischen Mediatoren in den Pfoten der Mäuse durch eine Therapie mit S-Curvularin und Dexamethason wieder reduziert werden konnte, wobei Unterschiede zwischen den Behandlungen beobachtet werden konnte.rnAuch im Tiermodell der LPS-induzierten akuten Entzündung wurde die iNOS- und die S100A8-Expression in verschiedenen Geweben S-Curvularin reduziert. rnrnS-Curvularin ist also in der Lage, in verschiedenen Modellen der RA und im akuten Entzündungsmodell die pro-inflammatorische Genexpression effizient zu hemmen und könnte somit in Zukunft eine Rolle in der Therapie der RA einnehmen.rn

LPS-induced modifications in spontaneous network activity causes neuronal apoptosis in neonatal cerebral cortex

During the perinatal period the developing brain is most vulnerable to inflammation. Prenatal infection or exposure to inflammatory factors can have a profound impact on fetal neurodevelopment with long-term neurological deficits, such as cognitive impairment, learning deficits, perinatal brain damage and cerebral palsy. Inflammation in the brain is characterized by activation of resident immune cells, especially microglia and astrocytes whose activation is associated with a variety of neurodegenerative disorders like Alzheimer´s disease and Multiple sclerosis. These cell types express, release and respond to pro-inflammatory mediators such as cytokines, which are critically involved in the immune response to infection. It has been demonstrated recently that cytokines also directly influence neuronal function. Glial cells are capable of releaseing the pro-inflammatory cytokines MIP-2, which is involved in cell death, and tumor necrosis factor alpha (TNFalpha), which enhances excitatory synaptic function by increasing the surface expression of AMPA receptors. Thus constitutively released TNFalpha homeostatically regulates the balance between neuronal excitation and inhibition in an activity-dependent manner. Since TNFalpha is also involved in neuronal cell death, the interplay between neuronal activity MIP-2 and TNFalpha may control the process of cell death and cell survival in developing neuronal networks. An increasing body of evidence suggests that neuronal activity is important in the regulation of neuronal survival during early development, e.g. programmed cell death (apoptosis) is augmented when neuronal activity is blocked. In our study we were interested on the impact of inflammation on neuronal activity and cell survival during early cortical development. To address this question, we investigated the impact of inflammation on neuronal activity and cell survival during early cortical development in vivo and in vitro. Inflammation was experimentally induced by application of the endotoxin lipopolysaccharide (LPS), which initiates a rapid and well-characterized immune response. I studied the consequences of inflammation on spontaneous neuronal network activity and cell death by combining electrophysiological recordings with multi-electrode arrays and quantitative analyses of apoptosis. In addition, I used a cytokine array and antibodies directed against specific cytokines allowing the identification of the pro-inflammatory factors, which are critically involved in these processes. In this study I demonstrated a direct link between inflammation-induced modifications in neuronal network activity and the control of cell survival in a developing neuronal network for the first time. Our in vivo and in vitro recordings showed a fast LPS-induced reduction in occurrence of spontaneous oscillatory activity. It is indicated that LPS-induced inflammation causes fast release of proinflammatory factors which modify neuronal network activity. My experiments with specific antibodies demonstrate that TNFalpha and to a lesser extent MIP-2 seem to be the key mediators causing activity-dependent neuronal cell death in developing brain. These data may be of important clinical relevance, since spontaneous synchronized activity is also a hallmark of the developing human brain and inflammation-induced alterations in this early network activity may have a critical impact on the survival of immature neurons.

Das Interleukin-1Beta-Rezeptor-Homolog im Modifizierten Vakziniavirus Ankara (MVA) - Charakterisierung und möglicher Einfluss auf MVA-basierte Impfvektoren

MVA ist ein attenuiertes Vakziniavirus, das durch wiederholte Passagierung von Chorioallantoisvirus Ankara auf Hühnerembryofibroblasten gewonnen wurde. Es ist bis auf wenige Ausnahmen nicht mehr in der Lage, in Säugerzellen zu replizieren, zeigt aber dennoch eine vollständige virale Proteinexpression und induziert nach Immunisierung eine zu VACV vergleichbare Immunantwort. Aus diesem Grund wurde es bereits als Impfstoff gegen die menschliche Pockenerkrankung eingesetzt, ohne hierbei die bei den klassischen Impfviren beobachtbaren Nebenwirkungen hervorzurufen. Das Genom von MVA enthält jedoch noch Immunmodulatoren, deren Deletion Ansatzpunkt für die weitere Verbesserung des Impfstoffes sein kann. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde eine Deletionsmutante untersucht, bei der das Gen für den Interleukin-1β Rezeptor (IL-1βR) deletiert ist (MVA ΔIL-1βR). Es konnte nachgewiesen werden, dass der IL-1βR in murinen als auch in humanen Zellen exprimiertes IL-1β bindet und somit inaktiviert. Des Weiteren wurde gefunden, dass MVA in der Lage ist, IL-1β in antigenpräsentierenden Zellen zu induzieren, welches aber durch die Neutralisierung aufgrund des IL-1βR nur transient nachzuweisen war. Im Gegensatz dazu induzierte MVA ΔIL-1βR eine anhaltende und um ein Vielfaches erhöhte Sekretion an IL-1β. Untersuchungen in antigenpräsentierenden Zellen aus knock-out Mäusen, die verschiedene Defizienzen in den Signalwegen zur IL-1β-Induktion trugen, zeigten, dass die Sekretion von IL-1β von Caspase-1 abhängig war, welches wahrscheinlich aus der vorgeschalteten Aktivierung der NLRP3- und/oder AIM2-Inflammasomen resultierte. Interessanterweise wurden auch Caspase-1 unabhängige Mechanismen beobachtet, die auf eine Inflammasom-unabhängige IL-1β-Induktion hinweisen könnten. In Bezug auf die Immunaktivierung führte die vermehrte Sekretion von IL-1β durch MVA ΔIL-1βR vermutlich zu einer verbesserten Antigenpräsentation, die die nachfolgende T-Zellantwort beeinflusste. In Übereinstimmung mit bereits veröffentlichten Daten wurde nach Immunisierung mit MVA ΔIL-1βR eine effektivere Gedächtnis-T-Zellantwort festgestellt, deren Charakteristika und zu Grunde liegenden Mechanismen hier untersucht wurden. Jedoch konnten weder Unterschiede in weiteren pro-inflammatorischen Zytokinmustern noch im Verlauf insbesondere der CD8+ T-Zell-Aktivierung und -erhaltung zwischen MVA und MVA ΔIL-1βR beobachtet werden. Als mögliche weitere Ursache für die veränderte Gedächtnis-T-Zellantwort könnte daher eine vermehrte Stimulation durch antigenpräsentierende Zellen und eine IL-21-vermittelte bessere Unterstützungsfunktion der CD8+ Gedächtnis-T-Zellen durch CD4+ T-Zellen in Frage kommen. Zusammenfassend konnten hier neue molekulare Mechanismen, die zur Induktion von IL-1β nach einer MVA-Infektion führen, aufgedeckt werden. Darüber hinaus existieren bereits erste Hinweise auf einen Vorteil der Deletion des IL-1βR für MVA-basierte Vektorimpfstoffe. Die vorliegende Arbeit hat weitere Daten erhoben, die das Erzielen verbesserter Immunantworten nach Immunisierung mit MVA ΔIL-1βR unterstützen, woraus sich neue Ansätze für die Entwicklung MVA-basierter Impfstoffe ergeben könnten.

Die Bedeutung von KSRP für die pro-inflammatorische Genexpression in Autoimmunerkrankungen - Einfluss des Naturstoffes Resveratrol auf KSRP-vermittelte Regulationsmechanismen

Die Pathogenese chronisch inflammatorischer Erkrankungen ist von einer Dysregulation der pro-inflammatorischen Genexpression geprägt. Dieser liegen wahrscheinlich pathologische Veränderungen der Aktivität von verschiedenen Transkriptionsfaktoren und RNA-bindenden Proteinen zugrunde. In dieser Arbeit konnte die Regulation der KSRP-Expression in einem murinen Modell der rheumatoiden Arthritis (RA) nachgewiesen werden. In humanen Chondrozyten führte eine erhöhte KSRP-Expression zu einer Reduktion der Expression von bekannten KSRP-Zielgenen. Der Vergleich von verschiedenden Microarray-Analysen aus den verwendeten humanen und murinen Modellen der RA führte zur Identifikation von pro-inflammatorischen und pro-angiogenetischen Faktoren (SPARC, MMP2, MMP3, PLA2G2D, GZMA, HPSE, TNMD und IL-18-R), die in der RA eine Rolle spielen und höchstwahrscheinlich durch eine erhöhte KSRP-Expression reguliert werden. Daher könnte eine Modulation der KSRP-Expression bei der Therapie von Autoimmunerkrankungen von Bedeutung sein. In diesem Zusammenhang ist die Detektion der Bindung des cardioprotektiven und anti-inflammatorisch wirkenden Naturstoffs Resveratrol an KSRP zu nennen. Diese spezifische Interaktion führte zu einer Reduktion der p38-MAPK-vermittelten Thr-Phosphorylierung des KSRP-Proteins (in situ und in vivo), was eine Aktivierung der KSRP-vermittelten Mechanismen zur Folge hatte. Somit konnte in situ die mRNA-Stabilität der iNOS reduziert und die miR-155-Expression erhöht werden. Im murinen Atherosklerosemodell führte die Behandlung mit Resveratrol zu einer verringerten Expression bekannter KSRP-Ziel-mRNAs. rnNeben diesem post-translationalen Regulationsmechanismus von KSRP durch Resveratrol konnte die Modulation der KSRP-Expression auf transkriptioneller Ebene durch KSRP selbst gezeigt werden. Dies geschieht möglicherweise über die Bindung von KSRP an das FUSE-analoge Element innerhalb des KSRP-Promotors, welches eine positive Autoregulation der KSRP-Expression bewirkt. Bei der Analyse der post-transkriptionellen Regulation der KSRP-Expression interagierten die mRNA-bindenden Proteine HuR, PABP und die AUF-1-Isoformen p40, p42 und p45 in vitro mit der KSRP-3’UTR. Dabei konnte in Expressionsanalysen nachgewiesen werden, dass die KSRP-mRNA durch PABP positiv und durch p42 negativ reguliert wird.rnZusammenfassend ist zu sagen, dass die KSRP-Expression neben post-translationalen Mechanismen auch auf transkriptioneller und post-transkriptioneller Ebene moduliert wird. Zusätzlich wurde eine Regulation der KSRP-Expression innerhalb entzündlicher Erkrankungen nachgewiesen, die Bedeutung dieser Modulation für die pro-inflammatorischen Genexpression diskutiert und ein möglicher therapeutischer Angriffspunkt durch Resveratrol identifiziert.

Induktion von Pro-Autophagie-Signalen durch einen extra- oder intrazellulären Alpha-Toxin-Angriff

Autophagie ist ein konservierter, kataboler Mechanismus in allen eukaryoten Zellen. Unter anderem wird ihm eine wichtige Rolle als zellautonomer Abwehrmechanismus gegen Mikroorganismen zugeschrieben; von manchen Infektionserregern wird er jedoch unterlaufen oder sogar genutzt. Der stärkste Auslöser der Autophagie ist ein Mangel an Nährstoffen, insbesondere Aminosäuren. Über die Deaktivierung der Kinase mTORC1 und die Phosphorylierung des eukaryoten Translationsinitiationsfaktors eIF2α hemmt die Nährstoffknappheit die Proteinbiosynthese und aktiviert gleichzeitig Autophagie. Wie Mikroorganismen, insbesondere Bakterien, Autophagie auslösen oder manipulieren, ist derzeit Gegenstand intensiver Forschung. Modifikationen an Mikroben oder Phagosomen und Adapterproteine, die diese Veränderungen und Komponenten des Autophagieapparates erkennen, scheinen jedenfalls bei der selektiven Erkennung durch die Autophagie-Maschinerie wichtig zu sein. rnIn der vorliegenden Dissertationsarbeit wird die Rolle des membranporenbildenden α-Toxins von Staphylococcus aureus für die Induktion von Autophagie beleuchtet. Zum einen erwies sich die Akkumulation von (EGFP)-LC3(II), einem Marker der Autophagosomen, um intrazelluläre S. aureus als abhängig von α-Toxin. Zweitens, genügt extrazellulär appliziertes α-Toxin um (EGFP)-LC3(II)-positive Endosomen zu induzieren. Während der Angriff aus dem extrazellulären Raum jedoch binnen kurzer Zeit eine fokale Kumulation von phosphoryliertem eIF2α an der Plasmamembran induziert, die an der Internalisierung des Toxins beteiligt ist, findet sich am phagosomalen Kompartiment keine Toxin-abhängige Anhäufung von p-eIF2α oder proximalen Autophagieregulatoren. Dies impliziert, dass Toxin-Angriff auf die Plasmamembran, nicht aber auf das Phagosom, zu einer Reaktion führt, wie sie bei massivem Nährstoffmangel zu beobachten ist. Obwohl keine α-Toxin-abhängige Kumulation von p-eIF2α bei einem Angriff aus dem Phagosom erfolgt, findet sich um α-Toxin-produzierende Bakterien eine massive Kumulation von LC3 und Adapterprotein p62/Sequestosome1. Dies deutet daraufhin, dass der Ort des Angriffs - Plasmamembran oder Phagosom – für den Autophagie-induzierenden Mechanismus wichtig sein könnte. Der unterschiedliche Effekt auf die zellulären Ionenkonzentrationen, den ein Angriff auf die Plasmamembran oder auf ein Phagosom auslösen würde, bietet hierfür eine mögliche Erklärung. Die Aktivierung der Autophagie über Adapterproteine könnte dann als back-up Mechanismus fungieren, der auch dann greift, wenn eine Invasion ohne Schädigung der Plasmamembran erfolgt. Ein cross-talk der beiden Induktionswege ist angesichts der Bedeutung von p62 für die selektive und die Hunger-assoziierte Autophagie gut möglich; sezerniertes Toxin könnte durch die Aktivierung der basalen Autophagie Adapter-basierte Mechanismen verstärken.

Pharmakologische Hemmung strahleninduzierter Tumorzell-Endothelzell-Interaktionen in vitro und Metastasierungsprozesse in vivo

Exposition von Endothelzellen mit ionisierender Strahlung (IR) oder Behandlung mit inflammatorischen Zytokinen (z. B. TNFa) induziert über eine Rho-GTPasen abhängige NF-kB-Aktivierung die Expression verschiedener Zelladhäsionsmoleküle, u. a. auch von E-Selektin. E-Selektin vermittelt die Adhäsion von Tumorzellen (TC) an Endothelzellen und ist daher vermutlich an der Extravasation von zirkulierenden Tumorzellen beteiligt. HMG-CoA-Reduktase-Inhibitoren (Statine), welche eine breite klinische Anwendung als Lipidsenker erfahren, sind in der Lage, Rho-GTPasen und die durch sie vermittelten Signalwege zu hemmen. Daher sollten Statine wie Lovastatin auch Zell-Zell-Adhäsionsvorgänge beeinflussen. Die vorliegende Arbeit widmet sich den Mechanismen, mit denen IR und TNF in Endothel- und/oder Tumorzellen pro-adhäsive Faktoren induzieren können und ob diese Effekte durch Lovastatin beeinflussbar sind. Zu diesem Zweck wurde mittels eines ELISA-basierenden Zelladhäsions-Assays die Auswirkung von IR und TNF auf Zell-Zell-Kontakte zwischen humanen Tumorzellen (u. a. Kolonkarzinomzellen (HT29)) und humanen, venösen Nabelschnurendothelzellen (HUVEC) analysiert. Zudem wurden die Effekte einer Lovastatinvorbehandlung von TC und/oder HUVEC auf TC-HUVEC-Adhäsion untersucht. Des Weiteren wurden die Wirkungen des sLex-Mimetikums Glycyrrhizin und des Rac1-spezifischen „small-molecule“ Inhibitors NSC23766 auf TC-HUVEC-Adhäsion überprüft. Zusätzlich wurde die strahleninduzierbare mRNA-Expression von diversen Zelladhäsionsmolekülen, Metastasierungsfaktoren und DNA-Reparatur-Genen mittels qRT-PCR (Real-Time Analysen) quantitativ erfasst. Um die erhaltenen in vitro Ergebnisse auch in vivo zu bestätigen, untersuchten wir den Effekt einer Ganzkörperbestrahlung (TBI) von BALB/c-Mäusen auf die Expression von pro-adhäsiven Faktoren. Zur Analyse der Tumorzell-Extravasation wurden Tumorzellen in die laterale Schwanzvene immundefizienter Mäuse injiziert und anschließend eine Ganzkörperbestrahlung durchgeführt (4 Gy). Nach einer Wartezeit von 4 Wochen wurde ein erhöhtes Auftreten von Lungenmetastasen beobachtet, welches durch Vorbehandlung der Tiere mit Statinen, NSC23766 oder Glycyrrhizin blockiert werden konnte. Zusammenfassend konnte somit ein Einfluss von IR auf die Expression verschiedener Zelladhäsionsmoleküle in vitro und auf die Extravasation zirkulierender Tumorzellen in vivo festgestellt werden. Diese pro-metastatischen Strahleneffekte konnten durch pharmakologische Hemmung Rho-regulierter Signalwege abgeschwächt werden.

Einfluss subviraler Partikel des humanen Cytomegalovirus auf die Induktion der antiviralen Immunantwort

Das humane Cytomegalovirus (HCMV) ist ein opportunistischer Krankheitserreger, der insbesondere bei Patienten mit unreifem oder geschwächtem Immunsystem schwere, teilweise lebensbedrohliche Erkrankungen verursacht. Aufgrund der klinischen Relevanz wird die Entwicklung einer Impfung gegen HCMV mit großem Nachdruck verfolgt. Subvirale Partikel des HCMV, sogenannte Dense Bodies (DB), stellen eine vielversprechende Impfstoff-Grundlage dar. Die innere Struktur der Partikel besteht aus viralen Proteinen, die als dominante Antigene der zellulären Immunantwort gegen HCMV identifiziert wurden. Die äußere Hülle der Partikel entspricht der Virushülle, sie enthält die viralen Oberflächenproteine als Zielantigene der neutralisierenden Antikörper (NTAk)-Antwort in ihrer natürlichen Konformation. Die für ein Totantigen außergewöhnlich hohe Immunogenität der Partikel wurde bereits in Vorarbeiten dokumentiert. Ein Ziel dieser Arbeit war es, den molekularen Hintergrund für die herausragenden, immunogenen Eigenschaften von DB aufzuklären. Im ersten Teil der Arbeit wurde daher die Hypothese geprüft, dass DB geeignet sind, die Ausreifung und Aktivierung von dendritischen Zellen (DC) zu vermitteln und damit deren Fähigkeit zur Antigenpräsentation zu stimulieren. Derart aktivierten DC kommt eine wichtige Rolle beim Priming der T-lymphozytären Immunantwort zu. In der Tat konnte gezeigt werden, dass die Behandlung von unreifen dendritischen Zellen (iDC) mit DB zu verstärkter Expression von solchen Molekülen auf der DC-Oberfläche führt, die mit Ausreifung der Zellen verknüpft sind. Der Nachweis der verstärkten Freisetzung proinflammatorischer Zytokine belegte die Aktivierung der Zellen im Sinne einer entzündlichen Reaktion. Die erfolgreiche Stimulation von CD4 und CD8 T-Lymphozyten durch DB-behandelte DC belegte schließlich die funktionelle Relevanz der Ergebnisse. Zusammengefasst konnten in diesem Abschnitt der Arbeit die molekularen Grundlagen der adjuvanten Wirkung von DB aufgeklärt werden. rnIn einem zweiten Abschnitt wurde die NTAk-Antwort nach DB-Immunisierung näher untersucht. Der humoralen Immunantwort kommt eine entscheidende Bedeutung bei der Prävention der HCMV-Übertragung zu. Hier galt es zu prüfen, welchen Einfluss stammspezifische Unterschiede in der Expression viraler Oberflächenproteine auf die Induktion der NTAk-Antwort nach DB-Immunisierung nehmen. Im Fokus stand dabei die variable Expression des pentameren Proteinkomplexes aus den viralen Proteinen gH/gL/pUL128-UL131A. Dieser Komplex wird nur von kliniknahen HCMV-Stämmen (HCMVKlin) exprimiert und ist für deren breiten Zelltropismus verantwortlich. Der pentamere Komplex fehlte in allen bisherigen Analysen der DB-Immunogenität, die auf der Grundlage von Laborstämmen des HCMV (HCMVLab) durchgeführt worden waren. Ein erster Versuchsansatz zeigte, dass die NTAk-Antwort, die durch DB von HCMVLab (DBLab) induziert wird, auch gegen die Infektion mit HCMVKlin einen gewissen Schutz vermittelt. Dies war ein überraschender Befund, da Antikörpern gegen den pentameren Komplex eine entscheidende Rolle bei der Neutralisation von HCMVKlin zugeschrieben wurde. Die Ergebnisse zeigten jedoch, dass Antikörper gegen andere Zielstrukturen zur Neutralisation von HCMVKlin beitragen. Hieraus resultierte unmittelbar die Frage, inwieweit eine Aufnahme des pentameren Komplexes in einen DB-basierten Impfstoff überhaupt notwendig war. Um dies zu beantworten war es notwendig, DB herzustellen, die den pentameren Komplex enthielten. Hierzu wurde ein HCMVLab durch Mutagenese des 235 kpb Genoms so modifiziert, dass von dem resultierenden Stamm der pentamere Komplex exprimiert wurde. In gereinigten DB dieses Stammes konnten die Komponenten des pentameren Komplexes nachgewiesen werden. Die Seren von Tieren, die mit DB dieses neuen Stammes immunisiert wurden, zeigten in der Tat eine deutlich gesteigerte Kapazität zur Neutralisation von HCMVKlin auf verschiedenen Zielzellen. Diese Ergebnisse unterstreichen schlussendlich, dass die Expression des pentameren Komplexes einen Vorteil bei der Induktion der antiviralen NTAk-Antwort erbringt. Zusammengefasst liefern die Erkenntnisse aus dieser Arbeit einen wichtigen Beitrag zum Verständnis der immunogenen Wirkung von DB. Auf dieser Grundlage war es nunmehr möglich, ein Projekt zur Austestung der DB-Vakzine in einer ersten klinischen Studie zu initiieren.

Tissue engineering strategies for biomaterial-based anticancer drug delivery and enhancement of angiogenesis in tumor-resected bone

Patienten, die an Osteosarkom leiden werden derzeit mit intravenös applizierten krebstherapeutischen Mitteln nach Tumorresektion behandelt, was oftmals mit schweren Nebenwirkungen und einem verzögerten Knochenheilungsprozess einhergeht. Darüber hinaus treten vermehrt Rezidive aufgrund von verbleibenden neoplastischen Zellen an der Tumorresektionsstelle auf. Erfolgreiche Knochenregeneration und die Kontrolle von den im Gewebe verbleibenden Krebszellen stellt eine Herausforderung für das Tissue Engineering nach Knochenverlust durch Tumorentfernung dar. In dieser Hinsicht scheint der Einsatz von Hydroxyapatit als Knochenersatzmaterial in Kombination mit Cyclodextrin als Medikamententräger, vielversprechend. Chemotherapeutika können an Biomaterial gebunden und direkt am Tumorbett über einen längeren Zeitraum freigesetzt werden, um verbliebene neoplastische Zellen zu eliminieren. Lokal applizierte Chemotherapie hat diverse Vorteile, einschließlich der direkten zytotoxischen Auswirkung auf lokale Zellen, sowie die Reduzierung schwerer Nebenwirkungen. Diese Studie wurde durchgeführt, um die Funktionsfähigkeit eines solchen Arzneimittelabgabesystems zu bewerten und um Strategien im Bereich des Tissue Engineerings zu entwickeln, die den Knochenheilungsprozess und im speziellen die Vaskularisierung fördern sollen. Die Ergebnisse zeigen, dass nicht nur Krebszellen von der chemotherapeutischen Behandlung betroffen sind. Primäre Endothelzellen wie zum Beispiel HUVEC zeigten eine hohe Sensibilität Cisplatin und Doxorubicin gegenüber. Beide Medikamente lösten in HUVEC ein tumor-unterdrückendes Signal durch die Hochregulation von p53 und p21 aus. Zudem scheint Hypoxie einen krebstherapeutischen Einfluss zu haben, da die Behandlung sensitiver HUVEC mit Hypoxie die Zellen vor Zytotoxizität schützte. Der chemo-protektive Effekt schien deutlich weniger auf Krebszelllinien zu wirken. Diese Resultate könnten eine mögliche chemotherapeutische Strategie darstellen, um den Effekt eines zielgerichteten Medikamenteneinsatzes auf Krebszellen zu verbessern unter gleichzeitiger Schonung gesunder Zellen. Eine erfolgreiche Integration eines Systems, das Arzneimittel abgibt, kombiniert mit einem Biomaterial zur Stabilisierung und Regeneration, könnte gesunden Endothelzellen die Möglichkeit bieten zu proliferieren und Blutgefäße zu bilden, während verbleibende Krebszellen eliminiert werden. Da der Prozess der Knochengeweberemodellierung mit einer starken Beeinträchtigung der Lebensqualität des Patienten einhergeht, ist die Beschleunigung des postoperativen Heilungsprozesses eines der Ziele des Tissue Engineerings. Die Bildung von Blutgefäßen ist unabdingbar für eine erfolgreiche Integration eines Knochentransplantats in das Gewebe. Daher ist ein umfangreich ausgebildetes Blutgefäßsystem für einen verbesserten Heilungsprozess während der klinischen Anwendung wünschenswert. Frühere Experimente zeigen, dass sich die Anwendung von Ko-Kulturen aus humanen primären Osteoblasten (pOB) und humanen outgrowth endothelial cells (OEC) im Hinblick auf die Bildung stabiler gefäßähnlicher Strukturen in vitro, die auch effizient in das mikrovaskuläre System in vivo integriert werden konnten, als erfolgreich erweisen. Dieser Ansatz könnte genutzt werden, um prä-vaskularisierte Konstrukte herzustellen, die den Knochenheilungsprozess nach der Implantation fördern. Zusätzlich repräsentiert das Ko-Kultursystem ein exzellentes in vitro Model, um Faktoren, welche stark in den Prozess der Knochenheilung und Angiogenese eingebunden sind, zu identifizieren und zu analysieren. Es ist bekannt, dass Makrophagen eine maßgebliche Rolle in der inflammatorisch-induzierten Angiogenese spielen. In diesem Zusammenhang hebt diese Studie den positiven Einfluss THP-1 abgeleiteter Makrophagen in Ko-Kultur mit pOB und OEC hervor. Die Ergebnisse zeigten, dass die Anwendung von Makrophagen als inflammatorischer Stimulus im bereits etablierten Ko-Kultursystem zu einer pro-angiogenen Aktivierung der OEC führte, was in einer signifikant erhöhten Bildung blutgefäßähnlicher Strukturen in vitro resultierte. Außerdem zeigte die Analyse von Faktoren, die in der durch Entzündung hervorgerufenen Angiogenese eine wichtige Rolle spielen, eine deutliche Hochregulation von VEGF, inflammatorischer Zytokine und Adhäsionsmoleküle, die letztlich zu einer verstärkten Vaskularisierung beitragen. Diese Resultate werden dem Einfluss von Makrophagen zugeschrieben und könnten zukünftig im Tissue Engineering eingesetzt werden, um den Heilungsprozess zu beschleunigen und damit die klinische Situation von Patienten zu verbessern. Darüber hinaus könnte die Kombination der auf Ko-Kulturen basierenden Ansätze für das Knochen Tissue Engineering mit einem biomaterial-basierenden Arzneimittelabgabesystem zum klinischen Einsatz kommen, der die Eliminierung verbliebener Krebszellen mit der Förderung der Knochenregeneration verbindet.

Strahlungsinduzierte Mukositis als Risiko der Raumfahrt : Modelluntersuchungen an Röntgen- und Schwerionen-bestrahlten organotypischen Mundschleimhaut-Modellen

Während ausgedehnter Weltraumflüge zum Mond und Mars wäre die Besatzung eines Raumschiffs dicht ionisierender Schwerionenstrahlung, der sogenannten kosmischen Strahlung, ausgesetzt. Da bei vielen Krebspatienten die orale Mukositis als eine gravierende Nebenwirkung bei der herkömmlichen Strahlentherapie auftritt, könnte diese Erkrankung ein medizinisches Problem während ausgedehnter Weltraumflüge darstellen. Allerdings liegen bislang keine Untersuchungen über eine mögliche Mukositis-induzierte Wirkung von Schwerionenstrahlung vor. Um das Risiko strahlungsinduzierter oraler Mukositis durch kosmische Strahlung abzuschätzen, wurden dreidimensionale organotypische Mundschleimhaut-Modelle 12C Schwerionen- bzw. Röntgenstrahlung ausgesetzt und nach definierten Inkubationszeiten kryokonserviert. Aus dem Material wurden Kryoschnitte gefertigt, mit denen anschließend histologische und immunhistologische Fluoreszenzfärbungen zum Nachweis von zum Beispiel Kompaktheitsverlust, Doppelstrangbrüchen der DNA und NF-κB-Aktivierung durchgeführt wurden. Die Ausschüttung von Tumornekrosefaktor α, Interleukin 1β, Interleukin 6 und Interleukin 8 wurde in Probenüberständen mittels ELISA analysiert. Das Hauptaugenmerk dieser Studie lag dabei auf den frühen durch Strahlung verursachten Effekten. rnIm Rahmen dieser Dissertation wurde ein dreidimensionales Mundschleimhaut-Modell etabliert, das verglichen mit humaner Mundschleimhaut viele organotypische Differenzierungsmarker und in vivo-ähnliche Reaktionen auf bestimmte Reize zeigte. Nach einer Bestrahlung mit schweren Kohlenstoffionen bzw. mit Röntgenstrahlung wurden strahlungsinduzierte Effekte auf mehreren Ebenen detektiert. Bereits 1 h nach Bestrahlung konnten dosisabhängig vermehrte Doppelstrangbrüche in der DNA detektiert werden, wobei bei gleicher Dosis Schwerionenstrahlung im Durchschnitt doppelt so viele DSB verursachte wie Röntgenstrahlung. Das Mundschleimhaut-Modell reagierte auf beide Strahlungsarten mit einer Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-κB p50, wobei Röntgenstrahlung diese Aktivierung früher induzierte als Schwerionen. Eine strahlungsinduzierte Aktivierung von NF-κB p65 wurde in den organotypischen Kulturen zu den untersuchten Zeitpunkten nicht beobachtet. Im Vergleich zu nicht bestrahlten Kulturen waren die Konzentrationen von Interleukin 6 und Interleukin 8 unabhängig von der Strahlungsqualität nach Bestrahlung signifikant erhöht. Interleukin-1β dagegen wurde nur nach Röntgenbestrahlung signifikant vermehrt ausgeschüttet. In Schwerionen-bestrahlten Proben wurden zwar tendenziell höhere Konzentrationen beobachtet, statistische Signifikanzen ergaben sich aber nicht. Die Analysen zur TNF-α- und IFN-γ-Ausschüttung in bestrahlten organotypischen Kulturen ergaben innerhalb des gewählten Beobachtungszeitraums von 48 h keine strahlungsinduzierten Effekte. Bei den Untersuchungen der Proliferation in den Zellen der bestrahlten organotypischen Kulturen wurde bereits 24 h nach Röntgenstrahlung und 3 Tage nach Schwerionenstrahlung eine deutliche verminderte Proliferation beobachtet. Des Weiteren zeigte das Mundschleimhaut-Modell unabhängig von Strahlungsqualitäten einen eindeutigen Verlust in der Zellintegrität und daraus resultierenden Kompaktheitsverlust des Gewebes, was in der in vivo-Situation wahrscheinlich einer Gewebedegeneration entspricht. rnNach Bestrahlung mit sowohl Röntgenstrahlung als auch schweren Ionen wurden im gewählten Mukosa-Modell innerhalb von 48 h nach Behandlung strahlungsinduzierte proinflammatorische Marker eindeutig und reproduzierbar detektiert. Dies deutet darauf hin, dass während langer extraterrestrischer Expeditionen das Risiko der oralen Mukositis einkalkuliert und mit den daraus folgenden Konsequenzen gerechnet werden muss.rn

Analyse der Wirkung des Naturstoffes Oxacyclododecindion in einem chronisch-inflammatorischen Krankheitsmodell

Die medikamentöse Standardtherapie entzündlich-rheumatischer Erkrankungen wie der rheumatoider Arthritis (RA) und des systemischen Lupus erythematodes (SLE) sind oft unzureichend und erlauben keine nebenwirkungsarme beziehungsweise -freie Behandlung. Daher ist es von großem Interesse für diese Indikationsgebiete, wirkungsvolle Substanzen zu entwickeln, die für eine Langzeittherapie geeignet sind. Naturstoffe wie Oxacyclododecindion (Oxa) können dabei als mögliche Leitstruktur dienen. Oxa wurde bereits in in-vitro Untersuchungen als ein potenter Inhibitor der Expression von proinflammatorischen und profibrotischen Genen identifiziert. rnZiel dieser Arbeit war es in in-vivo Modellen der RA und des SLEs das therapeutische Potential des Naturstoffes Oxa aufzuklären. Da eine Etablierung der Kollagen-induzierten Arthritis im untersuchten murinen RA-Modell, dem HLA-DR4.AE° Stamm, nicht möglich war, wurden die Untersuchungen ausschließlich im MRL Faslpr Mausstamm, einem anerkannten SLE-Modell durchgeführt. MRL Faslpr Mäuse entwickeln wie SLE-Patienten unter anderem eine schwerwiegende Glomerulonephritis. rnIn den Nieren weiblicher MRL Faslpr Mäuse konnte die Oxa-Behandlung die Expression zahlreicher proinflammatorischer Mediatoren beeinflussen, die in Zusammenhang mit der Pathogenese des humanen SLE gebracht werden. So reduziert der Naturstoff die Expression von Zytokinen wie TNFα, IFNγ und IL6 als auch Chemokinen wie CCL2, CSF-1 und RANTES auf mRNA- und Proteinebene. Dabei war die Wirkung von Oxa in den in-vivo Analysen ähnlich gut wie die des potenten Glukokortikoids Dexamethason. Die Reduktion chemotaktischer Moleküle durch die Oxa-Behandlung führte nachweislich zu einer reduzierten Akkumulation von Immunzellen. Die anti-inflammatorischen und immunmodulatorischen Effekte von Oxa waren so ausgeprägt, dass klinisch-pathologische Marker der Glomerulonephritis, wie die Ablagerung von Immunkomplexen, die vermehrte Bildung von Kollagenfasern und die Ausscheidung von Proteinen im Urin gemildert wurden. Weiterführende Untersuchungen im SLE Modell konnten neue Zielmoleküle von Oxa identifizieren, wie KIM1 und zahlreiche SLE-assoziierte microRNAs (miR 19a, 29c und 369). Diese Befunde legen nahe, dass Oxa eine vielversprechende anti-entzündliche und -fibrotische Verbindung darstellt. rnDie Entschlüsselung des Wirkmechanismus von Oxa steht erst am Anfang. Die Analysen im Rahmen dieser Arbeit zeigten jedoch, dass Oxa einen Einfluss auf die Phosphorylierung und somit Aktivierung der p38 MAPK sowie auf die mRNA-Stabilität von proinflammatorischen Zytokinen wie TNFα zu haben scheint.rn