Bioinformatische Identifizierung und Charakterisierung von Zyklin-abhängigen Kinasen und Zyklinen des Parasiten Eimeria tenella und deren Nutzung im rationalen Wirkstoffdesign

Parasiten der Apicomplexa umfassen sowohl humanpathogene, als auch tierpathogene Protozoen. Beispiele für wichtige Vertreter human- und tierpathogener Parasiten sind Plasmodium falciparum und Eimeria tenella. E. tenella verursacht die Kokzidiose des Hühnchens, eine Darmerkrankung die weltweit für Verluste in einer geschätzten Höhe von bis zu 3 Milliarden US$ verantwortlich zeichnet. Eine prophylaktische Vakzinierung gegen diese Krankheit ist ökonomisch meist ineffizient, und eine Behandlung mit Kokzidiostatika wird durch häufige Resistenzbildung gegen bekannte Wirkstoffe erschwert. Diese Situation erfordert die Entwicklung neuer kostengünstiger Alternativen. Geeignete Zielproteine für die Entwicklung neuartiger Arzneistoffe zur Behandlung der Kokzidiose sind die Zyklin-abhängigen Kinasen (CDKs), zu denen auch die CDK-related Kinase 2 (EtCRK2) aus E. tenella gehört. Diese Proteine sind maßgeblich an der Regulation des Zellzyklus beteiligt. Durch chemische Validierung mit dem CDK Inhibitor Flavopiridol konnte nachgewiesen werden, dass ein Funktionsverlust von CDKs in E. tenella die Vermehrung des Parasiten in Zellkultur inhibiert. E. tenella CDKs sind daher als Zielproteine für die Entwicklung einer Chemotherapie der Kokzidiose geeignet. Mittels bioinformatischer Tiefenanalysen sollten CDK Proteine im Parasiten E. tenella identifiziert werden. Das Genom von E. tenella liegt in Rohfassung vor [ftp://ftp.sanger.ac.uk]. Jedoch waren zum Zeitpunkt dieser Arbeiten viele Sequenzen des Genoms noch nicht annotiert. Homologe CDK Proteine von E. tenella konnten durch den Vergleich von Sequenzinformationen mit anderen Organismen der Apicomplexa identifiziert und analysiert werden. Durch diese Analysen konnten neben der bereits bekannten EtCRK2, drei weitere, bislang nicht annotierte CDKs in E. tenella identifiziert werden (EtCRK1, EtCRK3 sowie EtMRK). Darüber hinaus wurde eine Analyse der entsprechenden Zykline – der Aktivatoren der CDKs – bezüglich Funktion und Struktur, sowie eine Datenbanksuche nach bisher nicht beschriebenen Zyklinen in E. tenella durchgeführt. Diese Suchen ergaben vier neue potentielle Zykline für E. tenella, wovon EtCYC3a als Aktivator der EtCRK2 von María L. Suárez Fernández (Intervet Innovation GmbH, Schwabenheim) bestätigt werden konnte. Sequenzvergleiche lassen vermuten, dass auch EtCYC1 und EtCYC3b in der Lage sind, EtCRK2 zu aktivieren. Außerdem ist anzunehmen, dass EtCYC4 als Aktivator der EtCRK1 fungiert. Ein weiterer Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit war die Suche und Optimierung nach neuen Inhibitoren von CDKs aus E. tenella. In vorangegangenen Arbeiten konnten bereits Inhibitoren der EtCRK2 gefunden werden [BEYER, 2007]. Mittels Substruktur- und Ähnlichkeitssuchen konnten im Rahmen dieser Arbeit weitere Inhibitoren der EtCRK2 identifiziert werden. Vier dieser Strukturklassen erfüllen die Kriterien einer Leitstruktur. Eine dieser Leitstrukturen gehört zur Strukturklasse der Benzimidazol-Carbonitrile und ist bislang nicht als Inhibitor anderer Kinasen beschrieben. Diese neu identifizierte Leitstruktur konnte in silico weiter optimiert werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Bindungsenergien von Vertretern dieser Strukturklasse berechnet, um einen wahrscheinlichen Bindemodus vorherzusagen. Für die weiterführende in silico Optimierung wurde eine virtuelle kombinatorische Substanzbibliothek dieser Klasse erstellt. Die Auswahl geeigneter Verbindungen für eine chemische Synthese erfolgte durch molekulares Docking unter Nutzung von Homologiemodellen der EtCRK2. Darüber hinaus wurde ein in silico Screening nach potentiellen Inhibitoren der PfMRK und EtMRK durchgeführt. Dabei konnten weitere interessante virtuelle Hit-Strukturen aus einer Substanzdatenbank kommerziell erhältlicher Verbindungen gefunden werden. Durch dieses virtuelle Screening konnten jeweils sieben Verbindungen als virtuelle Hits der PfMRK sowie der EtMRK identifiziert werden. Die Häufung von Strukturklassen mit bekannter CDK Aktivität deutet darauf hin, dass während des virtuellen Screenings eine Anreicherung von CDK Inhibitoren stattgefunden hat. Diese Ergebnisse lassen auf eine Weiterentwicklung neuer Wirkstoffe gegen Kokzidiose und Malaria hoffen.

Palynologie und Sedimentologie der Interglazialprofile Döttingen, Bonstorf, Munster und Bilshausen

Palynologie und Sedimentologie der Interglazialprofile Döttingen, Bonstorf, Munster und Bilshausen Zusammenfassung In der vorliegenden Dissertation wurden vier dem Holstein-Interglazial zugehörige Bohrkerne sowie ein rhumezeitlicher Bohrkern palynologisch und sedimentologisch bearbeitet. Die holsteinzeitlichen Bohrkerne stammen aus Kieselgurlagerstätten der Lüneburger Heide (Bonstorf und Munster) und aus einem Trockenmaar (Döttingen) in der Eifel. Der rhumezeitliche Kern stammt aus der Typlokalität Bilshausen im Harzvorland. Neben Prozentwertdiagrammen werden Pollendichte- und wenn möglich Polleninfluxwerte vorgestellt, die insbesondere für die Lokalitäten Hetendorf/Bonstorf und Munster/Breloh bisher nicht verfügbar waren. Mit dem Profil Döttingen konnte erstmals eine sowohl vollständige als auch nicht innerhalb des klassischen Aufkommens holsteinzeitlicher Fundstellen im norddeutschen Tiefland positionierte Holsteinsequenz aus dem deutschen Mittelgebirge dokumentiert werden. Das erhaltene Pollendiagramm bestätigt die aus den norddeutschen Profilen bekannte holsteintypische Vegetationsabfolge, durch die das Holstein gegenüber anderen Interglazialen wie Holozän, Eem oder Rhume palynologisch definiert ist. Neben der grundsätzlichen Übereinstimmung der Pollensequenz unterscheidet sich das Profil Döttingen aber deutlich im prozentualen Aufkommen der beteiligten Taxa von den norddeutschen Profilen. So wird eine hohe Alnus-Präsenz als Merkmal deutscher Holsteinprofile bestätigt, jedoch ist die, in den norddeutschen Lokalitäten durchhaltend hohe oder dominante Beteiligung von Pinus im deutschen Mittelgebirge nicht vorhanden und muss daher auf die Standortbedingungen Norddeutschlands zurückgeführt werden. Abies dagegen ist im Holstein der Mittelgebirge wesentlich präsenter als im norddeutschen Flachland. Im Profil Döttingen wurden insgesamt 10 Tephralagen gefunden. Auf eine dieser Tephren folgt ein „Birken-Kiefern-Gräser Vorstoß“, der palynostratigraphisch dem älteren „Birken-Kiefern Vorstoß“ in Munster/Breloh entspricht. Als eine Typologie des Holstein kann das in den Profilen Döttingen und Munster bestätigte intraholsteinzeitliche Carpinus-Minimum verstanden werden. An Hand sedimentologischer und palynologischer Befunde aus dem Bohrkern MU 2 muss die Existenz zweier, in der Literatur postulierter, postholsteinzeitlicher, „Nachschwankungen“ in Munster/Breloh in Frage gestellt, wenn nicht abgelehnt werden. In Kern MU 2 fallen palynostratigraphische Grenzen häufig mit Sandeinschaltungen zusammen. Eine dieser Sandeinschaltungen, nämlich unmittelbar vor dem älteren „Birken-Kiefern-Vorstoß“, korreliert in ihrer stratigraphischen Position mit der den „Birken-Kiefern-Gräser-Vorstoß“ im Profil Döttingen einleitenden Tephralage. Es gelang die Dauer des intraholsteinzeitlichen Carpinus Minimums auf etwa 1500±100 Jahre zu bestimmen und eine interne Zweigliederung zu dokumentieren. Im rhumezeitlichen Kern von Bilshausen (BI 1) konnten zahlreiche Störungen nachgewiesen werden. Insbesondere im Teufenbereich des Bilshausener „Birken-Kiefern-Vorstoßes“ deuten diese auf eine möglicherweise verfälschte Überlieferung. Der palynologisch markante „Lindenfall“ von Bilshausen liegt im Bereich einer isoklinalen Schichtenverfaltung. Die in der Literatur im Horizont des „Lindenfalls“ beschriebene „Bilshausentephra“ wurde nicht gefunden. Warvenzählungen an den Kernen MU 1, MU 2 und BI 1 ermöglichten Pollenzonendauern in Holstein- und Rhume-Interglazial zu bestimmen. Dabei wurde mittels den Warvenzählungen, unter zu Hilfenahme von Literaturdaten und von Schätzwerten eine Dauer für das Holstein-Interglazial sensu stricto (Pollenzonen I-XIV) von 15400-17800 Jahren und für das Rhume-Interglazial von wahrscheinlich 22000 Jahren bis maximal 26000 Jahren ermittelt.

Komparative Analyse der humanen Chromosomenregion 11p15.3 um die Gene LMO1,TUB und der orthologen Region in der Maus

Ziel der vorliegenden Arbeit war die vergleichende Sequenzierung und nachfolgende Analyse des syntänen chromosomalen Abschnitts auf dem kurzen Arm des humanen Chromosoms 11 in der Region 11p15.3 mit den Genen LMO1, TUB und dem orthologen Genomabschnitt der Maus auf Chromosom 7 F2. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführte Kartierung dieser beiden chromosomalen Bereiche ermöglichte die Komplettierung einer genomischen Karte auf insgesamt über eine Megabase, die im Kooperationssequenzierprojekt der Universitäts-Kinderklinik und dem Institut für Molekulargenetik in Mainz erstellt wurde. Mit Hilfe von 28 PAC- und Cosmid-Klonen konnten in dieser Arbeit 383 kb an genomischer DNA des Menschen und mit sechs BAC- und PAC-Klonen 412 kb an genomischer DNA der Maus dargestellt werden. Dies ermöglichte erstmals die exakte Festlegung der Reihenfolge der in diesem chromosomalen Abschnitt enthaltenen Gene und die genaue Kartierung von acht STS-Markern des Menschen, bzw. vier STS-Sonden der Maus. Es zeigte sich dabei, dass die chromosomale Orientierung telomer-/centromerwärts des orthologen Bereichs in der Maus im Vergleich zum Menschen in invertierter Ausrichtung vorliegt. Die Sequenzierung von drei humanen Klonen ermöglichte die Bestimmung von 319.119 bp an zusammenhängender genomischer DNA. Dadurch konnte die genaue Lokalisation und Strukturaufklärung der Gene LMO1, ein putatives Tumorsuppressorgen, das mit der Entstehung von Leukämien assoziiert ist, und TUB, ein Transkriptionsmodulator, der in die Fettstoffwechselregulation involviert ist, vorgenommen werden. Für das murine Genom wurden 412.827 bp an neuer DNA-Sequenz durch Sequenzierung von ebenfalls drei Klonen generiert. Der im Vergleich zum Menschen ca. 100 kb größere Genombereich beinhaltete zudem die neuen Gene Stk33 und Eif3. Es handelte sich dabei um zwei Gene, die erst im Rahmen dieser Arbeit entdeckt und charakterisiert wurden. Die parallele Bearbeitung beider Genombereiche ermöglichte eine umfassende komparative Analyse nach kodierenden, funktionellen und strukturgebenden Sequenzabschnitten in beiden Spezies. Es konnten dabei für beide Organismen die Exon-Intron-Strukturen der Gene LMO1/Lmo1 und TUB/Tub geklärt. Zudem konnten vier neue Exons und zwei neue speziesspezifischer Spleißvarianten für TUB/Tub beschrieben werden. Die Identifizierung dieser neuen Spleißvarianten offenbart neue Möglichkeiten für alternative Regulation und Funktion, oder für eine veränderte Proteinstruktur, die weitere Erklärungsansätze für die Entstehung der mit diesen Genen assoziierten Erkrankungen zulässt. In der sequenzierten, größeren Genomsequenz der Maus konnte in den flankierenden, nicht mit der sequenzierten Humansequenz überlappenden Bereich das neue Gen Eif3 in seiner Exon-Intron-Struktur und die beiden letzten Exons 11 und 12 des Gens Stk33 kartiert und charakterisiert werden. Die umfangreiche Sequenzanalyse beider sequenzierter Genombereiche ergab für den Abschnitt des Menschen insgesamt 229 potentielle Exonsequenzen und für den Bereich der Maus 527 mögliche Exonbereiche. Davon konnten beim Menschen explizit 21 Exons und bei der Maus 31 Exons als exprimierte Bereiche identifiziert und experimentell mittels RT-PCR, bzw. durch cDNA-Sequenzierung verifiziert werden. Diese Abschnitte beschrieben nicht nur die Exonbereiche der oben genannten vier Gene, sondern konnten auch neuen nicht weiter definierten EST-Sequenzen zugeordnet werden. Mittels des Interspeziesvergleiches war darüber hinaus auch die Analyse der nichtkodierenden Intergen-Bereiche möglich. So konnten beispielsweise im ersten Intron des LMO1/Lmo1 sieben Sequenzbereiche mit Konservierungen von ca. 90% bestimmt werden. Auch die Charakterisierung von Promotor- und putativ regulatorischen Sequenzabschnitten konnte mit Hilfe unterschiedlicher bioinformatischer Analyse-Tools durchgeführt werden. Die konservierten Sequenzbereiche der DNA zeigen im Durchschnitt eine Homologie von mehr als 65% auf. Auch die Betrachtung der Genomorganisation zeigte Gemeinsamkeiten, die sich meist nur in ihrer graduellen Ausprägung unterschieden. So weist ein knapp 80 kb großer Bereich proximal zum humanen TUB-Gen einen deutlich erhöhten AT-Gehalt auf, der ebenso im murinen Genom nur in verkürzter Version und schwächer ausgeprägt in Erscheinung tritt. Die zusätzliche Vergleichsanalyse mit einer weiteren Spezies, den orthologen Genomabschnitten von Fugu, zeigte, dass es sich bei den untersuchten Genen LMO1 und TUB um sehr konservierte und evolutiv alte Gene handelt, deren genomisches Organisationsmuster sich auch bei den paralogen Genfamilienmitglieder innerhalb derselben Spezies wiederfindet. Insgesamt konnte durch die Kartierung, Sequenzierung und Analyse eine umfassende Datenbasis für die betrachtete Genomregion und die beschriebenen Gene generiert werden, die für zukünftige Untersuchungen und Fragestellungen wertvolle Informationen bereithält.

RNA-Strukturen im Hepatitis-C-Virus und ihre Bedeutung für Translation und Replikation

Das Hepatitis C Virus (HCV) ist ein umhülltes Virus aus der Familie der Flaviviridae. Es besitzt ein Plusstrang-RNA Genom von ca. 9600 Nukleotiden Länge, das nur ein kodierendes Leseraster besitzt. Das Genom wird am 5’ und 3’ Ende von nicht-translatierten Sequenzen (NTRs) flankiert, welche für die Translation und vermutlich auch Replikation von Bedeutung sind. Die 5’ NTR besitzt eine interne Ribosomeneintrittsstelle (IRES), die eine cap-unabhängige Translation des ca. 3000 Aminosäure langen viralen Polyproteins erlaubt. Dieses wird ko- und posttranslational von zellulären und viralen Proteasen in 10 funktionelle Komponenten gespalten. Inwieweit die 5’ NTR auch für die Replikation der HCV RNA benötigt wird, war zu Beginn der Arbeit nicht bekannt. Die 3’ NTR besitzt eine dreigeteilte Struktur, bestehend aus einer variablen Region, dem polyU/UC-Bereich und der sogenannten X-Sequenz, eine hochkonservierte 98 Nukleotide lange Region, die vermutlich für die RNA-Replikation und möglicherweise auch für die Translation benötigt wird. Die genuae Rolle der 3’ NTR für diese beiden Prozesse war zu Beginn der Arbeit jedoch nicht bekannt. Ziel der Dissertation war deshalb eine detaillierte genetische Untersuchung der NTRs hinsichtlich ihrer Bedeutung für die RNA-Translation und -Replikation. In die Analyse mit einbezogen wurden auch RNA-Strukturen innerhalb der kodierenden Region, die zwischen verschiedenen HCV-Genotypen hoch konserviert sind und die mit verschiedenen computer-basierten Modellen vorhergesagt wurden. Zur Kartierung der für RNA-Replikation benötigten Minimallänge der 5’ NTR wurde eine Reihe von Chimären hergestellt, in denen unterschiedlich lange Bereiche der HCV 5’ NTR 3’ terminal mit der IRES des Poliovirus fusioniert wurden. Mit diesem Ansatz konnten wir zeigen, dass die ersten 120 Nukleotide der HCV 5’ NTR als Minimaldomäne für Replikation ausreichen. Weiterhin ergab sich eine klare Korrelation zwischen der Länge der HCV 5’ NTR und der Replikationseffizienz. Mit steigender Länge der 5’ NTR nahm auch die Replikationseffizienz zu, die dann maximal war, wenn das vollständige 5’ Element mit der Poliovirus-IRES fusioniert wurde. Die hier gefundene Kopplung von Translation und Replikation in der HCV 5’ NTR könnte auf einen Mechanismus zur Regulation beider Funktionen hindeuten. Es konnte allerdings noch nicht geklärt werden, welche Bereiche innerhalb der Grenzen des IRES-Elements genau für die RNA-Replikation benötigt werden. Untersuchungen im Bereich der 3’ NTR ergaben, dass die variable Region für die Replikation entbehrlich, die X-Sequenz jedoch essentiell ist. Der polyU/UC-Bereich musste eine Länge von mindestens 11-30 Uridinen besitzen, wobei maximale Replikation ab einer Länge von 30-50 Uridinen beobachtet wurde. Die Addition von heterologen Sequenzen an das 3’ Ende der HCV-RNA führte zu einer starken Reduktion der Replikation. In den hier durchgeführten Untersuchungen zeigte keines der Elemente in der 3’ NTR einen signifikanten Einfluss auf die Translation. Ein weiteres cis aktives RNA-Element wurde im 3’ kodierenden Bereich für das NS5B Protein beschrieben. Wir fanden, dass Veränderungen dieser Struktur durch stille Punktmutationen die Replikation hemmten, welche durch die Insertion einer intakten Version dieses RNA-Elements in die variable Region der 3’ NTR wieder hergestellt werden konnte. Dieser Versuchsansatz erlaubte die genaue Untersuchung der für die Replikation kritischen Strukturelemente. Dadurch konnte gezeigt werden, dass die Struktur und die Primärsequenz der Loopbereiche essentiell sind. Darüber hinaus wurde eine Sequenzkomplementarität zwischen dem Element in der NS5B-kodierenden Region und einem RNA-Bereich in der X-Sequenz der 3’ NTR gefunden, die eine sog. „kissing loop“ Interaktion eingehen kann. Mit Hilfe von gezielten Mutationen konnten wir zeigen, dass diese RNA:RNA Interaktion zumindest transient stattfindet und für die Replikation des HCV essentiell ist.

An interferon regulatory factor element controls the major immune modulator of murine cytomegalovirus

Immune modulation by herpesviruses, such as cytomegalovirus, is critical for the establishment of acute and persistent infection confronting a vigorous antiviral immune response of the host. Therefore, the action of immune-modulatory proteins has long been the subject of research, with the final goal to identify new strategies for antiviral therapy.rnIn the case of murine cytomegalovirus (mCMV), the viral m152 protein has been identified to play a major role in targeting components of both the innate and the adaptive immune system in terms of infected host-cell recognition in the effector phase of the antiviral immune response. On the one hand, it inhibits cell surface expression of RAE-1 and thereby prevents ligation of the activating natural killer (NK)-cell receptor NKG2D. On the other hand, it decreases cell surface expression of peptide-loaded MHC class I molecules thereby preventing antigen presentation to CD8 T cells. Ultimately, the outcome of CMV infection is determined by the interplay between viral and cellular factors.rnIn this context, the work presented here has revealed a novel and intriguing connection between viral m152 and cellular interferon (IFN), a key cytokine of the immune system: rnthe m152 promoter region contains an interferon regulatory factor element (IRFE) perfectly matching the consensus sequence of cellular IRFEs.rnThe biological relevance of this regulatory element was first suggested by sequence comparisons revealing its evolutionary conservation among various established laboratory strains of mCMV and more recent low-passage wild-derived virus isolates. Moreover, search of the mCMV genome revealed only three IRFE sites in the complete sequence. Importantly, the functionality of the IRFE in the m152 promoter was confirmed with the use of a mutant virus, representing a functional deletion of the IRFE, and its corresponding revertant virus. In particular, m152 gene expression was found to be inhibited in an IRFE-dependent manner in infected cells. Essentially, this inhibition proved to have a severe impact on the immune-modulatory function of m152, first demonstrated by a restored direct antigen presentation on infected cells for CD8 T-cell activation. Even more importantly, this effect of IRFE-mediated IFN signaling was validated in vivo by showing that the protective antiviral capacity of adoptively-transferred, antigen-specific CD8 T cells is also significantly restored by the IRFE-dependent inhibition of m152. Somewhat curious and surprising, the decrease in m152 protein simultaneously prevented an enhanced activation of NK cells in acute-infected mice, apparently independent of the RAE-1/NKG2D ligand/receptor interaction but rather due to reduced ‘missing-self’ recognition.rnTaken together, this work presents a so far unknown mechanism of IFN signaling to control mCMV immune modulation in acute infection.rnrn