Untersuchung zum Beitrag des ON-Kanals zu zeitlichen und chromatischen Verarbeitungsmechanismen in der Retina

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, mithilfe von Dressurexperimenten in Kombination mit dem Einsatz von Neuropharmaka die Bedeutung des retinalen ON-Kanals für zwei visuelle Leistungen des Goldfisches – das kontrastabhängige zeitliche Auflösungsvermögen sowie die Wellenlängenunterscheidungsfähigkeit - zu untersuchen. Da die Tiere nach der pharmakologischen Blockade keinerlei verändertes Verhalten zeigten, kann davon ausgegangen werden, dass der retinale ON-Kanal weder für die Prozessierung des kontrastabhängigen zeitlichen Auflösungsvermögens noch für die Wellenlängenunterscheidungsfähigkeit eine maßgebliche Rolle spielt. Aus den Versuchen zur Wellenlängenunterscheidungsfähigkeit kann des Weiteren abgeleitet werden, dass der ON-Kanal auch für die spektrale Empfindlichkeit der Tiere bei der gegebenen Beleuchtungs- und Dressurbedingungen (L+-Dressur) keine Bedeutung zu haben scheint. Nach den Versuchen zum kontrastabhängigen zeitlichen Auflösungsvermögen kann festgehalten werden, dass das zeitliche Auflösungsvermögen des Goldfisches sich mit abnehmendem Stimuluskontrast verändert: Der für die Tiere wahrnehmbare Flickerfrequenzbereich wird mit abnehmendem Kontrast geringer. Die Flimmerfusionsfrequenz wird im oberen Frequenzbereich früher erreicht; im unteren Flickerfrequenzbereich tritt mit abnehmendem Kontrast auch eine untere Grenze des zeitlichen Auflösungsvermögens auf. Des Weiteren zeigen die Ergebnisse aus den Verhaltensversuchen zu den kontrastabhängigen zeitlichen Übertragungseigenschaften eine gute Vergleichbarkeit zu elektrophysiologisch gewonnenen Antworten von ON bzw. OFF-Bipolarzellen. Ebenso ähneln sich die Kurvenverläufe zum kontrastabhängigen zeitlichen Auflösungsvermögen und die aus den Versuchen zur kontrastabhängigen Ganzfeldbewegungswahrnehmung – einer visuellen Leistung, deren Prozessierung eines ON-Kanal-Beitrages bedarf. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das zeitliche Auflösungsvermögen wie auch die Ganzfeldbewegungswahrnehmung hauptsächlich von retinalen Verarbeitungsprozessen abhängen.

Plasmonic nanorods and nanoparticle-assemblies

Die vorliegenden Dissertation beschäftigt sich mit plasmonischen Nanopartikeln, deren Wechselwirkung mit Licht in einer Plasmonenschwingung resultiert. Suspensionen dieser Partikel zeigen kräftige Farben, da sich die Resonanzfrequenz der Plasmonenschwingung im sichtbaren Bereich des elektromagnetischen Spektrum befindet. Durch die Veränderung interner (Material, Größe, Form) oder externer Parameter (Brechungsindex der Umgebung, Abstand zu anderen plasmonischen Partikeln) lässt sich die Farbe der Partikel verändern, eine Verschiebung der Resonanzfrequenz kann beobachtet werden. Ihre Sensitivität gegenüber äußeren Bedingungen ist der Grund, weshalb plasmonische Nanopartikel als Sensoren eingesetzt werden können. Wichtig ist hierbei nicht nur, dass die Partikel eine hohe Sensitivität zeigen, sondern auch die Möglichkeit, reproduzierbar Partikel zu synthetisieren, die experimentellen Anforderungen entsprechen. In der vorliegenden Arbeit wird das Wachstum von reinen Gold- und mit Silber beschichteten Goldnanostäbchen untersucht. Des Weiteren werden plasmonische Nanopartikel als Orientierungs-, Brechungsindex- und Abstandssensoren verwendet. Die Synthese von Goldnanostäbchen erfolgt auf nasschemischen Weg, ihr anisotropes Wachstum aus isotropen Keimen wird durch zahlreiche Faktoren beeinflusst. In diesem Zusammenhang wurde ein Wachstumsmodell entwickelt, das neben dem Vorhandensein eines Stabilisators auch die Rolle von Bromid- und Silberionen herausstellt, die durch selektive Adsorption das Wachstum bestimmter Kristallflächen inhibieren. Zudem konnte gezeigt werden, dass die Potentialdifferenz zwischen Reduktions- und Oxidationsmittel klein sein muss, um ein langsames selektives Wachstum zu gewährleisten. rnDurch das Aufwachsen einer dünnen Silberschicht auf Goldnanostäbchen verbessert sich deren Qualität im Bezug auf die heterogene Linienbreite. Der “Plasmonic Focusing Effect”, die Änderung der Steigung des linearen Zusammenhangs von Plasmonenresonanz und Aspektverhältnis, konnte theoretisch berechnet und experimentell verifiziert werden. Durch die Aufnahme zeitaufgelöster Spektren und die Untersuchung des Verlaufs der Reaktion wurden sowohl Reaktionsordnung, als auch Aktivierungsenergie ermittelt. Das so gefundene kinetische Model erlaubt zudem die Vorhersage des Reaktionsprodukts zu verschiedenen Zeiten. rnEinzelne Goldnanostäbchen wurden in einer Gelmatrix bei verschiedenen Temperaturen untersucht, die Aufnahme der zeitlichen Variation der polarisationsabhängigen Streuintensität konnte genutzt werden, um den Kollaps des Gels zu charakterisieren. Neben der Verwendung einzelner plasmonischer Nanopartikel wurden auch Dimere, bestehend aus zwei Goldnanokugeln, untersucht. Nach der Kalibrierung der Resonanzfrequenz gegenüber des Abstandes der beiden Partikel durch externe Methoden (Lichtstreuung, Cryo- Elektronenmikroskopie) wurde der so gefundene exponentielle Zusammenhang verwendet, um sowohl den Brechungsindex der Umgebung, als auch den Abstand der beiden Goldnanokugeln zu bestimmen. Des Weiteren wurden Goldnanopartikeldimere benutzt, um ein als Linker verwendetes thermoresponsives Elastin-Polymer bei verschiedenen Temperaturen zu charakterisieren. Neben Aggregaten aus zwei Goldnanokugeln wurden auch so genannte “core-satellite” Strukturen synthetisiert, die um einen großen Goldnanopartikelkern viele kleine Goldnanopartikel tragen. Diese Partikel haben eine theoretisch vorhergesagte höhere Sensitivität gegenüber Brechungsindexänderungen, was in ersten Experimenten gezeigt werden konnte.

Dressurexperimente zur Unterscheidungsfähigkeit zwischen weißem Licht und Spektralfarben beim Goldfisch

Der Goldfisch besitzt, im Gegensatz zum Menschen, ein tetrachromatisches Farbensehsystem, das außerordentlich gut untersucht ist. Die Farben gleicher Helligkeit lassen sich hier in einem dreidimensionalen Tetraeder darstellen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es herauszufinden, wie gut der Goldfisch Farben, die dem Menschen ungesättigt erscheinen und im Inneren des Farbtetraeders liegen, unterscheiden kann. Des Weiteren stellte sich die Frage, ob sowohl „Weiß“ (ohne UV) als auch Xenonweiß (mit UV) vom Fisch als „unbunt“ oder „neutral“ wahrgenommenen werden. Um all dies untersuchen zu können, musste ein komplexer Versuchsaufbau entwickelt werden, mit dem den Fischen monochromatische und mit Weiß gemischte Lichter gleicher Helligkeit, sowie Xenonweiß gezeigt werden konnte. Die Fische erlernten durch operante Konditionierung einen Dressurstimulus (monochromatisches Licht der Wellenlängen 660 nm, 599 nm, 540 nm, 498 nm oder 450 nm) von einem Vergleichsstimulus (Projektorweiß) zu unterscheiden. Im Folgenden wurde dem Vergleichstimulus in 10er-Schritten immer mehr der jeweiligen Dressurspektralfarbe beigemischt, bis die Goldfische keine sichere Wahl für den Dressurstimulus mehr treffen konnten. Die Unterscheidungsleistung der Goldfische wurde mit zunehmender Beimischung von Dressurspektralfarbe zum Projektorweiß immer geringer und es kristallisierte sich ein Bereich in der Grundfläche des Tetraeders heraus, in dem die Goldfische keine Unterscheidung mehr treffen konnten. Um diesen Bereich näher zu charakterisieren, bekamen die Goldfische Mischlichter, bei denen gerade keine Unterscheidung mehr zum Projektorweiß möglich war, in Transfertests gezeigt. Da die Goldfische diese Mischlichter nicht voneinander unterscheiden konnten, läßt sich schließen, dass es einen größeren Bereich gibt, der, ebenso wie Weiß (ohne UV) für den Goldfisch „neutral“ erscheint. Wenn nun Weiß (ohne UV) für den Goldfisch „neutral“ erscheint, sollte es dem Xenonweiß ähnlich sein. Die Versuche zeigten allerdings, dass die Goldfische die Farben Weiß (ohne UV) und Xenonweiß als verschieden wahrnehmen. Betrachtet man die Sättigung für die Spektralfarben, so zeigte sich, dass die Spektralfarbe 540 nm für den Goldfisch am gesättigsten, die Spektralfarbe 660 nm am ungesättigsten erscheint.

Elektrophysiologische Charakterisierung der Neurone im Tectum opticum des Goldfisches hinsichtlich Farbe und Bewegung

Die vorliegende Arbeit verfolgte mehrere Ziele. Die Hauptaufgabe war es, farbsensitive und bewegungssensitive Neurone im Tectum opticum des Goldfisches zu finden und diese hinsichtlich ihres Antwortverhaltens zu charakterisieren. Aus Verhaltensversuchen ist bekannt, dass sowohl das Ganzfeldbewegungssehen als auch das Objektbewegungssehen „farbenblind“ ist, da die Verarbeitung dieser Sehleistungen jeweils nur von einem Zapfentyp getrieben wird. Es sollte untersucht werden, ob sich diese Farbenblindheit auch auf Ebene der tectalen bewegungsempfindlichen Neurone finden lässt. Schließlich sollten die Ableitorte im Tectum opticum kartiert werden, um festzustellen, ob es jeweils bestimmte örtlich abgegrenzte Areale für Farbe einerseits und für Bewegung andererseits gibt.rnDie Aktivität von tectalen Units wurde durch extrazelluläre Ableitungen registriert. Um farbspezifische Neurone zu identifizieren und zu charakterisieren, wurden 21 verschiedene Farbpapiere (HKS-Standard) aus dem gesamten Farbenkreis (ausgenommen UV) präsentiert. Auf jedes Farbpapier folgte ein neutrales Graupapier. Des Weiteren wurde eine Schwarz-Weiß-Grau-Sequenz gezeigt, um das Antwortverhalten der Units auf Helligkeitswechsel zu prüfen. Jeder Stimulus wurde für fünf Sekunden präsentiert und die gesamte Stimulussequenz wurde mindestens dreimal wiederholt. Zur Identifizierung bewegungssensitiver Neurone wurde ein sich exzentrisch bewegendes schwarz-weißes Zufallspunktmuster präsentiert. Um die „Farbenblindheit“ des Bewegungssehens zu testen, wurden zwei rot-grüne Zufallspunktmuster präsentiert, die den L-Zapfen des Goldfisches unterschiedlich stark modulierten. Den meisten Units wurden sowohl die Farb- als auch die Bewegungsstimuli gezeigt.rnEs konnten 69 Units abgeleitet werden. Von diesen antworteten 34 sowohl auf Farbstimuli als auch auf Helligkeitsreize, 19 Units reagierten ausschließlich auf Farbstimuli, 15 Units zeigten sich nur für den Bewegungsstimulus sensitiv und zwei Units beantworteten ausschließlich Helligkeitswechsel. Die farbempfindlichen Units konnten in 14 Gruppen eingeteilt werden: sechs Gruppen im Rotbereich (22 Units), fünf Gruppen im Blau-Grünbereich (21 Units), eine Gruppe im Gelbbereich (zwei Units), eine Gruppe, die alle Farbstimuli mit Erhöhung der Aktivität (sechs Units) und eine Gruppe, die alle Farbstimuli mit Erniedrigung der Aktivität (eine Unit) beantwortete. Es wurden zwei Arten von Gegenfarbzellen gefunden: Rot-ON/Blau-und-Grün-OFF (12 Units) und Rot-OFF/Blau-und-Grün-ON (sieben Units). Es wurden verschiedene zeitliche Antwortmuster gefunden. Während einige Units nur Reizwechsel beantworteten, zeigten die meisten Units ein tonisches Antwortverhalten. Manche Units beantworteten jeden Stimuluswechsel phasisch und darüber hinaus bestimmte Stimuli tonisch. Die meisten tectalen Neurone zeigten eine Grundaktivität. Alle Units, denen sowohl der Farb- als auch der Bewegungsstimulus gezeigt wurden, antworteten nur auf eine Stimulusart. rnDiese Ergebnisse lassen folgende Schlüsse zu: Die Verarbeitung von Farbe und Bewegung im Tectum opticum des Goldfischs wird über zwei unterschiedlichen Verarbeitungswegen geleistet, da alle Units entweder auf Farb- oder auf Bewegungsstimuli antworten. Das Bewegungssehen wird im Goldfisch durch nur einen Zapfentyp (M- oder L-Zapfen) vermittelt und ist somit “farbenblind”, da alle bewegungssensitiven Units die Aktivität einstellten, wenn der Stimulus nur noch einen Zapfentyp modulierte. Es scheint spezifische Areale für „Farbe“ und „Bewegung“ im Tectum opticum des Goldfisches zu geben, da bewegungssensitive Units bevorzugt im posterio-medialen Bereich in einer Tiefe zwischen 200-400 µm gefunden und farbspezifische Units vor allem im anterio-medialen Bereich entdeckt wurden.

Uptake mechanism, intracellular trafficking and endo-lysosomal pH monitoring of polystyrene nanoparticles

What is the intracellular fate of nanoparticles (NPs) taken up by the cells? This question has been investigated for polystyrene NPs of different sizes with a set of molecular biological and biophysical techniques.rnTwo sets of fluorescent NPs, cationic and non-ionic, were synthesized with three different polymerization techniques. Non-ionic particles (132 – 846 nm) were synthesized with dispersion polymerization in an ethanol/water solution. Cationic NPs with 120 nm were synthesized by miniemulsion polymerization Particles with 208, 267 and 603 nm were produced by seeding the 120 nm particle obtained by miniemulsion polymerization with drop-wise added monomer and polymerization of such. The colloidal characterization of all particles showed a comparable amount of the surface groups. In addition, particles were characterized with regard to their size, morphology, solid content, amount of incorporated fluorescent dye and zeta potential. The fluorescent intensities of all particles were measured by fluorescence spectroscopy for calibration in further cellular experiments. rnThe uptake of the NPs to HeLa cells after 1 – 24 h revealed a much higher uptake of cationic NPs in comparison to non-ionic NPs. If the same amount of NPs with different sizes is introduced to the cell, a different amount of particles is present in the cell medium, which complicates a comparison of the uptake. The same conclusion is valid for the particles’ overall surface area. Therefore, HeLa cells were incubated with the same concentration, amount and surface area of NPs. It was found that with the same concentration always the same polymer amount is taking up by cells. However, the amount of particles taken up decreases for the biggest. A correlation to the surface area could not be found. We conclude that particles are endocytosed by an excavator-shovel like mechanism, which does not distinguish between different sizes, but is only dependent on the volume that is taken up. For the decreased amount of large particles, an overload of this mechanism was assumed, which leads to a decrease in the uptake. rnThe participation of specific endocytotic processes has been determined by the use of pharmacological inhibitors, immunocytological staining and immunofluorescence. The uptake of NPs into the endo-lysosomal machinery is dominated by a caveolin-mediated endocytosis. Other pathways, which include macropinocytosis and a dynamin-dependent mechanism but exclude clathrin mediated endocytosis, also occur as competing processes. All particles can be found to some extent in early endosomes, but only bigger particles were proven to localize in late endosomes. No particles were found in lysosomes; at least not in lysosomes that are labeled with Lamp1 and cathepsin D. However, based on the character of the performed experiment, a localization of particles in lysosomes cannot be excluded.rnDuring their ripening process, vesicles undergo a gradual acidification from early over late endosomes to lysosomes. It is hypothesized that NPs in endo-lysosomal compartments experience the same change in pH value. To probe the environmental pH of NPs after endocytosis, the pH-sensitive dye SNARF-4F was grafted onto amino functionalized polystyrene NPs. The pH value is a ratio function of the two emission wavelengths of the protonated and deprotonated form of the dye and is hence independent of concentration changes. The particles were synthesized by the aforementioned miniemulsion polymerization with the addition of the amino functionalized copolymer AEMH. The immobilization of SNARF-4F was performed by an EDC-coupling reaction. The amount of physically adsorbed dye in comparison to covalently bonded dye was 15% as determined by precipitation of the NPs in methanol, which is a very good solvent for SNARF-4F. To determine influences of cellular proteins on the fluorescence properties, a intracellular calibration fit was established with platereader measurements and cLSM imaging by the cell-penetrable SNARF-4F AM ester. Ionophores equilibrated the extracellular and intracellular pH.rnSNARF-4F NPs were taken up well by HeLa cells and showed no toxic effects. The pH environment of SNARF-4F NPs has been qualitatively imaged as a movie over a time period up to 1 h in pseudo-colors by a self-written automated batch program. Quantification revealed an acidification process until pH value of 4.5 over 24 h, which is much slower than the transport of nutrients to lysosomes. NPs are present in early endosomes after min. 1 h, in late endosomes at approx. 8 h and end up in vesicles with a pH value typical for lysosomes after > 24 h. We therefore assume that NPs bear a unique endocytotic mechanism, at least with regards to the kinetic involvedrn