Strukturelle, enzymkinetische und thermodynamische Untersuchungen am KLH, dem Hämocyanin der Schlüssellochschnecke Megathura crenulata

Hämocyanine sind große, kupferhaltige Sauerstoff-Transportproteine, die bei zahlreichen Schnecken extrazellulär in der Hämolymphe vorkommen. Das Keyhole Limpet-Hämocyanin (KLH) der Schlüssellochschnecke Megathura crenulata dient aufgrund seiner immunstimu-latorischen Eigenschaften seit vielen Jahren als Modellprotein in der Immunologie. In der Klinik wird es als Hapten- und Vakzincarrier sowie als Medikament gegen oberflächliche Harnblasenkarnzinome eingesetzt. Die Quartärstruktur des KLH besteht aus einem Hohl-zylinder mit einer Molekülmasse von 8 MDa und einem Durchmesser von 35 nm. Dieses sogenannte Didekamer setzt sich aus 20 Untereinheiten mit jeweils 400 kDa zusammen. Jede Untereinheit lässt sich weiter in acht funktionelle Einheiten a bis h (engl. Functional Units = FU) mit ~ 50 kDa unterteilen. Die FUs a bis f bilden die Wandregion des Moleküls, während der Kragen aus den FUs g und h geformt wird. Die Struktur der Wandregion sowie der FU-g konnte bisher bereits durch Röntgenstrukturanalysen aufgeklärt werden. Bezüglich der Struktur der FU-h, die sich durch eine spezielle C-terminale Verlängerung von ~ 100 Amino-säuren auszeichnet, sind allerdings noch keine Informationen verfügbar. Um die Architektur des Kragens zu verstehen, wurden im Rahmen dieser Arbeit zunächst Strategien entwickelt, diese spezielle FU in großer Menge und Reinheit zu isolieren. Anschließend konnten Bedingungen gefunden werden, die zur Ausbildung 0,2 mm großer, hexagonaler Kristalle führten. Diese ergaben am Synchrotron eine Auflösung von 4 Å. Durch Auswertung der Röntgenstrukturdaten konnte für die C-terminale Zusatzdomäne der FU-h eine Cupredoxin-ähnliche Typ I-Kupferfaltung ermittelt werden. Der Nachweis eines zusätzlichen Kupfer-atoms innerhalb dieser Domäne bedarf allerdings einer höheren Auflösung der Kristall-struktur. Hämocyanine lassen sich aufgrund ihrer evolutionären Verwandtschaft zu Phenol-oxidasen mit Hilfe verschiedener in vitro-Aktivatoren zur Catecholoxidase und teilweise auch zur Tyrosinase aktivieren. Beim KLH konnte in dieser Arbeit eine eindeutige Diphenolase- und sogar eine schwache Monophenolase-Aktivität der FUs-a und -f nach SDS-Aktivierung nachgewiesen werden. Zudem konnte eine geringfügige intrinsische Diphenolase-Aktivität dieser FUs belegt werden. Die enzymatischen Reaktionen waren sowohl von der gewählten Puffersubstanz, als auch der Anwesenheit bivalenter Kationen abhängig. Tris wirkt vermutlich als allosterischer Effektor und steigerte den Substrat-Umsatz, während Mg2+-Ionen zu einer starken Inhibition der katalytischen Aktivität führten. Die Klärung einer möglichen physiologischen Funktion der Phenoloxidase-Aktivität des KLH sowie potenziellen in vivo-Aktivatoren steht noch aus. Studien zur thermischen Stabilität des KLH resultierten in einer irreversiblen Denaturierung des Proteins. Die Schmelzpunkte deuteten auf eine hohe Tempe-raturstabilität des KLH, vor allem in Anwesenheit bivalenter Kationen. Eine Hämocyanin-typische Abhängigkeit der Hitzeresistenz vom Oligomerisierungsgrad ließ sich nicht feststellen, da sowohl bei der FU-h als auch den KLH-Didekameren eine vergleichbar hohe thermische Stabilität, bei einer nach wie vor vorhandenen Oxygenierung beobachtet wurde.

3D-Strukturanalyse von Molluskenhämocyaninen aus elektronenmikroskopischen Bildern

Diese Arbeit präsentiert die bislang höchst aufgelösten KryoEM-Strukturen für ein Cephalopoden hämocyanin Dekamer (Nautilus pompilus Hämocyanin, NpH) und ein Gastropoden Hämocyanin Didekamer (keyhole limpet hemocyanin isoform 1). Durch die Methoden des “molecular modelling” und “rigid-body-fiting” wurde auch eine detaillierte Beschreibung beider Strukturen auf atomarem Niveau erstmalig möglich. Hämocyanine sind kupferhaltige Sauerstoff-Transportproteine die frei gelöst in Blut zahlreicher Arthropoden und Mollusken vorkommen. Allgemein sind Molluskenhämocyanine als Dekamere (Hohlzylinder aus 5 Untereinheiten-dimere) oder Didecamere (Zusammenlagerung von zwei Dekameren) zu finden. Durch Anlagerung weiterer Dekamere bilden sich teilweise tubuläre Multidekamere. Hämocyanine der Cephalopoden bestehen ausschließlich aus solitären Decameren. In Octopus und Nautilus bestehen die 10 Untereinheiten aus 7 funktionellen Einheiten(FU-a bis FU-g), wobei jede FU ein Sauerstoffmolekül binden kann. FUs a-f bilden die Wand des ringförmigen Moleküls und 10 Kopien der FU-g bilden einen sogenannten „inneren Kragenkomplex“. Das im Rahmen dieser Arbeit erstelltes molekulares Modell von NpH klärt die Struktur des Dekamers vollständig auf. Wir waren zum ersten Mal in der Lage das Untereinheiten-dimer, den Verlauf der Polypeptidkette und 15 unterschiedliche Kontaktstellen zwischen FUs zu identifizieren. Viele der inter-FU-Kontakte weisen Aminosäurenkonstellationen auf, die die Basis für die Übertragung allosterischer Wechselwirkungen zwischen FUs darstellen könnten und Hinweise für den Aufbau der allosterische Einheit geben. Potentielle Bindungsstellen für N-glykosidische Zucker und bivalente Kationen wurden auch identifiziert. Im Gegensatz zu NpH, kommen Gastropoden Hämocyanine (inkl. KLH) hauptsächlich als Didekamere vor und der Kragenkomplex wird in diesem Fall aus 2 FUs gebildet (Fu-g und FU-h). Die zusätzliche C'-terminale FU-h zeichnet sich durch eine spezielle Verlängerung von ~ 100 Aminosäuren aus. KLH stammt aus der kalifornische Schnecke Megathura crenulata und kommt seit mehreren Jahrzehnten als Immunostimulator in der immunologischen Grundlagenforschung und klinischen Anwendung zum Einsatz. KLH weist zwei Isoformen auf, KLH1 und KLH2. Das vorliegende Modell von KLH1 erlaubt die komplexe Architektur dieses riesigen Proteins in allen Details zu verstehen, sowie einen Vergleich zum dem NpH Dekamer auf atomare Ebene. Es wurde gefunden, dass das Untereinheitensegment a-b-c-d-e-f-g, sowie die equivalenten Kontaktstellen zwichen FUs stark konserviert sind. Dies deutet darauf hin, dass in Bezug auf die Übertragung allosterische Signale zwischen benachbarten FUs, grundlegende Mechanismen in beiden Molekülen beibehalten wurden. Weiterhin, konnten die Verbindungen zwischen den zwei Dekameren ertsmalig identifiziert werden. Schließlich, wurde die Topologie der N-glycosidischen Zucker, welche für die immunologische Eigenschaften von KLH1 von großer Bedeutung sind, auch aufgeklärt. Somit leistet die vorliegende Arbeit einen wesentlichen Schritt zum Verständnis der Quartärstruktur und Funktion der Molluskenhämocyanine.rn

Gene therapy for a novel mouse model of Canavan disease

Canavan disease (CD) is a rare leukodystrophy caused by loss-of-function mutations in the gene encoding aspartoacylase (ASPA), an oligodendrocyte-enriched enzyme. It is characterised by the accumulation of the ASPA substrate N-acetylaspartate (NAA) in brain, blood and urine, leading to a spongiform vacuolisation of the brain, severe motoric and cognitive impairments and premature death. To date, no therapy is available due to the lack of a gene-transfer system allowing transgene expression in oligodendrocytes (OLs) and the restoration of the missing enzyme. Hence, the aim of this study was to establish a novel gene-transfer system and its preclinical evaluation in a CD animal model.rnIn the first part of this thesis, a novel ASPA mouse mutant was generated. A βgeo cassette (including the genes encoding β-galactosidase and neomycin) flanked by frt sites was inserted into intron 1 of the intact aspa gene. Additionally, exon 2 was flanked by loxP sites for optional conditional deletion of the targeted locus. The resulting ASPA-deficient aspalacZ/lacZ-mouse was found to be an accurate model of CD and an important tool to identify novel aspects of its complex pathology. Homozygous mutants showed a CD-like histopathology, neurological impairment, behavioural deficits as well as a reduced body weight. Additionally, MRI data revealed changes in brain metabolite composition. rnRecombinant adeno-associated viral (rAAV) vectors have become a versatile tool for gene transfer to the central nervous system because they are efficient, non-toxic and replication-deficient. Based on the natural neurotropism of AAV vectors, AAV-based gene delivery has entered the clinics for the treatment of neurodegenerative diseases. However, the lack of AAV vectors with oligodendroglial tropism has precluded gene therapy for leukodystrophies. In the second part of this work, it was shown that the transduction profile of established AAV serotypes can be targeted towards OLs in a transcriptional approach, using the oligodendrocyte-specific myelin basic protein (MBP) promoter to drive transgene expression in OLs.rnIn the last part of this work, the therapeutic efficacy of AAV-mediated aspa gene transfer to OLs of juvenile aspalacZ/lacZ mice was evaluated. AAV-aspa injections into multiple sites of the brain parenchyma resulted in transduction of OLs in the grey and white matter throughout the brain. Histological abnormalities in the brain of ASPA-deficient mice were ameliorated and accompanied by a reduction of NAA levels. Furthermore, the treatment resulted in normalisation of body weight, motor function and nest-building behaviour. These data provide a proof-of-concept for a successful gene therapy of Canavan disease. This might pave the way towards translation into clinical application and serve as the basis for the genetic treatment of other leukodystrophies.

Molekulare Epidemiologie von MRSA-Patienten-Isolaten

MRSA ist der wohl bekannteste nosokomiale Infektionserreger weltweit. Die aktuelle Situation ist aufgrund der schnellen Ausbreitung, vor allem von caMRSA, in einigen Ländern besorgniserregend. Für den Raum Mainz konnte innerhalb der fünf Untersuchungsjahre eine stabile Populationsstruktur nachgewiesen werden, welche hauptsächlich aus deutschlandweit bekannten Epidemiestämmen gebildet wird. Als Besonderheit ergab sich die Dominanz des spa-Typs t003 (> 70 %), sowie das Vorherrschen hoch klonaler Strukturen an UMM und KKM. Diese Umstände lassen auf eine weite Verbreitung von MRSA, speziell des spa-Typs t003, innerhalb der Bevölkerung schließen. Die Bestätigung dieser Vermutung bedarf jedoch weiterer prospektiver Forschung außerhalb der Kliniken.rnAn der UMM konnte im Untersuchungszeitraum 2004-2008 keine Zunahme von klassischen PVL-positiven caMRSA (t008, t019 und t044) festgestellt werden, womit zumindest momentan noch keine Verdrängung von haMRSA durch caMRSA belegt werden konnte.rnDie von WITTE et al. (2004) postulierte 5 % Grenze für den häufigsten detektierten Typ einer Typisierungsmethode muss dahingehend modifiziert werden, dass diese Bedingung zwar allgemein für ein Typisierungsverfahren, nicht aber für lokale Populationen gelten sollte. Im Falle des Vorherrschens klonaler Linien und Subtypen würde keine Methode ausreichend diskriminatorische Eigenschaften aufweisen.rnDie Kombination von spa-Typisierung und PFGE konnte, mit Einschränkungen für den vorherrschenden t003, als geeignet im Falle der Keimdifferenzierung während eines Ausbruchs befunden werden. Als vorteilig für die Interpretation würde sich die Einführung eines generellen MRSA-Screenings für jeden Patienten bei Aufnahme auswirken.rnDie Überprüfung der Thesen von FRÉNAY et al. 1994 ergab keinen Zusammenhang zwischen einer X-Region ≥ 8 Repeats und einem erhöhtem Virulenzpotential. Bezüglich des gesteigerten epidemischen Potentials wurde festgestellt, dass lange X-Regionen generell häufiger auftreten als kurze und somit ein begünstigender Einfluss bei der Kolonisation vermutet aber nicht bewiesen werden kann.rnFür die Detektion von klassischen caMRSA konnte ein Ablaufschema mit Interpretationsrichtlinien erarbeitet werden, welches eine korrekte Differenzierung auch ohne die Einbeziehung patientenbezogener Daten ermöglicht. Die Anlage einer lokalen PFGE-Datenbank zeigte sich dabei als unbedingt notwendig um strittige Fälle als ha- oder caMRSA einzuordnen.rn

Einfluss einer indirekten pharmazeutischen Betreuung auf klinische und soziale Ergebnisse bei ambulant mit Chemotherapie behandelten Tumorpatienten

Krebspatienten, die eine Chemotherapie erhalten, leiden häufig an schwerwiegenden unerwünschten Arzneimittelwirkungen, wie z.B. Übelkeit und Erbrechen, welche nachweislich durch eine geeignete Supportivmedikation und durch eine direkte pharmazeutische Betreuung gesenkt werden können.rnIn dieser Arbeit wurde in einer prospektiven, nicht-interventionellen multizentrischen Studie untersucht, ob ambulant behandelte Mamma- und Colon-Carcinom-Patienten während der Chemotherapie Vorteile durch eine indirekte pharmazeutische Betreuung (Mitgabe einer schriftlichen Patienteninformation und der Begleitmedikamente) haben. Primäres Ziel der Studie war eine Reduktion von Häufigkeit und Schweregrad ausgewählter UAW, sekundäre Ziele waren die Verbesserung der Lebensqualität, der Patientenzufriedenheit und des Patientenwissens zur Therapie und Begleitmedikation. Die Daten wurden mittels vier verschiedener Patienten-Fragebögen in Form von Telefoninterviews zu drei verschiedenen Zeitpunkten der Chemotherapie erhoben.rnInsgesamt konnten 106 Patienten vom St.-Johannes-Hospital in Dortmund und von der Universitätsmedizin Mainz in die Studie eingeschlossen werden. Die UAW nach Häufigkeit und Schweregrad gemäß CTC konnten durch eine indirekte pharmazeutische Betreuung zu allen drei Zeitpunkten der Datenerfassung z.T. signifikant gesenkt werden. Eine Verbesserung konnte auch bei allen humanistischen Ergebnisparametern (Patientenwissen, Lebensqualität, Patientenzufriedenheit) beobachtet werden. Auf Grund der relativ kleinen, nicht vollständig rekrutierten Kontrollgruppe und den unterschiedlichen Rahmenbedingungen an den teilnehmenden Kliniken, sind weitere vergleichende Untersuchungen erforderlich, um den Nutzen einer indirekten pharmazeutischen Betreuung weiter zu belegen. rn