Chemische und enzymatische Synthese von orthogonal stabil geschützten Kohlenhydrat-Scaffolds für kombinatorische Anwendungen

Auf der Suche nach potenten pharmakologischen Wirkstoffen hat die Kombinatorische Chemie in der letzten Dekade eine große Bedeutung erlangt, um innerhalb kurzer Zeit ein breites Spektrum von Verbindungen für biologische Tests zu erzeugen. Kohlenhydrate stellen als Scaffolds interessante Kandidaten für die kombinatorische Synthese dar, da sie mehrere Derivatisierungspositionen in stereochemisch definierter Art und Weise zur Verfügung stellen. So ist die räumlich eindeutige Präsentation angebundener pharmakophorer Gruppen möglich, wie es für den Einsatz als Peptidmimetika wünschenswert ist. Zur gezielten Derivatisierung einzelner Hydroxylfunktionen ist der Einsatz eines orthogonalen Schutz-gruppenmusters erforderlich, das gegenüber den im Lauf der kombinatorischen Synthese herrschenden Reaktionsbedingungen hinreichend stabil ist. Weiterhin ist ein geeignetes Ankersystem zu finden, um eine Festphasensynthese und damit eine Automatisierung zu ermöglichen.Zur Minimierung der im Fall von Hexosen wie Galactose benötigten fünf zueinander orthogonal stabilen Schutzgruppen wurde bei der vorliegenden Arbeit von Galactal ausgegangen, bei dem nur noch drei Hydroxylfunktionen zu differenzieren sind. Das Galactose-Gerüst kann anschließend wiederhergestellt werden. Die Differenzierung wurde über den Einsatz von Hydrolasen durch regioselektive Acylierungs- und Deacylierungs-reaktionen erreicht, wobei auch immobilisierte Enzyme Verwendung fanden. Dabei konnte ein orthogonales Schutzgruppenmuster sequentiell aufgebaut werden, das auch die nötigen Stabilitäten gegenüber sonstigen, teilweise geeignet modifizierten Reaktionsbedingungen aufweist. Für die Anbindung an eine Festphase wurde ein metathetisch spaltbarer Anker entwickelt, der über die anomere Position unter Wiederherstellung des Galactose-Gerüsts angebunden wurde. Auch ein oxidativ spaltbares und ein photolabiles Ankersystem wurden erprobt.

Selektiv deblockierbare 2,6-Diamino-2,6-didesoxy-D-glucose-Scaffolds für die kombinatorische Synthese potentieller RNA-Liganden

Aminoglydosid-Antibiotika wie Neomycin B oder Cyclopeptid-Antibiotike wie Viaomycin sind dafür bekannt, daß sie selektiv an RNA binden können. Diese Interaktionen beruhen sowohl auf elektrostatischen Wechselwirkungen als auch auf H-Brücken-Bindungen. Des weiteren ist die definierte räumliche Anordnung von Donor- und Akzeptor-Resten in den Strukturen der RNA-Liganden wichtig für die Affinität. Eine Möglichkeit natürliche RNA-Liganden zu imitieren ist der Einsatz polyfunktioneller Template wie zum Beispiel das 2,6-Diamino-2,6-didesoxy-D-glucose-Scaffold. Mit Hilfe dieser Scaffolds können dann verschiedene positv geladene Reste und Donatoren sowie Akzeptoren für H-Brücken-Bindungen oder auch Interkalatoren räumlich definiert präsentiert werden. Für die unabhängige Funktionalisierung einer jeden Position ist ein Satz orthogonal stabiler Schutzgruppen nötig, wobei eine Hydroxylguppe durch einen Anker ersetzt wird, der eine Anbindung des Scaffolds an einen polymeren Träger ermöglicht. Das neu entwickelte 2,6-Diamino-2,6-didesoxy-D-glucose-Scaffold ist das erste Monosaccharid-Templat, das in allen fünf Positionen mit orthogonal stabilen Schutzgruppen blockiert ist. Alle Positionen könne in beliebiger Reihenfolge selektiv deblockiert und anschließend derivatisiert werden. Das Scaffold kann mit Aminosäuren, Guanidinen oder Interkalatoren umgesetzt werden, um so natürlich vorkommende RNA-bindende Aminoglycoside oder Peptide zu imitieren. Aufbauend auf diesem Monosaccharid-Templat wurde eine Bibliothek von über 100 potentiellen RNA-Liganden synthetisiert, die im Rahmen des Sonderforschungsbereichs 579 (RNA-Liganden-Wechselwirkungen) in Zellassays auf ihre Fähigkeit zur Hemmung der Tat/TAR-Wechselwirkung untersucht wurden, wobei bis jetzt 9 Verbindungen mit einer hemmenden Wirkung im micromolaren Bereich gefunden wurden.

Selektiv deblockierbare Diamino-D-Galactose-Scaffolds für die kombinatorische Synthese potentieller RNA-Liganden

Die Aufklärung der Schlüsselrolle der RNA in zahlreichen biologischen Prozessen, die sich aus ihren selektiven Wechselwirkungen mit anderen RNA-Molekülen, Proteinen, Peptiden bzw. Antibiotika ergibt, ist für die Wirkstoffforschung von großer Bedeutung. Die Aminoglycoside und Antibiotika, die durch eine Hemmung der Proteinbiosynthese schon seit längerem bekannt sind, dienen als Leitstrukuren für die Synthese von weiteren Wirkstoffen. Die meisten Aminoglycosid-Antibiotika beinhalten Aminozucker, die mit dem rn2-Desoxystreptamin-Gerüst verbunden sind. Die stereochemische Vielfalt der Substitutionsstellen für Amino- und Hydroxylgruppen in diesem Gerüst und deren beschränkte konformative Flexibilität bieten vielseitige Möglichkeiten, um potenzielle RNA-Liganden so zu gestalten, dass es zu einer spezifischen Erkennung von RNA-Strukturen kommen kann. Ein wichtiger Vertreter dieser Antibiotika, Neomycin B, von dessen Struktur die Entwicklung des Diaminogalactose-Templates abgeleitet wurde, wurde in dieser Arbeit als Leitstruktur gewählt. Die Synthese von Diaminogalactose-Scaffolds wurde zunächst in Lösung durchgeführt. Anschließend wurden die Bausteine 2 und 4 an einen polymeren Träger gebunden.rnNach Prüfung der orthogonalen Stabilität der Schutzgruppen wurde mit den Scaffolds 2 und 4 eine Bibliothek von 65 Verbindungen hergestellt. Mit 42 dieser Verbindungen wurden anschließend Zellassays im Rahmen des Sonderforschungsbereichs 579 (RNA-Liganden-Wechselwirkungen) durchgeführt, um ihre Cytotoxizität zu prüfen. Für einzelne Verbindungen konnten die optimalen Konzentrationen bestimmt werden, bei denen zukünftige Tests für die Tat/TAR Wechselwirkung ohne störende cytotoxische Effekte durchgeführt werden können.rn

Serumfreie Collagen-Monolayer- und Sandwich-Kulturen primärer Hepatozyten als ein wertvolles Modell zur Detektion von Toxizität und Arzneimittelwechselwirkungen in vitro

In dieser Arbeit wurden Zellkulturen primärer Hepatozyten von Ratte und Mensch hinsichtlich ihrer Eignung untersucht Speziesunterschiede der toxischen Wirkung und des Metabolismus von Substanzen darzustellen und inwieweit die in vitro-Ergebnisse in vivo vergleichbar bzw. übertragbar sind. Des Weiteren wurde ein Zellkulturmodell entwickelt, das eine Kultivierung von primären Hepatozyten aus Ratte, Mensch und Maus über einen Zeitraum von mindestens einer bis zwei Wochen erlaubt.rnrnDie Zellkulturen primärer Hepatozyten von Ratte und Mensch zeigten deutliche Unterschiede in der substanzinduzierten Veränderung der Genexpression nach Behandlung mit den, vor allem für den Menschen, lebertoxischen Substanzen Diclofenac und Troglitazon. Diese Unterschiede traten hauptsächlich in der Induktion fremdstoffmetabolisierender Enzyme sowie deren transkriptionsregulierenden Kernrezeptoren in den humanen Hepatozyten auf. Ebenso war eine verstärkte Stressantwort zu beobachten.rnDeutliche Speziesunterschiede konnten ebenso in der Wirkung der Arzneimittelentwicklungssubstanz EMD 392949 auf die Aktivität bzw. Genexpression von Cytochrom P450 Enzymen sowie deren Regulatoren nachgewiesen werden. Des Weiteren konnte hier eine sehr gute Übereinstimmung der Ergebnisse aus den Zellkulturen primärer Ratten- bzw. Humanhepatozyten mit jenen aus in vivo-Experimenten mit Ratten bzw. Affen (Macaca fascicularis) beobachtet werden, was die Aussagekraft der Primärkulturen verdeutlichte.rnDie große Übereinstimmung zwischen Enzymaktivität und Genexpression in der Induktion fremdstoffmetabolisierender Enzyme konnte durch die Behandlung mit einer Reihe speziesspezifischer Induktoren in Zellkulturen primärer Ratten- bzw. Humanhepatozyten bestätigt werden; vor allem nach dem von der amerikanischen Arzneimittelzulassungsbehörde (FDA, Food and Drug Administartion) vorgeschlagenen Bewertungsschema zur Untersuchung der CYP-Induktion.rnrnDie Lebensdauer sowie der Differenzierungsgrad von primären Hepatozyten in Kultur sind stark abhängig von den Zellkulturbedingungen. Durch diese Arbeit konnte gezeigt werden, dass spezifische Eigenschaften von Rattenleberzellen durch Kultivierung in einem Sandwich aus zwei hydratisierten Collagengelschichten und unter serumfreien Bedingungen für einen Zeitraum von mindestens zwei Wochen aufrechterhalten werden können. Dieses Kulturmodel konnte auf Primärhepatozyten von Mensch und Maus übertragen werden und erweitert die möglichen Anwendungen hin zu einer Behandlung über einen längeren Zeitraum und der Untersuchung von subchronischen Effekten.rn

Differentiation and extracellular matrix interactions of chondrocytes in response to signaling molecules and biomaterials for cartilage repair = Differenzierung und Interaktionen von Chondrozyten mit der extrazellulären Matrix als Reaktion auf Signalmoleküle und Biomaterialien für die Wiederinstandsetzung von Knorpel

Chondrocytes live isolated in the voluminous extracellular matrix of cartilage, which they secrete and is neither vascularized nor innervated. Nutrient and waste exchanges occur through diffusion leading to low oxygen tension around the cells. Consequently even normal cartilage under normal physiological conditions suffers from a poor reparative potential that predisposes to degenerative conditions, such as osteoarthritis of the joints, with significant clinical effects.rnOne of the key challenges in medicine is the structural and functional replacement of lost or damaged tissues. Current therapeutical approaches are to transplant cells, implant bioartificial tissues, and chemically induce regeneration at the site of the injury. None of them reproduces well the biological and biomechanical properties of hyaline cartilage.rnThis thesis investigates the re-differentiation of chondrocytes and the repair of cartilage mediated by signaling molecules, biomaterials, and factors provided in mixed cellular cultures (co-culture systems). As signaling molecules we have applied prostaglandin E2 (PGE2) and bone morphogenetic protein 1 (BMP-1) and we have transfected chondrocytes with BMP-1 expressing vectors. Our biomaterials have been hydrogels of type-I collagen and gelatin-based scaffolds designed to mimic the architecture and biochemistry of native cartilage and provide a suitable three-dimensional environment for the cells. We have brought chondrocytes to interact with osteosarcoma Cal 72 cells or with murine preosteoblastic KS483 cells, either in a cell-to-cell or in a paracrine manner.rnExogenous stimulation with PGE2 or BMP-1 did not improve the differentiation or the proliferation of human articular chondrocytes. BMP-1 induced chondrocytic de-differentiation in a dose-dependent manner. Prostaglandin stimulation from gelatin-based scaffolds (three-dimensional culture) showed a certain degree of chondrocyte re-differentiaton. Murine preosteoblastic KS483 cells had no beneficial effect on human articular chondrocytes jointly cultivated with them in hydrogels of type I collagen. Although the hydrogels provided the chondrocytes with a proper matrix in which the cells adopted their native morphology; additionally, the expression of chondrocytic proteoglycan increased in the co-cultures after two weeks. The co-culture of chondrocytes with osteoblast-like cells (in transwell systems) resulted in suppression of the regular de-differentiation program that passaged chondrocytes undergo when cultured in monolayers. Under these conditions, the extracellular matrix of the chondrocytes, rich in type-II collagen and aggrecan, was not transformed into the extracellular matrix characteristic of de-differentiated human articular chondrocytes, which is rich in type-I collagen and versican.rnThis thesis suggests novel strategies of tissue engineering for clinical attempts to improve cartilage repair. Since implants are prepared in vitro (ex-vivo) by expanding human articular chondrocytes (autologous or allogeneic), we conclude that it will be convenient to provide a proper three-dimensional support to the chondrocytes in culture, to supplement the culture medium with PGE2, and to stimulate chondrocytes with osteoblastic factors by cultivating them with osteoblasts.rn