Transformation von Osteospermum ecklonis mit Konstrukten zur Induktion von Virusresistenz und Blühverfrühung

Für die Etablierung einer Transformationsmethode züchterisch relevanter Sorten von Osteospermum ecklonis (Kapmargerite) wurde zunächst ein geeignetes Protokoll für die Regeneration adventiver Sprosse aus vegetativem Gewebe entwickelt. Anschließend wurden Transformationen von Markergenen durch Kokultur mit Agrobacterium tumefaciens durchgeführt. Hierzu wurden Konstrukte verwendet, die das Gen für ß-D-Glucuronidase (GUS) enthielten und deren Expression in transgenen Pflanzen histochemisch nachgewiesen werden konnte. Kanamycinresistenz erwies sich als geeigneter Selektionsmarker für die Transformation. Es konnten von verschiedenen O. ecklonis Sorten GUS-transgene, nicht-chimäre Pflanzen regeneriert werden.Zur Erzeugung transgener Pflanzen mit dem Ziel der Resistenz gegen LMV (lettuce mosaic potyvirus, Salat Mosaik Virus) wurden drei Konstrukte verwendet. Das erste enthält die kodierende Sequenz der Virusproteine VPg, Pro und 6K2. Durch PCR-Mutation wurde die Proteinase-Schnittstelle zwischen 6K2 und VPg zerstört, sowie Start- und Stopcodon eingeführt. Die anderen LMV-abgeleiteten Konstrukte enthalten nicht translatierbare Fragmente des coat protein Gens in sense und antisense Orientierung.Außerdem wurde O. ecklonis noch mit dem Gen des mutmaßlichen Transkriptionsfaktor SPL3 aus Arabidopsis thaliana unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors transformiert. SPL3 ist an der Regulierung der Blüteninduktion in A. thaliana beteiligt.Regenerierte O. ecklonis wurden durch PCR mit konstruktspezifischen Primern auf Anwesenheit des Transgens und Kontamination durch A. tumefaciens überprüft.

Lichtsammler hinter Glas : Stabilisierung und Funktionalisierung des pflanzlichen Hauptlichtsammelkomplexes (LHCII) durch biomineralische Einbettung in Nanopartikel

Der Haupt-Lichtsammelkomplex des Fotosystems II (LHCII) setzt sich aus einem Proteinanteil und nicht-kovalent gebundenen Pigmenten – 8 Chlorophyll a, 6 Chlorophyll b und 4 Carotinoide - zusammen. Er assembliert in vivo zu einem Trimer, in dem die Monomereinheiten ebenfalls nicht-kovalent miteinander wechselwirken. Die ausgesprochen hohe Farbstoffdichte und die Tatsache, dass der Komplex rekombinant hergestellt werden kann, machen den LHCII zu einem interessanten Kandidaten für technische Anwendungen wie einer Farbstoffsolarzelle. Allerdings muss hierzu seine thermische Stabilität drastisch erhöht werden.rnDer Einschluss von Proteinen/Enzymen in Silikat erhöht deren Stabilität gegenüber Hitze signifikant. LHCII sollte als erster rekombinanter Membranproteinkomplex mittels kovalent verbundener, polykationischen Sequenzen in Silikat eingeschlossen werden. Hierzu wurde der Komplex auf zwei Weisen polykationisch modifiziert: Auf Genebene wurde die Sequenz des R5-Peptids in den N-terminalen Bereich des LHCP-Gens eingeführt und ein Protokoll zur Überexpression, Rekonstitution und Trimerisierung etabliert. Außerdem wurde eine kovalente Modifikation des trimeren LHCII mit dem Arginin-reichen Protamin über heterobifunktionelle Crosslinker entwickelt. Beide resultierenden LHCII-Derivate waren in der Lage, Silikat autogen zu fällen. Die Stabilisierung der so in Silikat präzipitierten Komplexe war jedoch deutlich geringer als bei nicht-modifizierten Komplexen, die durch eine Spermin-induzierte Copräzipitation eingeschlossenen wurden. Dabei zeigte sich, dass für den Anteil der eingebauten Komplexe und das Ausmaß an Stabilisierung die Größe und klare partikuläre Struktur des Silikats entscheidend ist. Kleine Partikel mit einem Durchmesser von etwa 20 nm führten zu einem Einbau von rund 75 % der Komplexe, und mehr als 80 % des Energietransfers innerhalb des Komplexes blieben erhalten, wenn für 24 Stunden bei 50°C inkubiert wurde. Nicht in Silikat eingeschlossene Komplexe verloren bei 50°C ihren Komplex-internen Energietransfer binnen weniger Minuten. Es war dabei unerheblich, ob die Partikelgröße durch die Wahl des Puffers und des entsprechenden pH-Wertes, oder aber durch Variation des Spermin-zu-Kieselsäure-Verhältnisses erreicht wurde. Wurden die polykationisch veränderten Komplexe in solchen Copräzipitationen verwendet, so erhöhte sich der Anteil an eingebauten Komplexen auf über 90 %, jedoch wurde nur bei der R5-modifizierten Variante vergleichbare Ausmaße an Stabilisierung erreicht. Ein noch höherer Anteil an Komplexen wurde in das Silikatpellet eingebaut, wenn LHCII kovalent mit Silanolgruppen modifiziert wurde (95 %); jedoch war das Ausmaß der Stabilisierung wiederum geringer als bei einer Copräzipitation. Die analysierten Fällungssysteme waren außerdem in der Lage, Titandioxid zu fällen, wobei der Komplex in dieses eingebaut wurde. Allerdings muss das Stabilisierungspotential hier noch untersucht werden. Innerhalb eines Silikatpräzipitats aggregierten die Komplexe nicht, zeigten aber einen inter-trimeren Energietransfer, der sehr wahrscheinlich auf einem Förster Resonanz Mechanismus basiert. rnDies und das hohe Maß an Stabilisierung eröffnen neue Möglichkeiten, rekombinanten LHCII in technischen Applikationen als Lichtsammelkomponente zu verwenden.rn