Transformation von Osteospermum ecklonis mit Konstrukten zur Induktion von Virusresistenz und Blühverfrühung

Für die Etablierung einer Transformationsmethode züchterisch relevanter Sorten von Osteospermum ecklonis (Kapmargerite) wurde zunächst ein geeignetes Protokoll für die Regeneration adventiver Sprosse aus vegetativem Gewebe entwickelt. Anschließend wurden Transformationen von Markergenen durch Kokultur mit Agrobacterium tumefaciens durchgeführt. Hierzu wurden Konstrukte verwendet, die das Gen für ß-D-Glucuronidase (GUS) enthielten und deren Expression in transgenen Pflanzen histochemisch nachgewiesen werden konnte. Kanamycinresistenz erwies sich als geeigneter Selektionsmarker für die Transformation. Es konnten von verschiedenen O. ecklonis Sorten GUS-transgene, nicht-chimäre Pflanzen regeneriert werden.Zur Erzeugung transgener Pflanzen mit dem Ziel der Resistenz gegen LMV (lettuce mosaic potyvirus, Salat Mosaik Virus) wurden drei Konstrukte verwendet. Das erste enthält die kodierende Sequenz der Virusproteine VPg, Pro und 6K2. Durch PCR-Mutation wurde die Proteinase-Schnittstelle zwischen 6K2 und VPg zerstört, sowie Start- und Stopcodon eingeführt. Die anderen LMV-abgeleiteten Konstrukte enthalten nicht translatierbare Fragmente des coat protein Gens in sense und antisense Orientierung.Außerdem wurde O. ecklonis noch mit dem Gen des mutmaßlichen Transkriptionsfaktor SPL3 aus Arabidopsis thaliana unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors transformiert. SPL3 ist an der Regulierung der Blüteninduktion in A. thaliana beteiligt.Regenerierte O. ecklonis wurden durch PCR mit konstruktspezifischen Primern auf Anwesenheit des Transgens und Kontamination durch A. tumefaciens überprüft.

Transformation of Osteospermum ecklonis with constructs for the induction of virus resistance and early flowering A protocol for the regeneration of adventious shoots was established for commercially-used Osteospermum ecklonis (cape daisy) varieties. Leaf discs were incubated with Agrobacterium tumefaciens and transformed with reporter genes like ß-D-glucuronidase (GUS), which were assessed histochemically in transgenic plant tissue. Kanamycin-resistance was used successfully as a selective marker for transgenic tissue. GUS-transgenic, non-chimeric O. ecklonis plants from different varieties were obtained.In order to obtain plants which are resistant against lettuce mosaic potyvirus (LMV), three constructs were used. One contained the coding sequence for the viral proteins VPg, Pro and 6K2. The internal proteinase cleavage site between 6K2 and VPg was destroyed via PCR-mutation of the cDNA. A start and a stop codon were also inserted via PCR. Two other virus-derived constructs contained untranslatable truncated fragments of the coat protein gene in sense and antisense orientation.O. ecklonis was also transformed with the gene of the putative transcription factor SPL3 from Arabidopsis thaliana under the control of a constitutive promotor. SPL3 is a regulator of the induction of flowering in A. thaliana.Regenerated O. ecklonis were tested by PCR with construct-specific primers for the presence of the transgene and contamination with A. tumefaciens.