Eine neue Form der Pyruvatkinase in Säugerspermien

Nach Homogenisation ejakulierter Eberspermien und Zentrifugation des Homogenates blieben mehr als 60% der Aktivität des glykolytischen Enzyms Pyruvatkinase (PK) an Zellfragmenten im Sediment gebunden. Diese strukturgebundene PK wurde als PK-S bezeichnet. Das Detergenz Triton X-100 führte nicht zur Ablösung der PK-S; mit Trypsin konnten jedoch rund 80% der PK-S ohne Verlust an Aktivität von den Strukturen gelöst und durch kombinierte Kationenaustausch- und Hydrophobizitätschromatographie gereinigt werden (spezifische Aktivität: 116,7 U/mg Protein). Die lösliche PK aus Eberspermien konnte ebenfalls durch ein ähnliches Verfahren angereichert werden. Im Gel (SDS-PAGE) zeigten die Untereinheiten der PK-S mit 64.400 eine geringfügig größere relative Molekülmasse als die der PK-M1 aus Kaninchenmuskel (62.000). Die kinetischen Eigenschaften der abgelösten PK-S als auch der noch an Spermienstrukturen gebundenen PK-S und der löslichen PK aus Eberspermien waren sehr ähnlich und entsprachen der M1-Isoform der PK. Antikörper gegen Kaninchenmuskel-PK (Anti-PK-M1) reagierten auch mit der löslichen PK und der PK-S aus Eberspermien. Edman-Abbau der ersten 19 Aminosäuren zeigte, dass die tryptisch abgelöste PK-S am N-Terminus um 5 Aminosäuren gegenüber nativer PK-M1 verlängert ist, während der C-Terminus der erhaltenen PK-S-Sequenz mit einem meist nahe dem N-Terminus gelegenen Sequenzabschnitt der PK-M1 und -M2 übereinstimmt. Die N-terminale Verlängerung der nativen PK-S enthält sicherlich mehr als die nach tryptischer Lyse nachgewiesenen 5 Aminosäuren. Vergleiche der Aminosäure- und übersetzten Nukleotidsequenzen sowie die kinetischen Eigenschaften lassen vermuten, dass die PK-S, wie die PK-M1 und PK-M2, vom PKM-Gen codiert wird. Gegen die gereinigte PK-S wurden Antikörper in Kaninchen produziert. Da das Antiserum nicht ausreichend spezifisch für PK-S war, wurden aus ihm affinitätschromatographisch Antikörper (Anti-PK-S) isoliert, die hohe Affinität zu einem synthetisierten PK-S-Peptid (13 N-terminale Aminosäuren der tryptisch abgelösten PK-S) hatten. Dieses Anti-PK-S-Präparat war spezifisch für PK-S; es reagierte weder mit Kaninchenmuskel-PK noch mit löslicher PK oder anderen Proteinen aus Eberspermien. Anti-PK-S und Anti-PK-M1 wurden zur Lokalisierung von PK-S und löslicher PK in Spermien von Eber, Bulle und Mensch sowie in Schnitten von Eberhoden eingesetzt. Mit Anti-PK-S wurden der Bereich des Akrosoms und das lange flagellare Hauptstück sowie der Übergangsbereich zwischen Kopf und Mittelstück von Eberspermien fluoreszenzmarkiert, wogegen das kurze, die Mitochondrien enthaltende Mittelstück des Flagellums und der postakrosomale Kopfbereich nur mit Anti-PK-M1 markiert wurden. Immunogoldmarkierung in elektronenmikroskopischen Bildern bestätigte die Lokalisierung von PK-S im Akrosombereich. Im Hauptstück banden Anti-PK-M1 und Anti-PK-S an die fibröse Scheide. Glyzerinaldehyd-3-phosphat Dehydrogenase (GAPDH) konnte von mir ebenfalls im Akrosombereich, im Übergangsbereich zwischen Kopf und Mittelstück und an der fibrösen Scheide detektiert werden. Auch an Bullen- und Humanspermien konnte über Immunogoldmarkierung PK und vermutlich GAPDH an der fibrösen Scheide gezeigt werden. Im Akrosombereich dieser Spermien waren die Nachweise von PK und GAPDH jedoch nicht sicher. In Eberhodenschnitten war die PK-S erstmals, oder zumindest vermehrt, in den elongierenden Spermatiden über Fluoreszenzmarkierung nachweisbar, während andere, vermutlich somatische PK vermehrt in den früheren Stadien (Spermatogonien, aber auch in den Spermatozyten und runden Spermatiden) auftrat. Für die GAPDH zeigte sich ein ähnlicher Entwicklungsverlauf. Die Ergebnisse zeigen, dass in Eberspermien zwei Isoformen der PK auftreten: eine N-terminal verlängerte, strukturgebundene Form, die PK-S, und eine lösliche Form, die beide der PK-M1 ähneln. Der ungewöhnliche N-Terminus der PK-S dient vermutlich der spezifischen räumlichen Anordnung der PK-S im Akrosombereich und an der fibrösen Scheide, nicht aber der Modulation kinetischer Eigenschaften. Meine Untersuchungen stützen die Hypothese, dass in bestimmten Kompartimenten von Säugerspermien die Glykolyse durch Verankerung einiger ihrer Enzyme strukturell hochgeordnet ist. Dadurch wird vermutlich die Versorgung der Mitochondrien-freien Regionen mit ATP sichergestellt. Man kann diese Organisation als Anpassung des Stoffwechsels von Spermien deuten, bei denen die Mitochondrien in einem kleinen Bereich (Mittelstück) hinter dem Spermienkopf kompartimentiert sind. Im Hauptstück des Flagellums könnte die Glykolyse ATP für die Spermienmotilität liefern, im Akrosombereich für die Verhinderung einer vorzeitigen Akrosomreaktion. Somit käme der strukturierten Glykolyse eine essentielle Bedeutung für die Befruchtungsfähigkeit von Säugerspermien zu.

Altersabhängige Besonderheiten in der Entwicklung des Bedeutungsfeldes der binären Opposition von „Möglichkeit“ vs. „Unmöglichkeit“

Die vorliegende Arbeit zum kindlichen Erwerb der binären Opposition von „Möglichkeit“ und „Unmöglichkeit“ und ihrer modalen Ausdrucksweisen im Russischen ist in ihrem praktischen Teil eine Einzelfall- und Langzeitstudie, die eine Ergänzung zu den bisher veröffentlichten, durchgehend eher experimentell und statistisch orientierten Forschungsarbeiten darstellen soll.rnÜber dreieinhalb Jahre hinweg wurde kontinuierlich Sprachmaterial eines Kindes sowie einiger ungefährer Altersgenossen und Spielkameraden aufgezeichnet, geordnet und ausgewertet. Zu Beginn des Untersuchungszeitraums war die Hauptprobandin dreieinhalb Jahre alt, zum Schluß sieben Jahre. Dieses Verfahren wurde bisher für das Russische noch nicht angewandt und wird im theoretischen Teil sorgfältig begründet.rnDas Sammeln für die Fragestellung relevanten sprachlichen Materials erfordert naturgemäß einen hohen Zeit- und Arbeitsaufwand, liefert dafür aber Daten, die eine Beeinflussung durch einen vorgegebenen Versuchsaufbau ausschließen, der natürlichen, spontanen Kommunikation entspringende Äußerungen festhalten und es ermöglichen, unprovozierte Interaktion, situationsbedingte Einflüsse, das Diskursverhalten der Probanden und ähnliche, individuelle Faktoren bei der Interpretation des Sprachmaterials in angemessener Weise zu berücksichtigen.rnUm die Fülle modaler Ausdrucksweisen sinnvoll zu strukturieren, konzentriert sich die Analyse auf die kindliche Verwendung von Modalverben und Prädikative als zentrale Mittel innerhalb des „Möglichkeitsfeldes“ und richtet den Fokus dabei auf das Verb moč’. Aus diesem Grunde wurde das theoretische Fundament, das der Arbeit zugrunde liegt, zu einem nicht geringen Teil aus dem Ansatz I.V. Šatunovskijs entwickelt, der die differenzierteste Analyse der zahlreichen Bedeutungsschattierungen des Verbs moč’ vorgelegt hat. Für besonders bedeutungsvoll für die vorliegende Arbeit erweist sich die Unterscheidung von kontrollierbarer und unkontrollierbarer Möglichkeit.rnIm Rahmen der Untersuchung ließen sich die grundlegenden Entwicklungstendenzen verfolgen. Dabei wurde nicht nur versucht nachzuvollziehen, in welcher Weise sich bei einem Kind das Fundament des Sprachgebrauchs in Gestalt eines allgemeinen „Zitatenschatzes“ formiert, sondern es gelang mitunter sogar, erste Fälle der Verwendung des einen oder anderen kommunikativen Fragments mit der Bedeutung von „Möglichkeit“ / „Unmöglichkeit“ oder erste Fälle der Konfrontation des Kindes mit einer neuen Situation, die eine solche Bedeutung verlangte, und sein Sprachverhalten in diesem Moment zu fixieren.