Transformation von Osteospermum ecklonis mit Konstrukten zur Induktion von Virusresistenz und Blühverfrühung

Für die Etablierung einer Transformationsmethode züchterisch relevanter Sorten von Osteospermum ecklonis (Kapmargerite) wurde zunächst ein geeignetes Protokoll für die Regeneration adventiver Sprosse aus vegetativem Gewebe entwickelt. Anschließend wurden Transformationen von Markergenen durch Kokultur mit Agrobacterium tumefaciens durchgeführt. Hierzu wurden Konstrukte verwendet, die das Gen für ß-D-Glucuronidase (GUS) enthielten und deren Expression in transgenen Pflanzen histochemisch nachgewiesen werden konnte. Kanamycinresistenz erwies sich als geeigneter Selektionsmarker für die Transformation. Es konnten von verschiedenen O. ecklonis Sorten GUS-transgene, nicht-chimäre Pflanzen regeneriert werden.Zur Erzeugung transgener Pflanzen mit dem Ziel der Resistenz gegen LMV (lettuce mosaic potyvirus, Salat Mosaik Virus) wurden drei Konstrukte verwendet. Das erste enthält die kodierende Sequenz der Virusproteine VPg, Pro und 6K2. Durch PCR-Mutation wurde die Proteinase-Schnittstelle zwischen 6K2 und VPg zerstört, sowie Start- und Stopcodon eingeführt. Die anderen LMV-abgeleiteten Konstrukte enthalten nicht translatierbare Fragmente des coat protein Gens in sense und antisense Orientierung.Außerdem wurde O. ecklonis noch mit dem Gen des mutmaßlichen Transkriptionsfaktor SPL3 aus Arabidopsis thaliana unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors transformiert. SPL3 ist an der Regulierung der Blüteninduktion in A. thaliana beteiligt.Regenerierte O. ecklonis wurden durch PCR mit konstruktspezifischen Primern auf Anwesenheit des Transgens und Kontamination durch A. tumefaciens überprüft.

Untersuchungen zur selektiven Deletion alloreaktiver Spender-T- Lymphozyten durch CD178-modifizierte dendritische Zellen im Rahmen der allogenen Blutstammzelltransplantation

Eine der häufigsten Komplikationen bei der allogenen Blutstammzelltransplantation stellt die Transplantat-gegen-Wirt-Erkrankung (Graft versus Host Disease, GvHD) dar. Sie wird durch allogene Spender-T-Lymphozyten verursacht, die Gewebe des Transplantatempfängers erkennen und inflammatorische Entzündungsprozesse auslösen. Neben dieser Alloreaktivität induzieren Spender-T-Lymphozyten jedoch auch immuntherapeutisch erwünschte Transplantat-gegen-Leukämie-Reaktionen (Graft versus Leukemia, GvL-Reaktion), bei denen residuelle Tumor- bzw. Leukämiezellen im Patienten durch Spender-T-Zellen spezifisch erkannt und eliminiert werden. Im Rahmen einer verbesserten Immmuntherapie wird daher versucht, GvHD-reaktive und GvL-reaktive Spender-T-Lymphozyten effizient voneinander zu separieren und so eine wirkungsvolle GvHD-Prophylaxe bzw. optimierte GvL-Induktion zu erreichen. In diesem Kontext war es Ziel dieser Arbeit, murine dendritische Zellen (DZ) so zu modifizieren, daß sie für die spezifische Deletion alloreaktiver T-Zellen in murinen GvHD/GvL-Tiermodellen eingesetzt werden können. Die Modifikation der DZ sollte dazu führen, daß über das CD95/CD178-System Aktivierungs-induzierter Zelltod (activation induced cell death, AICD) in alloreaktiven T-Zellen ausgelöst wird. Hierzu wurden für die Modifikation der DZ zwei verschiedene Mechanismen angewandt: a) die Transfektion der DZ mit CD178-mRNA sowie b) die zielgerichtete Immobilisierung von hCD178-X-Fusionsproteinen auf Oberflächenmolekülen von DZ bzw. T-Zellen. Als Positivkontrolle für die Induktion CD95-vermittelter Apoptose diente der agonistische anti-CD95-Antikörper Jo2. Bei der Transfektion muriner DZ mit mRNA zeigte sich anhand des Reportergens EGFP, daß aus dem Knochenmark generierte DZ mit hoher Effizienz mit EGFP-mRNA transfizierbar waren. Im Falle von hCD178-mRNA führte die Transfektion jedoch zu einer insuffizienten CD178-Expression, die mit den regulatorischen Eigenschaften der zytoplasmatischen CD178-Region in Verbindung gebracht werden konnte. So führte die Verwendung einer zytoplasmatisch trunkierten Form der CD178-mRNA (CD178Dzyt) zu einer durchflußzytometrisch nachweisbaren CD178-Expression in DZ. Mit diesen CD178Dzyt-exprimierenden DZ konnte in einem Proliferationstest die Proliferation alloreaktiver T-Zellen inhibiert werden. Die Beladung von DZ bzw. von T-Zellen mit hCD178-X-Fusionsproteinen führte in vitro ebenfalls zu einer deutlichen Reduktion von Alloreaktivität. Dabei konnte eine spezifische Deletion/Inhibition alloreaktiver T-Zellen nachgewiesen werden. Die Elimination alloreaktiver T-Zellen erfolgte in beiden Verfahren über AICD. Darüber hinaus wurde eine Bifunktionalität der Fusionsproteine festgestellt, da sie neben der Induktion CD95-vermittelter Apoptose auch in der Lage waren, die Kostimulation allogener T-Zellen effizient zu inhibieren. Mit Hilfe adoptiver T-Zell-Transferexperimente konnten abschließend die in vitro gewonnenen Ergebnisse in vivo in zwei verschiedenen GvHD-Mausmodellen bestätigt werden.

Characterization of inclusions and their distribution in natural and artificial samples by synchrotron cryo-micro-tomography (SCXRT)

Zur geometrischen Vermessung und Beschreibung von Einschlüssen in natürlichen sowie im Labor geschaffenen Eispartikeln wurde ein neuartiger Versuchaufbau an der Tomographie-Endstation der Material Science Beam Line an der Swiss Light Source (SLS, Paul Scherrer Institut, Villigen, Schweiz) entwickelt. Dieser besteht aus einer Plexiglas-Tasse und einem doppelwandigen Kaptonfolien-Käfig, der wiederum auf die Düse eines CryojetXL (Oxford Instruments) montiert wurde. Abgesehen von dem hohen Maß an Flexibilit¨at bez¨uglich der Installation erlaubt es dieser Aufbau, die Temperatur des Experiments mit einer Genauigkeit von ± 1 K über einen Bereich von 271 K bis 220 K zu regeln. In den hier beschriebenen Experimenten wurde eine räumliche Auflösung von 1.4 µm erzielt.