Ektopische Expression schwer exprimierbarer nikotinischer Acetylcholinrezeptoren in Zellinien

Deutsch:In dieser Arbeit wurden Versuche zur funktionellen Expression von schwer ektopisch exprimierbaren nAChR in HEK-293/a1-Zellen durchgeführt: a7 nAChR und a6-enthaltenden nAChR. Die Probleme lagen dabei nicht auf dem Niveau der Transfektion, Transkription, Translation oder der Assemblierung, sondern beim Transport der Rezeptoren zur Zellmembran.Die Expression von a7 nAChR in der Plasmamembran von HEK-293/a1-Zellen konnte durch verbesserte Expressionsbedingungen (Koexpression des Faltungshelfers Calnexin oder weiterer nAChR-Untereinheiten, Erniedrigung der Expressionstemperatur, Expression in Gegenwart nikotinischer Antagonisten) nicht erreicht werden. Auch in anderen Zellinien mit neuronalem oder nicht-neuronalem Ursprung (QT6, GH4C1, S2 und PCC7-Mz1) war die EGFP-gekoppelte a7 nAChR-Untereinheit nur im Zellinneren lokalisiert.Eine intrazelluläre Lokalisation verhinderte auch eine funktionelle Expression homomerer a6 sowie heteromerer a6b2 und a6b3 nAChR in HEK-293/a1-Zellen. Im Gegensatz dazu führte eine Expression von stabil mit den nAChR-Untereinheiten a6 und b4 transfizierten HEK-293/a1-Zellen in Gegenwart von Calciumphosphat-Transfektionslösung und anschließend bei 30°C zu einem verbesserten Transport der Rezeptoren zur Zellmembran und damit zum erfolgreichen Expression funktioneller a6b4 nAChR. Die Wirkung der Transfektionslösung kann durch die erhöhte Calciumkonzentration erklärt werden, da in Ganzzellableitungen eine potenzierende Wirkung von Calciumionen auf den a6b4 nAChR bewiesen wurde. Somit konnte erstmalig der humane a6b4 nAChR in einer Säugerzellinie stabil und funktionell exprimiert werden.

Untersuchung der lateralen Organisation und Phasenumwandlung von festkörperunterstützten Lipidmembranen

Im ersten Teil der Arbeit wurde das Bindungsverhalten von Annexin A1 und Annexin A2t an festkörperunterstützte Lipidmembranen aus POPC und POPS untersucht. Für beide Proteine konnte mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie gezeigt werden, dass irreversible Bindung nur in Anwesenheit von POPS auftritt. Durch rasterkraftmikroskopische Aufnahmen konnte die laterale Organisation der Annexine auf der Lipidmembran dargestellt werden. Beide Proteine lagern sich in Form lateraler Aggregate (zweidimensionale Domänen) auf der Oberfläche an, außerdem ist der Belegungsgrad und die Größe der Domänen von der Membranzusammensetzung und der Calciumkonzentration abhängig. Mit zunehmendem POPS-Gehalt und Calciumkonzentration steigt der Belegungsgrad an und der mittlere Domänenradius wird kleiner. Diese Ergebnisse konnten in Verbindung mit detaillierten Bindungsstudien des Annexins A1 mit der Quarzmikrowaage verwendet werden, um ein Bindungsmodell auf Basis einer heterogenen Oberfläche zu entwickeln. Auf einer POPC-reichen Matrix findet reversible Adsorption statt und auf POPS-reichen Domänen irreversible Adsorption. Durch die Anpassung von dynamischen Monte Carlo-Simulationen basierend auf einer zweidimensionalen zufälligen sequentiellen Adsorption konnten Erkenntnisse über die Membranstruktur und die kinetischen Ratenkonstanten in Abhängigkeit von der Calciumkonzentration und der Inkubationszeit des Proteins gewonnen werden. Die irreversible Bindung ist in allen Calciumkonzentrationsbereichen schneller als die reversible. Außerdem zeigt die irreversible Adsorption eine deutlich stärkere Abhängigkeit von der Calciumkonzentration. Ein kleinerer Belegungsgrad bei niedrigen Ca2+-Gehalten ist hauptsächlich durch die Abnahme der verfügbaren Bindungsplätze auf der Oberfläche zu erklären. Die gute Übereinstimmung der aus den Monte Carlo-Simulationen erhaltenen Domänenstrukturen mit den rasterkraftmikroskopischen Aufnahmen und die Tatsache, dass sich die simulierten Resonanzfrequenzverläufe problemlos an die experimentellen Kurven aus den QCM-Messungen anpassen ließen, zeigt die gute Anwendbarkeit des entwickelten Simulationsprogramms auf die Adsorption von Annexin A1. Die Extraktion der kinetischen Parameter aus dem zweidimensionalen RSA-Modell ist mit Sicherheit einem einfachen Langmuir-Ansatz überlegen. Bei einem Langmuir-Modell erfolgt eine integrale Erfassung einer einzelnen makroskopischen Geschwindigkeitskonstante, während durch das RSA-Modell eine differenzierte Betrachtung des reversiblen und irreversiblen Bindungsprozesses möglich ist. Zusätzlich lassen sich mikroskopische Informationen über die Oberflächenbeschaffenheit gewinnen. Im zweiten Teil der Arbeit wurde das thermotrope Phasenverhalten von festkörperunterstützten Phospholipidbilayern untersucht. Dazu wurden mikrostrukturierte, frei stehende Membranstreifen präpariert und mit Hilfe der bildgebenden Ellipsometrie untersucht. Dadurch konnten die temperaturabhängigen Verläufe der Schichtdicke und der lateralen Membranausdehnung parallel beobachtet werden. Die ermittelten Phasenübergangstemperaturen von DMPC, diC15PC und DPPC lagen 2 - 3 °C oberhalb der Literaturwerte für vesikuläre Systeme. Außerdem wurde eine deutliche Verringerung der Kooperativität der Phasenumwandlung gefunden, was auf einen großen Einfluss des Substrats bei den festkörperunterstützten Lipidmembranen schließen lässt. Zusätzlich wurde ein nicht systematischer Zusammenhang der Ergebnisse von der Oberflächenpräparation gefunden, der es unabdingbar macht, bei Untersuchungen von festkörperunterstützten Substraten einen internen Standard einzuführen. Bei der Analyse des thermotropen Phasenübergangsverhaltens von DMPC/Cholesterol - Gemischen wurde daher die individuelle Adressierbarkeit der strukturierten Lipidmembranen ausgenutzt und ein Lipidstreifen aus reinem DMPC als Standard verwendet. Auf diese Weise konnte gezeigt werden, dass das für Phospholipide typische Phasenübergangsverhalten ab 30 mol% Cholesterol in der Membran nicht mehr vorhanden ist. Dies ist auf die Bildung einer nur durch höhere Sterole induzierten fluiden Phase mit hoch geordneten Acylketten zurückzuführen. Abschließend konnte durch die Zugabe von Ethanol zu einer mikrostrukturierten DMPC-Membran die Bildung eines interdigitierten Bilayers nachgewiesen werden. Die bildgebende Ellipsometrie ist eine sehr gute Methode zur Untersuchung festkörperunterstützter Lipidmembranen, da sie über ein sehr gutes vertikales und ein ausreichendes laterales Auflösungsvermögen besitzt. Sie ist darin zwar einem Rasterkraftmikroskop noch unterlegen, besitzt dafür aber eine einfachere Handhabung beim Umgang mit Flüssigkeiten und in der Temperierung, eine schnellere Bildgebung und ist als optische Methode nicht-invasiv.

Glutamate-induced potentiation of calcium influx in primary hippocampal culture neurons

ABSTRACT This works aim was to test whether LTP-like features can also be measured in cell culture and by methods that allow to analyse a alrger number of cells. A suitable method for this purpose is calcium imaging. The rationale for this approach lies in the fact that LTP/LTD are dependent on changes in intracellular calcium concentrations. Calcium levels have been measured using the calcium sensitive dye fura-2, whose fluorescence spectrum changes upon formation of the [fura-2-Ca2+] complex. Our LTP-inducing protocol comprised of two glutamate stimuli of identical size and duration (50 mM, 30 s) which were separated by 35 min. We could demonstrate that such a stimulation pattern gives rise to approx. 25% larger calcium influx at the second stimulus. It has been shown than such a stimulation pattern gives rise to an average of 25% augmentation (potentiation) of the second response, with 69% of potentiated cells. This experimental paradigm shows the pharmacological properties of LTP, established by previous electrophysiological studies:- blocking of NMDARs and mGluRs eliminates LTP induction;- blocking of AMPARs and L-type VGCCs does not eliminate LTP induction. Having obtained a system for induction and following of LTP-like changes, a preliminary application example was performed. Its purpose was to investigate possible influence of nicotine and galanthamine on our potentiation effect. Nicotine (100 mM) was shown both to increase and to eliminate glutamate-induced potentiation. Galanthamine coapplication (0.5 mM) with nicotine and glutamate exerted no effect on nicotinic modulation. However, galanthamine coapplied with glutamate alone seems to augment glutamate-induced potentiation. An LTP model system presented here could be additionally refined, by variation of glutamate application times, and testing for dependence on various forms of protein kinases. Galanthamine effect would probably be better addressed by cell-to-cell measurements instead of statistical approach, with subsequent identification of the cell type. Alternatively, combined calcium imaging – electrophysiological experiments could be performed. Spatial and temporal properties of intracellular ion dynamics could be utilised as diagnostic tools of the physiological state of the cells, thereby finding its application in functional proteomics.

Development of models and methods to simulate peptide-assisted nucleation and growth of calcium-minerals

In den vergangenen Jahren wurden einige bislang unbekannte Phänomene experimentell beobachtet, wie etwa die Existenz unterschiedlicher Prä-Nukleations-Strukturen. Diese haben zu einem neuen Verständnis von Prozessen, die auf molekularer Ebene während der Nukleation und dem Wachstum von Kristallen auftreten, beigetragen. Die Auswirkungen solcher Prä-Nukleations-Strukturen auf den Prozess der Biomineralisation sind noch nicht hinreichend verstanden. Die Mechanismen, mittels derer biomolekulare Modifikatoren, wie Peptide, mit Prä-Nukleations-Strukturen interagieren und somit den Nukleationsprozess von Mineralen beeinflussen könnten, sind vielfältig. Molekulare Simulationen sind zur Analyse der Formation von Prä-Nukleations-Strukturen in Anwesenheit von Modifikatoren gut geeignet. Die vorliegende Arbeit beschreibt einen Ansatz zur Analyse der Interaktion von Peptiden mit den in Lösung befindlichen Bestandteilen der entstehenden Kristalle mit Hilfe von Molekular-Dynamik Simulationen.rnUm informative Simulationen zu ermöglichen, wurde in einem ersten Schritt die Qualität bestehender Kraftfelder im Hinblick auf die Beschreibung von mit Calciumionen interagierenden Oligoglutamaten in wässrigen Lösungen untersucht. Es zeigte sich, dass große Unstimmigkeiten zwischen etablierten Kraftfeldern bestehen, und dass keines der untersuchten Kraftfelder eine realistische Beschreibung der Ionen-Paarung dieser komplexen Ionen widerspiegelte. Daher wurde eine Strategie zur Optimierung bestehender biomolekularer Kraftfelder in dieser Hinsicht entwickelt. Relativ geringe Veränderungen der auf die Ionen–Peptid van-der-Waals-Wechselwirkungen bezogenen Parameter reichten aus, um ein verlässliches Modell für das untersuchte System zu erzielen. rnDas umfassende Sampling des Phasenraumes der Systeme stellt aufgrund der zahlreichen Freiheitsgrade und der starken Interaktionen zwischen Calciumionen und Glutamat in Lösung eine besondere Herausforderung dar. Daher wurde die Methode der Biasing Potential Replica Exchange Molekular-Dynamik Simulationen im Hinblick auf das Sampling von Oligoglutamaten justiert und es erfolgte die Simulation von Peptiden verschiedener Kettenlängen in Anwesenheit von Calciumionen. Mit Hilfe der Sketch-Map Analyse konnten im Rahmen der Simulationen zahlreiche stabile Ionen-Peptid-Komplexe identifiziert werden, welche die Formation von Prä-Nukleations-Strukturen beeinflussen könnten. Abhängig von der Kettenlänge des Peptids weisen diese Komplexe charakteristische Abstände zwischen den Calciumionen auf. Diese ähneln einigen Abständen zwischen den Calciumionen in jenen Phasen von Calcium-Oxalat Kristallen, die in Anwesenheit von Oligoglutamaten gewachsen sind. Die Analogie der Abstände zwischen Calciumionen in gelösten Ionen-Peptid-Komplexen und in Calcium-Oxalat Kristallen könnte auf die Bedeutung von Ionen-Peptid-Komplexen im Prozess der Nukleation und des Wachstums von Biomineralen hindeuten und stellt einen möglichen Erklärungsansatz für die Fähigkeit von Oligoglutamaten zur Beeinflussung der Phase des sich formierenden Kristalls dar, die experimentell beobachtet wurde.