Molekulare Ursachen und therapeutische Intervention bei der Alzheimer-Demenz

Ein charakteristisches, neuropathologisches Merkmal der Alzheimer-Demenz (AD), der am häufigsten vorkommenden Demenz-Form des Menschen, ist das Auftreten von senilen Plaques im Gehirn der Patienten. Hierbei stellt das neurotoxische A-beta Peptid den Hauptbestandteil dieser Ablagerungen dar. Einen Beitrag zu der pathologisch erhöhten A-beta Generierung liefert das verschobene Expressionsgleichgewicht der um APP-konkurrierenden Proteasen BACE-1 und ADAM10 zu Gunsten der beta-Sekretase BACE-1. In der vorliegenden Dissertation sollten molekulare Mechanismen identifiziert werden, die zu einem pathologisch veränderten Gleichgewicht der APP-Spaltung und somit zum Entstehen und Fortschritt der AD beitragen. Des Weiteren sollten Substanzen identifiziert werden, die durch Beeinflussung der Genexpression einer der beiden Proteasen das physiologische Gleichgewicht der APP-Prozessierung wiederherstellen können und somit therapeutisch einsetzbar sind.rnAnhand eines „Screenings“ von 704 Transkriptionsfaktoren wurden 23 Faktoren erhalten die das Verhältnis ADAM10- pro BACE-1-Promotor Aktivität beeinflussten. Exemplarisch wurden zwei der molekularen Faktoren auf ihren Wirkmechanismus untersucht: Der TF „X box binding protein-1“ (XBP-1), der die so genannte „unfolded protein response“ (UPR) reguliert, erhöhte die Expression von ADAM10 in Zellkultur-Experimenten. Die Menge dieses Faktors war in AD-Patienten im Vergleich zu gesunden, Alters-korrelierten Kontrollen signifikant erniedrigt. Im Gegensatz dazu verminderte der Seneszenz-assoziierte TF „T box 2“ (Tbx2) die Menge an ADAM10 in SH-SY5Y Zellen. Die Expression des Faktors selbst war in post-mortem Kortexgewebe von AD-Patienten erhöht. Zusätzlich zu den TFs konnten in einer Kooperation mit dem Helmholtz Zentrum München drei microRNAs (miRNA 103, 107, 1306) bioinformatisch prädiziert und experimentell validiert werden, die die Expression des humanen ADAM10 reduzierten.rnIm Rahmen dieser Arbeit konnten damit körpereigene Faktoren identifiziert werden, die die Menge an ADAM10 regulieren und folglich potenziell an der Entstehung der gestörten Homöostase der APP-Prozessierung beteiligt sind. Somit ist die AD auch im Hinblick auf eine A-beta-vermittelte Pathologie als multifaktorielle Krankheit zu verstehen, in der verschiedene Regulatoren zur gestörten APP-Prozessierung und somit zur pathologisch gesteigerten A-beta Generierung beitragen können. rnEine pharmakologische Erhöhung der ADAM10 Genexpression würde zu der Freisetzung von neuroprotektivem APPs-alpha und gleichzeitig zu einer reduzierten A-beta Generierung führen. Deshalb war ein weiteres Ziel dieser Arbeit die Evaluierung von Substanzen mit therapeutischem Potenzial im Hinblick auf eine erhöhte ADAM10 Expression. Von 640 FDA-zugelassenen Medikamenten einer Substanz-Bibliothek wurden 23 Substanzen identifiziert, die die Menge an ADAM10 signifikant steigerten während die Expression von BACE-1 und APP unbeeinflusst blieb. In Zusammenarbeit mit dem Institut für Pathologie (Johannes Gutenberg Universität Mainz) wurde ein Zellkultur-basiertes Modell etabliert, um die Permeationsfähigkeit der potenziellen Kandidaten-Substanzen über die Blut-Hirn Schranke (BHS) zu untersuchen. Von den 23 Medikamenten konnten neun im Rahmen des etablierten Modells als BHS-gängig charakterisiert werden. Somit erfüllen diese verbleibenden Medikamente die grundlegenden Anforderungen an ein AD-Therapeutikum. rnADAM10 spaltet neben APP eine Vielzahl anderer Substrate mit unterschiedlichen Funktionen in der Zelle. Zum Beispiel reguliert das Zelladhäsionsmolekül Neuroligin-1 (NL-1), das von ADAM10 prozessiert wird, die synaptische Funktion exzitatorischer Neurone. Aus diesem Grund ist die Abschätzung potenzieller, Therapie-bedingter Nebenwirkungen sehr wichtig. Im Rahmen eines Forschungsaufenthalts an der Universität von Tokio konnte in primären, kortikalen Neuronen der Ratte bei einer Retinoid-induzierten Erhöhung von ADAM10 neben einer vermehrten alpha-sekretorischen APP-Prozessierung auch eine gesteigerte Spaltung von NL-1 beobachtet werden. Dies lässt vermuten, dass bei einer Behandlung mit dem Retinoid Acitretin neben einer vermehrten APP-Spaltung durch ADAM10 auch die Regulation glutamaterger Neurone durch die Spaltung von NL-1 betroffen ist. Anhand eines geeigneten Alzheimer-Tiermodells sollten diese Befunde weiter analysiert werden, um so auf einen sicheren therapeutischen Ansatz bezüglich einer vermehrten ADAM10 Genexpression schließen zu können.rn

Expanding the scope of poly(ethylene glycol)s for bioconjugation to squaric acid-mediated PEGylation and pH-sensitivity

Poly(ethylene glycol) (PEG) is used in a broad range of applications due to its unique combination of properties and is approved use in formulations for body-care products, edibles and medicine. This thesis aims at the synthesis and characterization of novel heterofunctional PEG structures and the establishment of diethyl squarate as a suitable linker for the covalent attachment to proteins. Chapter 1 is an introduction on the properties and applications of PEG as well as the fascinating chemistry of squaric acid derivatives. In Chapter 1.1, the synthesis and properties of PEG are described, and the versatile applications of PEG derivatives in everyday products are emphasized with a focus on PEG-based pharmaceuticals and nonionic surfactants. This chapter is written in German, as it was published in the German Journal Chemie in unserer Zeit. Chapter 1.2 deals with PEGs major drawbacks, its non-biodegradability, which impedes parenteral administration of PEG conjugates with polyethers exceeding the renal excretion limit, although these would improve blood circulation times and passive tumor targeting. This section gives a comprehensive overview of the cleavable groups that have been implemented in the polyether backbone to tackle this issue as well as the synthetic strategies employed to accomplish this task. Chapter 1.3 briefly summarizes the chemical properties of alkyl squarates and the advantages in protein conjugation chemistry that can be taken from its use as a coupling agent. In Chapter 2, the application of diethyl squarate as a coupling agent in the PEGylation of proteins is illustrated. Chapter 2.1 describes the straightforward synthesis and characterization of squaric acid ethyl ester amido PEGs with terminal hydroxyl functions or methoxy groups. The reactivity and selectivity of theses activated PEGs are explored in kinetic studies on the reactions with different lysine and other amino acid derivatives, followed by 1H NMR spectroscopy. Further, the efficient attachment of the novel PEGs to a model protein, i.e., bovine serum albumin (BSA), demonstrates the usefulness of the new linker for the PEGylation with heterofunctional PEGs. In Chapter 2.3 initial studies on the biocompatibility of polyether/BSA conjugates synthesized by the squaric acid mediated PEGylation are presented. No cytotoxic effects on human umbilical vein endothelial cells exposed to various concentrations of the conjugates were observed in a WST-1 assay. A cell adhesion molecule - enzyme immunosorbent assay did not reveal the expression of E-selectin or ICAM-1, cell adhesion molecules involved in inflammation processes. The focus of Chapter 3 lies on the syntheses of novel heterofunctional PEG structures which are suitable candidates for the squaric acid mediated PEGylation and exhibit superior features compared to established PEGs applied in bioconjugation. Chapter 3.1 describes the synthetic route to well-defined, linear heterobifunctional PEGs carrying a single acid-sensitive moiety either at the initiation site or at a tunable position in the polyether backbone. A universal concept for the implementation of acetal moieties into initiators for the anionic ring-opening polymerization (AROP) of epoxides is presented and proven to grant access to the degradable PEG structures aimed at. The hydrolysis of the heterofunctional PEG with the acetal moiety at the initiating site is followed by 1H NMR spectroscopy in deuterium oxide at different pH. In an exploratory study, the same polymer is attached to BSA via the squarate acid coupling and subsequently cleaved from the conjugate under acidic conditions. Furthermore, the concept for the generation of acetal-modified AROP initiators is demonstrated to be suitable for cholesterol, and the respective amphiphilic cholesteryl-PEG is cleaved at lowered pH. In Chapter 3.2, the straightforward synthesis of α-amino ω2-dihydroxyl star-shaped three-arm PEGs is described. To assure a symmetric length of the hydroxyl-terminated PEG arms, a novel AROP initiator is presented, who’s primary and secondary hydroxyl groups are separated by an acetal moiety. Upon polymerization of ethylene oxide for these functionalities and subsequent cleavage of the acid-labile unit no difference in the degree of polymerization is seen for both polyether fragments.

Die Rolle der Oligodendrozyten-Vorläuferzellen im Zentralen Nervensystem

Im Fokus dieser Studie stehen die zu den Gliazellen zählenden OPC, sowie das von diesen exprimierte Typ-1 Membranprotein NG2. Dieses wird auf eine Prozessierung durch α- und γ-Sekretase, in Analogie zu Proteinen wie Notch oder APP, untersucht.rnEine solche Prozessierung ginge mit zusätzlichen intrazellulären Spaltprodukten neben der bekannten Ektodomäne einher. Da OPC mit dem Neuronalen Netzwerk durch synaptische Innervierungen in Verbindung stehen, stellt sich die Frage, ob diese mit der Spaltung von NG2 in Verbindung gebracht werden können. Dazu käme mechanistisch beispielsweise eine aktivitätsabhängige Regulierung der Proteolyse, wie sie jüngst für das neuronale synaptische cell adhesion molecule Neuroligin gezeigt werden konnte, in Frage. Zudem werden eine physiologische Rolle der NG2 Ektodomäne bzw. der möglichen intrazellulären Fragmente untersuchen. Insbesondere potentielle neuromodulatorische Funktionen sind hier von Interesse, da diese die OPC tiefer in das Neuronale Netzwerk integrieren würden. Die Existenz eines NG2 Homologes in D. melanogaster, wirft weiterhin die Frage auf, in wie weit diese Mechanismen in diesem Modellsystem konserviert sind.rnIn Analogie zur Lokalisierung von Markerproteinen an Neuron-Neuron Synapsen in vivo, ergibt sich die Frage ob sich die synaptischen Verbindungen zwischen Neuronen und OPC in ähnlicher Weise darstellen lassen.rnEin Charakteristikum von OPC ist die Teilungsaktivität in sich entwickelnden und adulten Säugern. Zudem gibt es Evidenzen für direkte funktionelle Verknüpfungen zwischen dem NG2 Protein und dem Teilungsmodus der OPC. Deshalb war ein weiteres Ziel mögliche Änderungen in der Zellteilung der OPC, die mit dem NG2 Protein in Verbindung stehen könnten, in NG2 -/- Mäusen zu untersuchen.rn

The central role of Fyn kinase in axon-glial signalling and translation of myelin proteins

During central nervous system myelination, oligodendrocytes extend membrane processes towards an axonal contact site which is followed by ensheathment resulting in a compacted multilamellar myelin sheath. The formation of this axon-glial unit facilitates rapid saltatory propagation of action potentials along the axon and requires the synthesis and transport of copious amounts of lipids and proteins to the axon-glial contact site. Fyn is a member of the Src family of non receptor tyrosine kinases and inserted into the inner leaflet of the oligodendrocyte membrane by acylation. Fyn activity plays a pivotal role in the maturation of oligodendrocytes and the myelination process. It was suggested previously that Fyn kinase can be stimulated by binding of a neuronal ligand to oligodendroglial F3/ contactin, a glycosyl-phosphatidyl-inositol anchored immunoglobulin superfamily (IgSF) member protein. It could be shown here, that neuronal cell adhesion molecule L1 binds to oligodendrocytes in an F3-dependent manner and activates glial Fyn. In the search for downstream participants of this novel axon-glial signalling cascade, heterogeneous nuclear ribonucleoprotein (hnRNP) A2 was identified as a novel Fyn target in oligodendrocytes. HnRNP A2 was known to be involved in the localisation of translationally repressed myelin basic protein (MBP) mRNA by binding to a cis acting A2 response element (A2RE) present in the 3’ untranslated region. Transport of MBP mRNAs occurs in RNA-protein complexes termed RNA granules and translational repression during transport is achieved by hnRNP A2-mediated recruitment of hnRNP E1 to the granules. It could be shown here, that Fyn activity leads to enhanced translation of reporter mRNA containing a part of the 3’ UTR of MBP including the A2RE. Furthermore hnRNP E1 seems to dissociate from RNA granules in response to Fyn activity and L1 binding. These findings suggest a novel form of neuron- glial communication: Axonal L1 binding to oligodendroglial F3 activates Fyn kinase. Activated Fyn phosphorylates hnRNP A2 leading to removal of hnRNP E1 from RNA granules initiating the translation of MBP mRNA. MBP is the second most abundant myelin protein and mice lacking this protein show a severe hypomyelination phenotype. Moreover, the brains of Fyn knock out mice contain reduced MBP levels and are hypomyelinated. Hence, L1-mediated MBP synthesis via Fyn as a central molecule could be part of a regulatory mechanism required for myelinogenesis in the central nervous system.

Fyn kinase targets in oligodendroglial physiology and myelination

In the central nervous system (CNS), oligodendrocytes form the multilamellar and compacted myelin sheath by spirally wrapping around defined axons with their specialised plasma membrane. Myelin is crucial for the rapid saltatory conduction of nerve impulses and for the preservation of axonal integrity. The absence of the major myelin component Myelin Basic Protein (MBP) results in an almost complete failure to form compact myelin in the CNS. The mRNA of MBP is sorted to cytoplasmic RNA granules and transported to the distal processes of oligodendrocytes in a translationally silent state. A main mediator of MBP mRNA localisation is the trans-acting factor heterogeneous nuclear ribonucleoprotein (hnRNP) A2 which binds to the cis-acting A2 response element (A2RE) in the 3’UTR of MBP mRNA. A signalling cascade had been identified that triggers local translation of MBP at the axon-glial contact site, involving the neuronal cell adhesion molecule (CAM) L1, the oligodendroglial plasma membrane-tethered Fyn kinase and Fyn-dependent phosphorylation of hnRNP A2. This model was confirmed here, showing that L1 stimulates Fyn-dependent phosphorylation of hnRNP A2 and a remodelling of A2-dependent RNA granule structures. Furthermore, the RNA helicase DDX5 was confirmed here acting together with hnRNP A2 in cytoplasmic RNA granules and is possibly involved in MBP mRNA granule dynamics.rnLack of non-receptor tyrosine kinase Fyn activity leads to reduced levels of MBP and hypomyelination in the forebrain. The multiadaptor protein p130Cas and the RNA-binding protein hnRNP F were verified here as additional targets of Fyn in oligodendrocytes. The findings point at roles of p130Cas in the regulation of Fyn-dependent process outgrowth and signalling cascades ensuring cell survival. HnRNP F was identified here as a novel constituent of oligodendroglial cytoplasmic RNA granules containing hnRNP A2 and MBP mRNA. Moreover, it was found that hnRNP F plays a role in the post-transcriptional regulation of MBP mRNA and that defined levels of hnRNP F are required to facilitate efficient synthesis of MBP. HnRNP F appears to be directly phosphorylated by Fyn kinase what presumably contributes to the initiation of translation of MBP mRNA at the plasma membrane.rnFyn kinase signalling thus affects many aspects of oligodendroglial physiology contributing to myelination. Post-transcriptional control of the synthesis of the essential myelin protein MBP by Fyn targets is particularly important. Deregulation of these Fyn-dependent pathways could thus negatively influence disorders involving the white matter of the nervous system.rnrn

Analysen zur molekularen Charakterisierung von Proteinen des humanen Usher-Syndroms und Evaluation genbasierter Therapiestrategien

Analysen zur molekularen Charakterisierung von Proteinen des humanen Usher-Syndroms und Evaluation genbasierter Therapiestrategien rnDas humane Usher Syndrom (USH) ist die häufigste Form vererbter Taub-Blindheit. In der vorliegenden Dissertation wurde diese komplexe Erkrankung auf verschiedenen Ebenen analysiert: in Arbeiten zur Expression und Lokalisation von USH-Proteinen, der Analyse der USH-Proteinnetzwerke und deren Funktionen sowie darauf aufbauend die Entwicklung von Therapiestrategien für USH.rnIm Rahmen der Arbeit wurde die Expression und (sub)-zelluläre Lokalisation des USH1D-Genproduktes CDH23 in der Retina und Cochlea analysiert. CDH23-Isoformen werden in der Maus zeitlich und räumlich differentiell exprimiert. In den Retinae von Mäusen, nicht humanen Primaten und Menschen zeigten Analysen eine unterschiedliche Expression und Lokalisation des Zell-Zelladhäsionsmoleküls CDH23, was auf Funktions-unterschiede der einzelnen Isoformen in den analysierten Spezies hindeutet.rnAnalysen zur Aufklärung der USH-Proteinnetzwerke ergaben eine potentielle Interaktion des USH1G-Gerüstproteins SANS mit dem Golgi- und Centrosom-assoziierten Protein Myomegalin. Die direkte Interaktion der Proteine konnte durch unabhängige Experimente verifiziert werden. Beide Interaktionspartner sind in den Retinae verschiedener Spezies partiell ko-lokalisiert und partizipieren im periciliären USH-Proteinnetzwerk. Die Assoziation von SANS und Myomegalin mit dem Mikrotubuli-Cytoskelett weist auf eine Funktion des Proteinkomplexes in gerichteten Transportprozessen innerhalb der Photorezeptoren hin und bekräftigt die Hypothese einer Rolle von SANS und assoziierten Netzwerken mit Transportprozessen.rnDas hier gewonnene erweiterte Verständnis der molekularen Grundlagen sowie die Aufklärung der zellulären Funktion der Proteinnetzwerke ermöglichen die Entwicklung therapeutischer Strategien für USH. Ein Fokus der vorliegenden Arbeit lag auf der Entwicklung genbasierter Therapiestrategien und deren Evaluation, wobei der Schwerpunkt auf der Therapiestrategie der Genreparatur lag. Die mit Hilfe von Zinkfinger-Nukleasen (ZFN) induzierte Homologe Rekombination für die Genkorrektur wurde exemplarisch an der 91C>T/p.R31X-Mutation im USH1C-Gen gezeigt. Effiziente ZFN wurden identifiziert, generiert und erfolgreich im Zellkulturmodellsystem eingesetzt. Die Analysen demonstrierten eine Reparatur der Mutation durch Homologe Rekombination auf genomischer Ebene und die Expression des wiederhergestellten Proteins. Durch die Genkorrektur im endogenen Lokus sind Größe des Gens, Isoformen oder die Art der Mutation keine limitierenden Faktoren für die Therapie. Die in der vorliegenden Arbeit durchgeführten Experimente unterstreichen das enorme Potential ZFN-basierter Therapiestrategien hin zu personalisierten Therapieformen nicht nur für USH sondern auch für andere erbliche Erkrankungen, deren genetische Grundlagen bekannt sind.rn

Untersuchungen zur induzierbaren Expression des Adhäsionsmoleküls E-Selektin und dessen potentieller Bedeutung bei der Tumormetastasierung

In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass sowohl die durch TNFalpha-, als auch durch Röntgenstrahlen vermittelte Expression des Adhäsionsmoleküls E-Selektin in Endothelzellen durch kleine GTPasen der Rho-Proteinfamilie reguliert ist. Hemmung dieser kleinen G-Proteine z.B. durch HMG-CoA Reduktase-Inhibitoren (Statine) oder clostridiale Toxine führt zu verminderter Expression von E-Selektin in humanen Endothelzellen (HUVEC; EA.hy-926). Aus den in der Arbeit erhaltenen Ergebnissen kann außerdem die Schlussfolgerung gezogen werden, dass die Regulation der zytokininduzierten E-Selektin-Genexpression von der gamma-Strahlen-vermittelten Expression des E-Selektingens differiert. Für die strahleninduzierte endotheliale E-Selektin-Expression scheint beispielsweise der Transkriptionsfaktor AP-1 als ein weiterer Kontrollfaktor neben NF-kappaB zu fungieren. Des Weiteren konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass eine gesteigerte E-Selektin-Proteinexpression mit erhöhter Tumorzelladhäsion und -transmigration an bzw. durch humane Endothelzellen korreliert. Hemmung der TNFalpha- bzw. gamma-Strahlen-induzierten Expression von E-Selektin durch Statine oder Retinsäuren ist ausreichend, sowohl Tumorzelladhäsion als auch Tumorzelldiapedese zu reduzieren. Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass das Adhäsionsmolekül E-Selektin eine vielversprechende Zielstruktur ist, über deren kontrollierte Beeinflussung es auch in vivo möglich sein sollte, das Risiko der Metastasierung zu reduzieren. Mit Statinen und Retinsäurederivaten wurden somit Pharmaka identifiziert, die durch Hemmung der Rho-regulierten E-Selektin-Expression der Tumorzellmetastasierung vorbeugen könnten. Um diese Hypothese in zukünftigen tierexperimentelle Studien zu bestätigen, wurde im Rahmen dieser Arbeit mit der Generierung transgener Tiermodelle begonnen.

Funktionelle Analyse der Polaritäts- und Tumorsuppressorgene hugl-1 und hugl-2 mittels siRNA-vermitteltem Gen-Silencing und konditionalem Gen-Knockout

Das menschliche Gen human giant larvae (hugl) ist ein Homolog des hochkonservierten Drosophila Gens lethal giant larvae (lgl), welches in Epithelzellen die Funktion eines neoplastischen Tumorsuppressors und Polaritätsregulators einnimmt. Ein Verlust oder eine verminderte Expression beider Homologe des Gens, hugl-1 und hugl-2, geht einher mit dem Auftreten und der Progression verschiedener epithelialer Tumorerkrankungen wie malignen Melanomen und Brust-, Kolon- oder Lungentumoren. Die exakte Funktion der Homologe Hugl-1 und Hugl-2 bezüglich der Regulation und Aufrechterhaltung der epithelialen Zellpolarität sowie ihre Rolle in der Genese humaner Tumore ist jedoch weitgehend unbekannt. Gänzlich unbekannt ist auch die Bedeutung von Hugl-1 und Hugl-2 als Polaritätsregulatoren für die Ausbildung und den Erhalt der T-Zellmorphologie und -funktion. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, die Polaritäts- und Tumorsuppressorgene hugl-1 und hugl-2 in funktionellen Analysen mittels siRNA-vermitteltem Gen-Silencing in Epithelzellen und T-Lymphozyten zu charakterisieren. Darüber hinaus wurden die Funktionen und Eigenschaften von mgl-2, dem murinen Homologen von hugl-2, im Cre/loxP-vermittelten konditionalen Knockout Mausmodell in vivo analysiert.rnrnZur Charakterisierung der biologischen Effekte von Hugl-1 und Hugl-2 auf das Wachstumsverhalten, Migration und Invasion von Epithelzellen wurden in dieser Arbeit erfolgreich unterschiedliche shRNA-Expressionskonstrukte generiert sowie Hugl-supprimierte Zelllinien etabliert. In vitro Studien sowie in vivo Tumorigenizitätsanalysen lieferten übereinstimmend Hinweise darauf, dass verminderte Hugl-1- und Hugl-2-Expressionsspiegel eine signifikante Rolle in der Vermittlung invasiver und tumorigener Eigenschaften von Epithelzellen spielen. Dabei rief der Verlust beider Homologe deutlich stärkere Reaktionen hervor als die Suppression eines einzelnen Homologen. Zudem wiesen die Überexpression des Zellzyklusregulators Cyclin D1 sowie die Hyperproliferation von Hugl-1- und/oder Hugl-2-depletierten Epithelzellen auf eine wichtige Rolle der beiden Homologe in der Zellzyklusprogression und Zellproliferation hin. Ein geringer Expressionsstatus von Hugl-1 und -2 schien darüber hinaus mit einer verstärkten Resistenzbildung gegenüber Chemotherapeutika zu korrelieren. Im Rahmen dieser Arbeit konnte weiterhin gezeigt werden, dass die untersuchten T-Lymphozyten nur Hugl-1 exprimieren und dass letzteres notwendig für den F-Aktin-vermittelten Erhalt der T-Zellpolarität und -morphologie ist. Hugl-1-supprimierte, über voneinander unabhängige Signalwege (TCR- oder Chemokinrezeptor) stimulierte T-Lymphozyten wiesen eine bedeutende Störung der Lamellipodien- und Uropodausbildung auf und ließen eine Interaktion von Hugl-1 auf Ebene des F Aktins vermuten. Des Weiteren zeigte sich, dass der Polaritätsregulator Hugl-1 die CD3/TCR-induzierte Zelladhäsion positiv beeinflusst. Die Analyse der T-Zellmigration und -motilität offenbarte in Übereinstimmung dazu die Wichtigkeit von Hugl-1 für die Polarisierung und Migration der T-Zellen sowohl im Chemokingradienten als auch auf mDCs. rnrnFür die Aufklärung der funktionellen Rolle von mgl-2 in vivo wurde in dieser Arbeit eine Tamoxifen-induzierbare, Cre/loxP-vermittelte konditionale Mauslinie generiert und analysiert. Die mgl-2-deletierten Tiere wiesen weder signifikante phänotypische Unterschiede noch Abweichungen in der Organanatomie auf und ließen daher auf eine Kompensation durch das im Darmepithel koexprimierte und möglicherweise funktionell redundante mgl-1 Gen schließen.rn

Induktion und Signaltransduktion bei der Expression des Chemokins MCP-1 in Monozyten

Das Chemokin 'Monocyte Chemoattractant Protein-1' (MCP-1) spielt bei inflammatorischen Erkrankungen eine wesentliche Rolle. Verschiedene Zelltypen produzieren MCP-1. Es interessierte, welche Stimuli in Monozyten MCP-1 induzieren können und welche Signaltransduktionskaskaden daran beteiligt sind. Darüber hinaus sollte die Rolle einzelner Transkriptionsfaktoren und Promotorregionen des MCP-1-Gens untersucht werden.Komponenten Gram-positiver und -negativer Bakterien, Phorbolester und Substanzen, die die intrazelluläre Calciumkonzentration erhöhen, induzierten die MCP-1-Expression in einer humanen myelomonozytären Zellinie (THP-1) und in frisch isolierten Monozyten. Die mit Lipopolysaccharid (LPS)-induzierte MCP-1-Expression war stark von der MAPK/ERK-Kinase (MEK)-1/-2 und von I-kappaB Kinasen beziehungsweise NF-kappaB abhängig, dagegen scheinen Calcineurin, Calmodulinkinasen und die 'Mitogen-Activated Protein Kinase' p38 keine entscheidende Rolle zu spielen. Die Thapsigargin (TG)-induzierte MCP-1-Bildung durch Erhöhung der intrazellulären Calciumkonzentration war zusätzlich von Calcineurin und Calmodulinkinasen abhängig. Als nukleäre Transkriptionsfaktoren wurden bei der LPS-Stimulation NF-kappaB sowie AP-1 und zusätzlich NF-ATc3 bei Stimulation durch TG nachgewiesen. Die Untersuchung des MCP-1-Promotors konnte eine Bindung von NF-kappaB- und AP-1-Mitglieder an eine bislang nicht untersuchte distale Region und eine AP-1-Bindung an eine proximale Region nachweisen. Die Ergebnisse lassen den Schluß zu, daß die Aktivierung der MCP-1-Expression durch verschiedene Stimuli unter Beteiligung teilweise unterschiedlicher Signaltransduktionswege abläuft und sowohl eine proximale als auch eine distale Promotorregion des MCP-1-Gens daran beteiligt ist.

Glycopeptidliganden von Zelladhäsionsrezeptoren mit sulfatierter Arabino-Lewis a-Struktur

Selektine sind eine Gruppe von Transmembranglycoproteinen, welche als Adhäsionsmoleküle innerhalb des vaskulären Systems Zelladhäsionsprozesse zwischen Leukozyten und Endothelzellen vermitteln. Das Sialyl-Lewisa Epitop und verwandte Kohlenhydratstrukturen wurden als Liganden der E- und P-Selektine identifiziert. Durch die chemische Synthese verwandter Strukturen verspricht man sich, die im Laufe inflammatorischer Prozesse exprimierten Rezeptoren gezielt blockieren zu können und dadurch pathologische Abläufe wie hämatogene Metastasierungen oder Abstoßungsreaktionen zu bekämpfen. Einige Bereiche der Aminosäuresequenz des E-Selektin-Ligand-1 (ESL-1) treten hochkonservativ auch in anderen Selektinliganden wie MG160 oder PSGL-1 auf und wurden deshalb für die N-Glycosylierung mit einem sulfatierten Oligosaccharid ausgewählt (11). -Val665-Glu-Cys-Arg-Asp-Ile-Val-Gly-Asn(Sulfo-Lea)-Leu-Tyr-Glu-Leu-Glu-Ser-Glu-Asp-Ile682- 11 Im ersten Teil der Arbeit wurde eine Strategie ausgearbeitet, das sulfatierte Trisaccharid 60 im Multigrammaßstab zu synthetisieren. Der endogene Ligand 2 wurde an drei Positionen modifiziert: Austausch der α-L-Fucose gegen die biologisch stabilere α-D-Arabinose, Einführung einer Sulfatgruppe anstelle der N-Acetylneuraminsäure sowie Übergang von O- zu N-glykosidischer Verknüpfung. Die hochregioselektive Einführung der Sulfatgruppe gelingt in sehr guten Ausbeuten durch Vorkomplexierung mit Dibutylzinnoxid und anschließende Umsetzung mit Schwefeltrioxid/Trimethylamin. Durch die Verwendung des anomeren Azids als permanente Schutzgruppe kann das Trisaccharid nach schonender Reduktion zum Amin an ein Asparaginsäurederivat angekuppelt und in einer linearen Synthese nach Fmoc-Strategie als N-Glycosylaminosäure in die Synthese eingebracht werden. Das in der Arbeitsgruppe Kunz entwickelte PTMSEL-Ankersystem 20a erlaubt sowohl die problemlose Synthese als auch die Abspaltung vom polymeren Träger unter sehr milden Bedingungen. Nach dem Entfernen der Benzylester und -ether durch Pd(0) – katalysierte Hydrierung können sulfatierte Glycopeptidsequenzen des Typs 11 über NMR-Spektroskopie (korrelierte Spektren) und Massenspektroskopie (ESI, MALDI) identifiziert werden.

Synthese von Sialyl-Lewis X -Glycopeptiden und -Mimetika als Zelladhäsionsinhibitoren für E-Selektin

Die Selektine initiieren im Verlauf von Entzündungsprozessen einen ersten Zellkontakt zwischen Leukozyten und Endothelzellen und ermöglichen so die Auswanderung der Leukozyten aus den Blutgefäßen in das umliegende Gewebe, wo sie ihre immunologische Wirkung entfalten können. Viele Krankheiten gehen allerdings mit einer übermäßigen, durch Selektine vermittelten Zelladhäsion einher. Daher war es das Ziel dieser Arbeit, Selektininhibitoren zu synthetisieren, die pathologische Zelladhäsionsprozesse, wie man sie z.B. bei rheumatoider Arthritis, bei Erkrankungen der Herzkranzgefäße oder im Verlauf von Tumormetastasierungen findet, unterbinden können. Als Leitstruktur für solche Inhibitoren dient das auf den natürlichen Selektinliganden vorkommende Tetrasaccharid Sialyl-Lewis-X. Sialyl-Lewis-X stellt aber nur einen Teil der natürlichen Selektinliganden dar. Es bindet auch nur im millimolaren Bereich an die Selektine. Die komplexen natürlichen Selektinliganden wie z.B. ESL-1 (E-Selektin-Ligand-1), die an verschiedenen Glycosylierungs-stellen des Glycoproteins Sialyl-Lewis-X präsentieren, binden mit deutlich höherer Affinität an die Selektine. Für eine spezifische Rezeptorbindung sind daher außer dem Tetrasaccharid weitere Partialstrukturen verantwortlich, wobei gezeigt werden konnte, dass ein Anknüpfen von Sialyl-Lewis-X-Derivaten an die Partialsequenz 672-681 des ESL-1 eine Affinitätssteigerung hervorruft. Ein weiterer Nachteil des natürlichen Sialyl-Lewis-X-Tetrasaccharids im Hinblick auf seine pharmakologische Verwendung besteht darin, dass sowohl die fucosidische Bindung als auch die glycosidische Verknüpfung zur Neuraminsäure durch Enzyme leicht gespalten werden, wodurch Sialyl-Lewis-X als potenzielles Anti-Adäsionsmolekül an Wert verliert. Um die Kohlenydratliganden vor einem solchen enzymatischen Abbau zu bewahren, wurden in dieser Arbeit neben der im Sialyl-Lewis-X vorliegenden L-Fucose die im Menschen nicht vorkommenden Kohlenhydrate D-Arabinose und L-Galactose sowie neben der Neuraminsäure die (S)-Cyclohexylmilchsäure zur Herstellung der sechs Glycopeptid-Selektinliganden 1-6 mit der Partialsequenz 672-681 des ESL-1 verknüpft. Die Tetrasaccharide und Tetrasaccharid-Mimetika können aus den geschützten Monosacchariden und der geschützten Cyclohexylmilch-säure in parallelen Synthesen im Gramm-Maßstab hergestellt werden. Die automatisierten Glycopeptid-Festphasensynthesen wurden an einem Peptidsynthesizer nach der Fmoc-Strategie unter Verwendung von mit Asparaginsäure vorbeladenen TentaGel®-Harzen durchgeführt. Die Strukturen aller sechs Glycopeptide 1-6 wurden sowohl durch hoch auflösende massenspektrometrische Analysen als auch durch ein- und zweidimensionale NMR-Experimente belegt. Als Ergebnis dieser Arbeit liegen sechs Sialyl-Lewis-X-Glycopeptide und -Mimetika mit der Partialsequenz 672-681 des ESL-1 vor. Diese werden in Kürze auf ihre Wirksamkeit als Zelladhäsions-inhibitoren für E-Selektin getestet. Daraus sollen sich Erkenntnisse über Struktur-Wirkungs-Beziehungen gewinnen lassen, insbesondere was das kooperative Zusammenwirken von Saccharid- und Peptidteilstrukturen in der Erkennung der Liganden durch das E-Selektin anbetrifft.

Synthetische Glycopeptide mit Sulfatyl-Lewis X-Struktur als potenzielle Inhibitoren der Zelladhäsion

Zelladhäsionsprozesse sind von großer Bedeutung für zahlreiche biologische Prozesse, wie etwa die Immunantwort, die Wundheilung und die Embryogenese. Außerdem spielen sie eine entscheidende Rolle im Verlauf inflammatorischer Prozesse. An der Zelladhäsion sind verschiedene Klassen von Adhäsionsmolekülen beteiligt. Die erste leichte „rollende“ Adhäsion von Leukozyten am Ort einer Entzündung wird durch die Selektine vermittelt. Diese binden über die Kohlenhydrat-Strukturen Sialyl-Lewisx und Sialyl-Lewisa über eine calciumabhängige Kohlenhydrat-Protein-Bindung an ihre spezifischen Liganden und vermitteln so den ersten Zellkontakt, bevor andere Adhäsionsmoleküle (Cadherine, Integrine) die feste Adhäsion und den Durchtritt durch das Endothel bewirken. Bei einer pathogenen Überexpression der Selektine kommt es jedoch zu zahlreichen chronischen Erkrankungen wie z. B. rheumatoider Arthritis, Erkrankungen der Herzkranzgefäße oder dem Reperfusions-syndrom. Außerdem wird eine Beteiligung der durch die Selektine vermittelten Zellkontakte bei der Metastasierung von Karzinomzellen angenommen. Ein Ansatzpunkt für die Behandlung der oben genannten Erkrankungen ist die Gabe löslicher kompetitiver Inhibitoren für die Selektine. Ziel der Arbeit war die Modifikation des Sialyl-Lewisx-Leitmotivs zur Steigerung der metabolischen Stabilität und dessen Einbau in die Peptidsequenz aus der für die Bindung verantwortlichen Domäne des endogenen Selektin-Liganden PSGL-1. Dazu wurden mit einer modifizierten Lewisx-Struktur glycosylierte Aminosäurebausteine dargestellt (Abb.1). Die Verwendung von Arabinose und des Sulfatrestes anstelle von Fusose und Sialinsäure sollte außerdem zu einer gesteigerten metabolischen Stabilität des synthetischen Liganden beitragen. Die so erhaltenen Glycosylaminosäuren sollten nun in die Festphasenpeptidsynthese eingesetzt werden. Aufgrund der großen säurelabilität konnte hier nicht auf das Standartverfahren (Wang-Harz, Abspaltung mit TFA) zurückgegriffen werden. Deshalb kam ein neuartiges UV-labiles Ankersystem zum Einsatz. Dazu wurde ein Protokoll für die Synthese und Abspaltung von Peptiden an diesem neuen System entwickelt. Daran gelang die Synthese des nichtglycosylierten Peptidrückgrats sowie eines mit der dem sulfatierten Lewisx-Motiv versehenen Glycopeptids. Ein vierfach sulfatiertes Glycopeptid, welches durch den Einsatz von im Vorfeld chemisch sulfatierer Tyrosin-Bausteinen dargestellt werden sollte, konnte massenspektrometrisch nachgewiesen werden.

Mucinartige Glycopeptide als Inhibitoren selektinvermittelter Zelladhäsionsprozesse

Es wurden Glycopeptide mit einer Partialsequenz aus der N-terminalen Domäne des natürlichen Selektinliganden PSGL-1 synthetisiert, welche prinzipiell als kompetitive Inhibitoren unerwünschter selektinvermittelter Zelladhäsionsphänomene fungieren könnten. Grundsätzlich könnte es möglich sein, auf diesem Wege entsprechende chronisch entzündliche Krankheiten wie rheumatoide Arthritis zu behandeln und bestimmte akut eintretende schwere Schädigungen von gesundem Gewebe sowie die Metastasenbildung maligner Tumore zu unterdrücken. Das tatsächliche Potential der hergestellten Glycopeptide als Liganden der Selektine kann nun in biologischen Tests geprüft werden. Der gewählte Ausschnitt aus dem P-Selektin-Glycoprotein-Liganden-1 (PSGL-1) reicht von Tyr48 bis Pro59 und umfasst so sämtliche Aminosäurereste der Sequenz, die für das Auftreten einer hochaffinen Rezeptorbindung erforderlich sind. Dabei ist die Seitenkette von Thr57 mit einem O-Glycan modifiziert, welches das in natürlichen Selektinliganden häufig vorkommende Tetrasaccharid Sialyl-Lewisx bzw. ein Mimetikum desselben enthält und die für Mucine typische Form der Anbindung an das peptidische Rückgrat über eine N-Acetyl-α-D-galactosamineinheit aufweist. Zum Aufbau der komplexen Glycopeptidstrukturen wurde zunächst eine Strategie für die Synthese des an die Hydroxylaminosäure gebundenen Oligosaccharids im Gramm-Maßstab ausgearbeitet. Dabei kam der Wahl eines geeigneten Schutzgruppenmusters besondere Bedeutung zu. Das entwickelte Konzept basiert allein auf chemischen Methoden und ermöglicht die parallele Herstellung potentieller Mimetika. So wurde in dieser Arbeit L-Fucose durch D-Arabinose und N-Acetyl-D-neuraminsäure durch (S)-Cyclohexylmilchsäure ersetzt. Die erhaltenen Glycosylaminosäure-Bausteine wurden schließlich in die Glycopeptid-synthesen an der festen Phase eingebracht, welche nach vollständiger Deblockierung die gewünschten Zielverbindungen lieferten.rn

Synthese von Sialyl-Lewis-X-Mimetika durch stereoselektive ortho-C-Glycosylierung von Phenolen

Ziel der Arbeit war es, Sialyl-LewisX-Mimetika auf Basis ortho-C-glycosylierter Phenole als Inhibitoren für die Selektin-Ligand-Wechselwirkungen zu synthetisieren. Dazu wurde zunächst die Stereoselektivität der ortho-C-Mannosylierung untersucht. Dabei wurde gezeigt, dass bei der Umsetzung von Phenolen mit dem benzylgeschützten Mannosyl-trichloracetimidat in Gegenwart von TMSOTf selektiv das β-C-Mannosid erhalten wurde. Gleichzeitig konnte anhand der NMR-spektroskopischen Untersuchungen nachgewiesen werden, dass die in der Literatur beschriebenen α-C-Mannoside von Phenolen tatsächlich β-konfiguriert sind. Wenn Naphthole als Glycosylakzeptoren verwendet wurden, konnten durch Modifikation des Promotors auch die für die Synthese der Mimetika benötigten α-C-Mannoside erhalten werden, wobei ZnCl2 als Promotor die besten Ergebnisse lieferte. Allerdings zeigten die synthetisierten α-C-Mannoside und α-C-Galactoside eine Inversion des Pyranoseringes und lagen in der ungewöhnlichen 1C4-Konformation vor.rnAnschließend konnte auf diese Weise das durch Docking-Studien gefundene Mimetikum (2S)-3-Cyclohexyl-2-[7-hydroxy-8-(α-D-mannosyl)naphthalin-2-yloxy]propionsäure syntheti-siert werden. Es besaß jedoch in Zelladhäsionstests keine ausreichende Aktivität bei der Inhibierung der Selektin-Ligand-Wechselwirkung. Bei den ursprünglichen Dockingstudien war allerdings von der gewohnten 4C1-Konformation ausgegangen worden. Spätere NMR-Experimente und DFT-Berechnungen zeigten, dass das Mimetikum tatsächlich in der 1C4-Konformation vorlag und es deshalb nicht aktiv war. Die synthetisierten Stereo- und Regioisomere zeigten in Zelladhäsionstests ebenfalls keine Aktivität.rnVersuche, die α-1-C-Mannosylnaphthole zu den benötigten 1-C-2-O-Diglycosyl-naphthalinen umzusetzen waren nicht erfolgreich, da die phenolische OH-Gruppe sterisch zu sehr abgeschirmt war, um unter milden Reaktionsbedingungen glycosyliert zu werden, bzw. die α-1-C-Mannosylnaphthaline unter drastischeren Reaktionsbedingungen nicht stabil waren. Daher wurde 1-(2′,3′,4′,6′-Tetra-O-benzyl-β-D-galactopyranosyl)-2-naphthol mit 2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-α-D-mannopyranosyl-trichloracetimidat in Gegenwart von TMSOTf zum ersten synthetischen 1-C-2-O-Diglycosyl-phenol umgesetzt. Nach Abspaltung der Schutzgruppen sollte das erhaltene 1-Galactosyl-2-O-mannosyl-naphthalin enzymatisch zum Sialyl-LewisX-Mimetikum verlängert werden. Es wurde vom Enzym jedoch nicht als Substrat erkannt. Versuche zur chemischen Anbindung des Säurebausteins stehen noch aus.rn