Der Einfluss von TGF-beta1 auf regulatorische T-Zellen in einem murinen Modell f��r Asthma

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, den Einfluss von regulatorischen T-Zellen (Treg) auf die Pathogenese des Asthmas in einem murinen Modell zu untersuchen. Es konnte gezeigt werden, dass die Co-Expression von TGF-��1 und IL-10 auf Treg notwendig ist, um im Tiermodell vor einer Atemwegs-Hyperreagibilit��t (AHR) zu sch��tzen. Nat��rliche Treg konnten keinen Schutz vermitteln. Weiterhin wurde gezeigt, dass der Schutz vor AHR durch TGF-��1 ��ber Empf��nger T-Zellen vermittelt wird. Dabei reichte die alleinige Anwesenheit von TGF-��1 nicht aus, vielmehr musste das Zytokin von Treg exprimiert werden. Ein Einfluss von TGF-��1 ��berexprimierenden Treg auf die peribronchiale Entz��ndung konnte nicht festgestellt werden, wohingegen adoptiver Transfer von nat��rlichen Treg die Eosinophilen Anzahl in der Bronchiallavage signifikant verringern konnte. Dabei korrelierte die Eosinophilie mit den IL-5 Spiegeln in der Bronchiallavage. In dieser Arbeit konnte also eine Entkopplung der Mechanismen von AHR und Entz��ndung festgestellt werden. Die weitere Aufkl��rung der Mechanismen der Suppression der AHR durch TGF-��1 und IL-10 produzierende Treg k��nnte daher die Entwicklung neuer therapeutischer Ans��tze bei Atemwegserkrankungen erm��glichen.

Die Rolle regulatorischer T-Zellen im experimentellen allergischen Asthma

Im ersten Teil der Dissertation wurde in einem experimentellen Asthmamodell demonstriert, dass die Signaltransduktion ��ber IL-6 das Gleichgewicht zwischen Effektorzellen und regulatorischen T-Zellen durch verschiedene Rezeptorkomponenten kontrolliert. Hierbei zeigte sich, dass speziell das IL-6 Trans-Signaling ��ber den sIL-6R die TH2 Cytokinproduktion steuert. Dagegen f��hrt die Blockade des mIL-6R zur Expansion regulatorischer T-Zellen mit suppressiven Eigenschaften. Diese CD4+CD25+ Tregs induzieren au��erdem IFN gamma produzierende CD4+ T-Zellen in der Lunge und verbessern daneben die AHR. Im ��berblick konnte in der vorliegenden Dissertation demonstriert werden, dass IL-6 die Balance zwischen der Funktion von Effektorzellen und regulatorischen T-Zellen in der Lunge ��ber unterschiedliche Wege kontrolliert, dem sIL-6R und dem mIL-6R. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die lokale Blockade der IL-2R alpha- und IL-2R beta-Kette untersucht. Hier konnte gezeigt werden, dass die Blockade der IL-2R beta-Kette zur Verbesserung der AHR als auch der Rekrutierung eosinophiler Granulozyten in den Atemwegen f��hrt. Beide Blockaden f��hren zur Reduktion der TH2 Cytokine IL-4 und IL-5, wohingegen IL-13 nur nach Blockade der IL-2R beta-Kette vermindert sezerniert wird. In diesem Zusammenhang wurde auch die Rolle CD4+CD25+ regulatorischer T-Zellen untersucht, wobei eine Induktion dieser Population in den Lymphknoten nach Blockade der IL-2R beta-Kette nachgewiesen werden konnte. Die Blockade der IL-2R beta-Kette wirkt sich positiv auf experimentelle Asthmastudien aus und stellt somit ein m��gliches therapeutisches Potential dar, erfordert aber teilweise noch weitere Untersuchungen.

Die Rolle von Interleukin-22 bei Asthma bronchiale

Interleukin (IL)-22 ist ein Effektorzytokin, das von Zellen des Immunsystems produziert wird und auf Epithelzellen wirkt. Es nimmt eine duale Rolle ein, indem es abh��ngig vom Gewebe und Zytokinmilieu entweder entz��ndungsf��rdernden oder entz��ndungshemmenden Einfluss aus��bt. ��ber seine Wirkung bei Asthma bronchiale ist bislang noch wenig bekannt. In der vorliegenden Arbeit konnten in einem murinen Modell der allergischen Atemwegsentz��ndung lymphoide Zellen des angeborenen Immunsystems als Hauptproduzenten f��r IL-22 detektiert werden, die bislang noch nicht im Zusammenhang mit Asthma bronchiale beschrieben wurden. Es konnte gezeigt werden, dass IL-22- defiziente M��use eine verst��rkte Atemwegsentz��ndung entwickelten und sich die IL-22-Defizienz in diesem Modell entz��ndungsf��rdernd auf die induzierte Atemwegsentz��ndung auswirkte. Mit Hilfe einer murinen bronchialen Epithelzelllinie wurden die Mechanismen des IL-22 und die Expression Asthma-relevanter Mediatoren untersucht. Der beobachtete inhibierende IL-22-Effekt lie�� sich mit Hilfe seines nat��rlichen Antagonisten IL-22BP neutralisieren. Diese entz��ndungshemmende Wirkung des IL-22 konnte ebenfalls in Wildtyp-M��usen, denen rekombinantes IL-22 intratracheal verabreicht worden war, best��tigt werden.

Klinische, zellul��re und immunologische Charakterisierung des Asthmas im Hinblick auf die Asthma-Kontrolle

Asthma, eine der h��ufigsten Atemwegserkrankungen, ist ein komplexes Syndrom heterogener Ph��notypen. Ihnen allen gemeinsam ist eine Entz��ndung der Atemwege mit bronchialer Hyperreagibilit��t und variabler Atemwegsobstruktion.Die Globale Initiative f��r Asthma (GINA) empfiehlt, eine Therapie am Grad der Asthmakontrolle zu orientieren. Es wird dabei zwischen kontrolliertem, teilweise kontrolliertem und unkontrolliertem Asthma unterschieden. rnDer vorliegenden Dissertation lag die Frage zu Grunde, inwieweit etablierte klinische, funktionelle, zellul��re und Labor-Parameter den Verlauf der Asthmakontrolle wiederspiegeln. Diese Parameter sollten bei klinisch stabiler Kontrolle ebenfalls stabil bleiben, oder eine ��nderung gleichgerichtet wiedergeben. Hierzu wurden 120 Patienten im Hinblick auf ihre Asthmakontrolle kategorisiert und im zeitlichen Verlauf an 3 Visiten zum Zeitpunkt 0 (V0), eine Woche (V1) und 6 Monate sp��ter (V2) untersucht. Bestimmt wurden klinische Parameter wie Frageb��gen zur Asthmakontrolle (ACQ-5 Scores), funktionelle Parameter wie die Lungenfunktion oder die bronchiale Hyperreagibilit��t zellul��re Parameter wie das Stickoxid im Exhalat (NO) als Korrelat der bronchialen Entz��ndung, der Anteil eosinophiler Granulozyten im Sputum, die Anzahl eosinophiler und neutrophiler Granulozyten pro nl Blut, die Gesamt-IgE-Spiegel im Serum und zellbiologische Parameter wie die Anteile regulatorischer T-Zellen und die Anteile der T-Zellen, die die Zytokine IFN-��, IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 und IL-17 produzieren.rnDie Verbesserung der Asthmakontrolle spiegelte sich in einem R��ckgang des NOs um im Median 5,8 ppb (p=0,016) nach 6 Monaten wieder. Sonst lie��en sich keine Parameter identifizieren, die die Entwicklung der Asthmakontrolle in positiver oder negativer Richtung abbildeten. Bemerkenswerter Weise bildete selbst der ACQ, der als etabliertes Messinstrument f��r die Asthmakontrolle gilt, diese Ver��nderungen nicht ab.rnZellbiologisch unterschieden sich die Patienten mit unterschiedlicher Asthmakontrolle weder in den Anteilen Zytokin-produzierender T-Zellen, noch im Anteil regulatorischer T-Zellen.rnDie Anteile der Zytokin-produzierenden T-Zellen unterlagen im zeitlichen Verlauf zwar deutlicheren Schwankungen als die Anteile regulatorischer T-Zellen, im Median blieben beide jedoch konstant. Die Anteile der Zytokin-produzierenden T-Zellen und regulatorischer Zellen lassen also keine R��ckschl��sse auf den Verlauf der Asthmakontrolle zu.rnZusammenfassend ist lediglich das NO geeignet, die Verbesserung der Asthmakontrolle zu beschreiben. Deshalb erscheint es im Angesicht der Ergebnisse dieser Studie nicht sinnvoll, therapeutische Entscheidung lediglich auf Basis eines einzelnen Parameters zu treffen. Hierf��r bleibt nach wie vor nur die Zusammenschau verschiedener Untersuchungsergebnisse.rn

Molekulare Reaktionsmuster in dendritischen Zellen nach Allergenexposition

Allergische Erkrankungen, wie zum Beispiel die allergische Rhinitis oder das allergische Asthma haben im Verlauf der letzten vier Jahrzehnte stark zugenommen. So leidet heute jeder vierte bis f��nfte Mensch an einer Allergie. Ausgel��st wird diese IgE-vermittelte Hypersensibilit��tsreaktion des Typs I (Allergie vom Soforttyp) von Allergenen und beruht auf der Aktivierung von Mastzellen durch die Interaktion eines Antigens mit dem an eine Mastzelle ��ber die Fc���-Rezeptoren gebundenen IgE-Molek��ls. Die degranulierende Mastzelle sezerniert Mediatoren, was zu einem Auftreten von allergischen Symptomen f��hrt. Die Bildung von IgE wird durch das von TH2-Zellen produzierte Zytokin IL-4 induziert. Das von TH1-Zellen produzierte Zytokin IFN-��� ist in der Lage die Sekretion von IL-4 zu inhibieren, wie auch IL-4 hemmend auf die Produktion von IFN-��� wirkt. Dieses TH1-/ TH2-Gleichgewicht ist bei allergischen Erkrankungen in Richtung TH2 verschoben. Allergene werden von antigenpr��sentierenden Zellen aufgenommen, prozessiert und auf der Zelloberfl��che pr��sentiert. Die potentesten antigenpr��sentierenden Zellen sind die dendritischen Zellen, die nach Kontakt mit einem Allergen in die benachbarten Lymphknoten wandern, ausreifen und kostimulatorische Molek��le exprimieren. Sie sind so in der Lage T-Zellen zu aktivieren und entweder in TH1- oder in TH2-Zellen differenzieren zu lassen. Die zytokinabh��ngige TH1- beziehungsweise TH2-Differenzierung f��hrt zur Aktivierung der Januskinasen. Im aktiven Zustand phosphorylieren sie STAT-Molek��le, die dimerisieren und in den Zellkern translozieren, wo sie unter anderem als Transkriptionsfaktoren f��r Zytokingene dienen. Unreife humane dendritische Zellen von Allergikern zeigen nach Stimulation mit Proteinallergenen eine schnelle Phosphorylierung des mit der TH2-Entwicklung assoziierten STAT6. Dahingegen sind TH1-Antwort hervorrufende Kontaktallergene nicht in der Lage STAT6 oder andere STAT-Molek��le in dendritischen Zellen zu induzieren. Die Transkriptionsfaktoren T-bet und GATA3 sind ebenfalls von Bedeutung f��r die TH1-/TH2-Entwicklung, da T-bet ausschlie��lich in TH1-Zellen, GATA3 nur in TH2-Zellen exprimiert wird. Die Regulation des JAK/STAT-Weg unterliegt den Molek��len der intrazellul��r vorkommenden Familie der SOCS-Proteine. SOCS3 ist in TH2-Zellen h��her exprimiert als SOCS1, wohingegen SOCS1 in TH1-Zellen eine erh��hte Expression gegen��ber SOCS3 aufweist. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von Proteinallergenen auf humane dendritische Zellen untersucht. Zun��chst konnte eine morphologische Ver��nderung der unreifen dendritischen Zellen nach Kontakt mit dem Allergenextrakt beobachtet werden. Die beginnende Ausreifung der Zellen konnte mittels Durchflu��zytometrie anhand der kostimulatorischen Molek��le CD80 und CD86, insbesondere aber ��ber den Marker f��r reife dendritische Zellen CD83, nachgewiesen werden. Die zu beobachtende beginnende Ausreifung scheint ein Effekt des bakteriellen Lipopolysaccharids (LPS) zu sein, das in dem Allergenextrakt vorkommt, da sich durch Zugabe des kationischen Antibiotikums Polymyxin B die beginnende Reifung verhindern lie��. Auf RNA-Ebene war es im Rahmen dieser Arbeit m��glich, den Einfluss verschiedener Allergene auf unreifen humanen dendritischen Zellen n��her zu charakterisieren. So weisen unreife humane dendritische Zellen nach Kontakt mit Proteinallergenextrakt ein TH2-assoziiertes Genexpressionprofil auf, was sich durch eine erh��hte relative Expression der Gene SOCS3 und GATA3 auszeichnet. Im Gegensatz hierzu zeigen unreife humane dendritische Zellen nach Inkubation mit dem Kontaktallergen MCI/MI eine erh��hte relative Expression des Gens T-bet, was mit einer TH1-Antwort assoziiert ist. Nach Zugabe des ���TH1-/ TH2-neutralen��� Tetanustoxoids konnten erh��hte relative Expressionen der Gene GATA3, T-bet und SOCS3 gemessen werden. Die Ergebnisse in dem in dieser Arbeit benutzten humanen in vitro System geben Anlass zur Hypothese, dass die Art der Immunantwort (TH1 versus TH2) sich bereits auf Ebene der dendritischen Zellen anbahnt. GeneChip-Analysen mittels High Density Micro Arrays von unreifen humanen dendritischen Zellen, die entweder mit Proteinallergenextrakt oder mit LPS in Ber��hrung kamen, zeigten statistisch signifikant regulierte Gene, die allerdings keine Gemeinsamkeiten aufwiesen. Es konnten f��r die mit Alllergenextrakt gepulsten dendritischen Zellen insgesamt 10 Gene identifiziert werden, jedoch gelang es nicht, diese n��her zu deuten oder in einen Zusammenhang mit der allergischen Erkrankung oder der dendritischen Zelle zu bringen. F��r die mit LPS, dem st��rkeren Stimulus, gepulsten dendritischen Zellen konnten 40 Gene identifiziert werden, die unter anderem f��r die Maturierung der dendritischen Zelle verantwortlich sind. Zudem war es m��glich, die Daten der Arrays auf Proteinebene exemplarisch anhand des Chemokins CXCL2 (Gro-��) zu verifizieren.

Rolle von NFATc2 in einem murinen Asthmamodell

Nuclear factor of activated T cells (NFAT) ist eine Familie der Transkriptionsfaktoren, welche eine wichtige Rolle bei der Regulation der T-Zellvermittelten Signalkaskade in der Lymphozytenpopulation spielt. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Nuclear Factor of Activated T cells-2 (NFATc2) defiziente M��use einen erh��hten Atemwegswiderstand, einen pathologische Ver��nderung der Lunge und einen erh��hten IgE Spiegel im Vergleich zu den Wildtypen vorweisen. Die NFATc2 Defizienz konnte ebenfalls sowohl mit einer erh��hten Anzahl an Th2 und Th17 Zellen, die eine erh��hte Proliferation vorweisen, als auch einer erniedrigten Anzahl an CD8+ CD122- T-Zellen, die geringere Mengen an IFN-g produzieren, in Verbindung gebracht werden. Die aus den NFATc2(-/-) M��usen isolierten CD4+ T-Zellen zeigen im Vergleich zu denen der Wildtypen neben der erh��hten Proliferation einen vermehrte Aktivierung (CD4higCD44highCD69high). Weiterhin konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass in Anwesenheit eines Allergens, die NFATc2(-/-) M��use eine erh��hte Anzahl an regulatorischen T-Zellen (CD4+CD25+Foxp3+GITR++) in der Lunge vorweisen, die wiederum die Effektorzellen in diesen hemmen. Ein Grund f��r die geringere Freisetzung an IFN-g durch die CD8+ T-Zellen in den NFATc2 defizienten M��usen ist eine erh��hte Subpopulation von CD8+CD122+ (IL-2Rb Kette) CD127hi (IL-7Ra Kette) ���long-lived memory Zellen��� in den NFATc2(-/-) M��usen. Diese besitzen einen regulatorischen Effekt, so dass immundefiziente SCID M��use, die in einem adoptiven Transfer mit OVA-spezifischen CD8+ und CD4+ T-Zellen, welchen aus NFATc2(-/-) M��use isoliert werden, behandelt wurden, eine erh��hten Atemwegswiderstand, eine erh��hte IL-17 und eine erniedrigte IFN-g Produktion vorweisen. Eine Depletion der memory CD8+CD122+IL-7Rhigh T-Zellen hebt dagegen die verringerte IFN-g Produktion der CD8+CD122- T-Zellen auf und f��hrt zu einer Erniedrigung des Atemwegswiderstandes in einem SCID Model Zusammenfassend zeigen unsere Untersuchungen, dass sowohl die IFN-g Produktion der CD8+ Effektor T-Zellen als auch die Anzahl an CD4+CD25+Foxp3+GITR++ regulatorischen T-Zellen die Entwicklung der Th2 und Th17 als auch die H��he des Atemwegswiderstandes unterdr��ckt.

Isolierung und Charakterisierung allergener Proteine aus der Amerikanischen Schabe (Periplaneta americana)

Allergie gegen Schaben ist eine der Hauptursachen f��r das Auftreten von allergischem Asthma und allergischer Rhinitis. Verursacht werden diese Krankheiten durch die Schabenallergene. Obwohl bisher zahlreiche Allergene identifiziert wurden, ist bisher nicht bekannt, was ein Protein tats��chlich zu einem Allergen macht. Um die intrinsischen Eigenschaften von Allergenen besser verstehen zu k��nnen, wurden in dieser Arbeit Reinigungsprotokolle f��r die zwei Allergenklassen Per a 3 und Per a 9 aus der Amerikanischen Schabe entwickelt und die Allergene biochemisch und immunologisch charakterisiert. Die Besonderheit der Per a 3-Allergene liegt zum einen darin, dass bisher keine kreuzreagierenden Allergene bekannt sind und zum anderen, dass es sich um -hinsichtlich Temperatur, Harnstoff und Hydrolyse- sehr stabile hexamere Proteine handelt. Zudem sind sie in ihrer nativen hexameren Oligomerisierung st��rkere Allergene und in dissoziierter Form k��nnten sie geeignete Kandidaten f��r eine Immuntherapie sein. Proteinbiochemisch sind die Per a 3-Allergene als Hexamerine einzustufen. Bei Per a 9 handelt es sich um eine monomere Arginin-Kinase mit allergenem Potential. Aufgrund der weiten Verbreitung der Arginin-Kinasen, den hohen Sequenzidentit��ten zu weiteren Invertebraten-Arginin-Kinasen und den bisher bekannten Kreuzreaktionen sind diese Proteine aus Invertebraten wahrscheinlich als Pan-Allergene einzustufen.

Neue Aspekte zur effektiven bronchialen Applikation inhalativer Medikamente im Kindesalter

Zur bronchialen Deposition von Arzneimitteln stehen im Wesentlichen drei Inhalationssysteme zur Verf��gung: (1) Dosier-Aerosole (pressurized Metered Dose Inhaler, pMDI), (2) Trockenpulver-Inhalatoren (Dry Powder Inhaler, DPI) und (3) Druckluftvernebler zur Feuchtinhalation. Der Erfolg einer Inhalationstherapie h��ngt neben anderen Faktoren (s.u.) wesentlich vom Depositionsverhalten des als Aerosol inhalierten Medikamentes ab. Wie viel wirksame Substanz lagert sich an welchen Stellen der Atemwege ab und welche Dosis erreicht letztlich die kleinen Atemwege? Einflussfaktoren sind hier vor allem die Partikelgr����e und die Inhalationstechnik. So verlangen beispielsweise DPI���s einen respiratorischen Spitzenfluss (PIF) von mindestens 30 l/min, wohingegen bei der Verwendung von pMDI���s ein gleich bleibender PIF von 40 bis 90 l/min erw��nscht ist. Die f��r das jeweilige Inhalationssystem optimale Atemtechnik muss also vom Patienten erlernt werden. Mit den eigenen Arbeiten soll das Verst��ndnis inhalativer Vorg��nge sowie die bronchiale Deposition von inhalativen Medikamenten bei p��diatrischen Patienten verbessert werden. Aus der Vielzahl der Inhalatoren w��hlten wir f��r unsere Versuche f��nf Systeme aus, deren unterschied-liche Anforderungen an den Patienten repr��sentativ ��berpr��ft wurden: (1) DPI mit mittlerem Widerstand: Diskus��, (2) DPI mit hohem Widerstand: Turbohaler��, (3) pMDI: Autohaler��, (4) pMDI f��r S��uglinge: Budiair�� mit verschiedenen Vorsatzkammern (Babyhaler��, AeroChamber�� Plus small und medium) und (5) nachf��llbarer DPI mit niedrigem Widerstand: MAGhaler��. F��r unsere Studien unverzichtbar war au��erdem ein Testsystem, mit dem die F��higkeit der Patienten ��berpr��ft und verbessert werden kann, einen bestimmten Inhalator effektiv zu benutzen, d.h. das gew��nschte Atemman��ver durchzuf��hren und damit eine optimale Medikamenten-Deposition zu erreichen. Erste Untersuchungen ergaben, dass die kommerziell auf dem Markt verf��gbaren Testsysteme suboptimal sind, weil sie sich nur auf die Messung des PIF���s konzentrieren und andere f��r die Deposition wichtige Parameter (Beschleunigung, Inhaltionsdauer etc.) au��er Acht lassen. Wir entwickelten daher den Inhalation-Manager, der die Dokumentation des gesamten Atemman��vers erm��glicht. Es handelt sich dabei um ein computerbasiertes Mess- und Kontrollsystem, das unmittelbar nach der Inhalation ein optisches feedback des gesamten Man��vers inklusive des generierten Partikelspektrums liefert. Die daraus weiterentwickelte Schulungssoftware erm��glicht die individuelle Schulung verschiedener Inhalationsman��ver auch mit neuen Inhalatoren. Patient und Arzt erhalten eine optische R��ckmeldung, die den Erfolg oder Misserfolg der Inhalation erkennen l��sst. Erste Schulungen mit dem neuen System von p��diatrischen Patienten mit Asthma bronchiale verliefen positiv: der Anteil der optimalen Inhalationsman��ver und damit auch der Therapieerfolg stiegen an. Allerdings zeigte sich auch, dass verschiedene Systeme nicht gleichzeitig geschult werden sollten. Generelle Schwierigkeiten bereitet die Inhalationstherapie von Kindern bis etwa zum 4. Geburtstag, da diese meist gar kein Inhalationsman��ver erlernen k��nnen. Die Medikamente m��ssen somit durch den Ruheatemfluss ins Bronchialsystem transportiert werden, wobei Dosieraerosole mit Vorsatzkammern (Spacer) oder Vernebler mit Masken zum Einsatz kommen sollten. Bei der Inhalation mit Spacer war bislang unklar, wie viel Prozent der Nominaldosis letztlich in die Lunge gelangen und therapeutisch wirksam werden. Unsere in-vitro Studien mit einem Dosieraerosol und verschiedenen Spacern zeigten, dass nach f��nf Atemz��gen maximal 20% der Nominaldosis das Ger��t bzw. den Spacer verlassen. Nach nur einem Atemzug und bei Verwendung bestimmter Spacer (gro��es Totraumvolumen) betr��gt dieser Wert sogar nur 5%. Dieses Ergebnis belegt, dass man vom S��uglings- bis zum Erwachsenenalter nahezu die gleiche Nominaldosis verabreichen kann, da durch unterschiedliche Inhalationsman��ver und ���systeme die wirksame Dosis extrakorporal auf die altersentsprechende Dosis reduziert wird. Ein besonderes Problem ergibt sich schlie��lich bei der Feuchtinhalation mit Druckluftverneblern. Hier darf die Kompatibilit��t von unterschiedlichen Inhalationsl��sungen nicht au��er Acht gelassen werden. So gaben in unserer Mukoviszidose-Ambulanz viele Betroffene an, aus Zeitgr��nden unterschiedliche Inhalationsl��sungen bei der Feuchtinhalation zu mischen. Physikalisch-chemische Inkompatibilit��ten k��nnen dann die Wirksamkeit der Therapie beeintr��chtigen und auch zu unerw��nschten Nebenwirkungen f��hren. In einer interdisziplin��ren Arbeitsgruppe mit Chemikern und Pharmazeuten untersuchten wir daher die Mischbarkeit von h��ufig genutzten Inhalationsl��sungen (Salbutamol, Ipratropium, Cromoglicins��ure, Budenosid, Tobramycin und Dornase Alpha) und stellten die Ergebnisse (m��gliche Inhaltionskombinationen) tabellarisch zusammen.

Induktion regulatorischer T-Zellen zur Inhibition allergenspezifischer Immunantworten im Mausmodell der Typ I-Allergie

Die Induktion regulatorischer T-Zellen (Treg) spielt im Zusammenhang mit der Kontrolle allergenspezifischer Reaktionen, insbesondere auch im Rahmen einer erfolgreichen Hyposensibilisierung mit hohen Allergendosen, eine zentrale Rolle. In der vorliegenden Arbeit wurden die Mechanismen der Rekrutierung allergenspezifischer Treg daher in einem Mausmodell untersucht, in dem analog zur spezifischen Immuntherapie (SIT) die repetitive Verabreichung von hohen Antigendosen einen IgE-spezifischen Suppressionsmechanismus aktiviert, w��hrend die Injektion niedriger Antigendosen eine potente IgE-Antwort induziert. Th1-Zellen sowie konventionelle CD4+CD25+ oder CD8+CD28- Treg konnten als Vermittlerpopulationen des suppressiven Effektes in hochdosig immunisierten M��usen ausgeschlossen werden. Mittels Transferexperimenten wurden erstmals CD4-CD8- doppelt negative Treg als eine die IgE-Suppression vermittelnde Zellpopulation identifiziert. Desweiteren wurden DNA-Transferexperimente durchgef��hrt, mit dem Ziel, adaptive Treg zum Zwecke der Inhibition allergenspezifischer Immunreaktionen zu induzieren. Dazu wurden IL-10- bzw. TGF-��-kodierende Plasmide (pCMV-IL-10, pCMV-TGF-��) hergestellt und in Kombination mit einem Plasmid, welches das Modellallergen ��-Galaktosidase (��Gal) unter der Kontrolle des DC-spezifischen Fascin-Promotors (pFascin-��Gal) kodierte, M��usen mit der Genpistole appliziert. Die Expression des Modellallergens in Verbindung mit der konstitutiven Produktion von immunsuppressiven Zytokinen sollte bei den mit den transfizierten DC interagierenden antigenspezifischen T-Zellen zu einer verst��rkten Differenzierung von Treg f��hren. Die Experimente zeigten, dass die Koapplikation von IL-10-kodierenden Plasmiden eine Immunsuppression induziert, die sich in einer verminderten antigenspezifischen Antik��rperproduktion, Zytokinproduktion und CTL-Induktion zeigt, die jedoch bei nachfolgender Sensibilisierung mit ��Gal-Protein nicht aufrechterhalten werden kann. Dahingegen f��hrte die Koapplikation von TGF-��-kodierenden Plasmiden verbunden mit einer nachfolgenden Sensibilisierung zu einer leichten Inhibition der IgG1- und IgG2a-Produktion verglichen mit der Vakzinierung mit pFascin-��Gal allein. Dieser inhibitorische Effekt von pCMV-TGF-�� wurde interessanterweise nicht bereits nach der DNA-Immunisierung, sondern erst nach Sensibilisierung mit dem Protein beobachtet.

Generierung leicht dispergierbarer Inhalationspulver mittels Spr��htrocknung

Das Ziel dieser Arbeit besteht darin, die M��glichkeiten der Spr��htrocknung f��r die Generierung von Inhalationspulvern zur Therapie von Lungenkrankheiten zu nutzen. Die Erzeugung von physikalisch stabilen und leicht dispergierbaren Partikeln steht hierbei im Vordergrund. Aufgrund von physiko-chemischen Untersuchungen (Glas��bergangstemperatur, Fragilit��t, Relaxationsverhalten, Hygroskopizit��t) unterschiedlicher amorpher Hilfsstoffe (Lactose, Raffinose, Dextrane, Cyclodextrine) ist f��r Hydroxypropyl-��-Cyclodextrin das gr����te Potential f��r die Stabilisierung eines Wirkstoffes innerhalb einer amorphen Matrix erkennbar. Spr��hgetrocknete Partikel weisen im Vergleich zu strahlgemahlenen Partikeln g��nstigere Dispergier- und Depositionseigenschaften auf. Dies ist vorrangig auf gr����ere Ber��hrungsfl��chen zwischen strahlgemahlenen Partikeln zur��ckzuf��hren. Kugelf��rmige spr��hgetrocknete Partikel besitzen dagegen aufgrund einer punktf��rmigen Ber��hrung geringere Haftkr��fte. Versuche mit unterschiedlich stark gefalteten Partikeloberfl��chen weisen auf geringere Haftkr��fte hin, wenn sich die Partikel an Stellen geringerer Kr��mmungsradien ber��hren. Dispergierversuche in einer definierten Rohrstr��mung (Deagglomerator) lassen auf einen kaskadenartigen Agglomeratzerfall schlie��en. Durch Spr��heinbettung unterschiedlicher Modellwirkstoffe (Salbutamolsulfat, Ipratropiumbromid, Budesonid) in Hydroxypropyl-��-Cyclodextrin konnten sowohl Einzelformulierungen als auch eine Kombinationsformulierung mit allen drei Wirkstoffen erzeugt werden. Diese weisen bei einem Wirkstoffgehalt bis max. 14% selbst nach vierw��chiger Offenlagerung bei 40��C und 75% r.F. keine bzw. nur geringf��gige Ver��nderungen in der ���Fine Particle Dose��� (FPD) auf. Die ���Fine Particle Fraction��� (FPF) liegt bei diesen Formulierungen im Bereich von 40% bis 75%. In Verbindung mit einem geeigneten Pack- bzw. Trockenmittel, ist hierbei mit einer physikalischen Stabilit��t zu rechnen, die eine sinnvolle Produktlaufzeit eines Inhalationspulvers erm��glicht. Formulierungen mit h��heren Wirkstoffkonzentrationen zeigen dagegen st��rkere Ver��nderungen nach Stresslagerung. Als Beispiel einer kristallinen Spr��htrocknungsformulierung konnte ein Pulver bestehend aus Mannitol und Budesonid erzeugt werden.

Optimierung der Inhalationstherapie bei Kindern und Mukoviszidose-Patienten

Die pulmonale Applikation von Arzneimitteln hat in den vergangenen Jahren zu- rnnehmend an Bedeutung gewonnen und wird vor allem in der lokalen Therapie bei Asthma, COPD und Mukoviszidose genutzt. Als neues innovatives Inhalationsger��t befindet sich der Respimat�� seit 2004 auf dem Arzneimittelmarkt und ist bisher nur f��r Erwachsene zugelassen. Daher wurden im Rahmen dieser Arbeit die Anwendbarkeit und die Modifikation des Respimats�� bei Kindern untersucht. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass Kinder ab einem Alter von f��nf Jahren f��hig sind suffizient mit dem Respimat�� zu inhalieren und gute Werte f��r die estimierte Intrathorakaldosis zu erreichen. Besonders Kinder von 9-12 Jahren und Patienten mit DPI- oder Autohaler��-Inhalationserfahrung erreichten aufgrund eines hohen Atemflusses eine niedrigere estimierte Intrathorakaldosis als es das Potenzial des Respimats�� erlaubt h��tte. Durch den Einbau eines h��heren internen Widerstands in den Orginalrespimat�� wurde der Atemfluss signifikant verlangsamt und die Intrathorakaldosis erh��ht. Des Weiteren wurden in der vorliegenden Arbeit die physikalisch-chemische Kompatibilit��t und die aerodynamischen Eigenschaften von Mischinhalationsl��sung/-suspensionen untersucht. In der Praxis mischen Muko-viszidose-Patienten oftmals mehrere Fertigarzneimittel und inhalieren diese simultan. Dadurch wird der Zeitaufwand der t��glichen Inhalation reduziert und die Compliance sowie die Lebensqualit��t verbessert. Die 4er Kombination aus Colistimethat mit konservierungsmittelfreier Salbutamolsulfat, Ipratropiumbromidinhalationsl��sungen und Fluticason-17-propionatinhalationssuspension erwies sich als physikalisch-chemisch kompatibel. Die entwickelte mikrobiologische Wertbestimmungsmethode erwies sich als robust, pr��zise, gut reproduzierbar und erf��llte alle Anforderungen des statistischen Modells. Weiterhin wurden die aerodynamischen Eigenschaften einer praxisrelevanten 3er Mischinhalationssuspension aus Salbutamolsulfat, Ipratropiumbromid und Fluticason-17-propionat im Vergleich zu deren konsekutiven Vernebelung mittels Kaskadenimpaktion betrachtet. Die Charakteristik des erzeugten Aerosols ��nderte sich f��r simultan vernebeltes Salbutamolsulfat und Ipratropiumbromid nicht, wohingegen Fluticason-17-propionat bei simultaner Vernebelung eine Reduktion des MMADs, der delivered dose und der recovery aufwies. Dennoch ist die inhalative Glukokortikoiddosis ausreichend hoch um eine effektive antiinflammatorische Wirkung zu gew��hrleisten. Daher kann die simultane Inhalation der 3er Kombination empfohlen werden und somit die Compliance und die Lebensqualit��t von Mukoviszidosepatienten erh��ht werden.rn

Methodische Untersuchung zur Diagnostik der bronchialen Hyperreagibilit��t mit Hilfe eines inhalativen Methacholin-Provokationstests

Die unspezifische Provokation mit Methacholin ist die am weitesten verbreitete und akzeptierte Methode zur Diagnose bzw. zum Ausschluss der bronchialen Hyperreagibilit��t bei Patienten mit Verdacht auf ein Asthma bronchiale und zu dessen Therapiekontrolle. Um die Sicherheit und die Genauigkeit der Methode weiter zu verbessern, wurde daher ein Dosimeterprotokoll entwickelt, das die inhalierte Methacholin-Dosis anstatt durch die Erh��hung, d.h. in der Regel Verdoppelung, der Methacholinkonzentrationen nur durch Erh��hung der Anzahl der Inhalationen bei konstanter, niedriger Konzentration der Methacholinl��sung steigert. Dieses neue Protokoll wurde verglichen mit anderen weit verbreiteten Methacholin-Provokationsprotokollen. Die Methacholinchlorid-L��sung (1,75 mg/ml) wurde mit Hilfe des Dosimetersystems ZAN 200 ProvAir II sowie des Verneblertopfes DeVilbiss 646 vernebelt. 15 Asthmapatienten mit einer vor der Provokation normalen Lungenfunktion (FEV1 98 +/- 9 % PN) und 18 Lungengesunde (FEV1 110 +/- 12 % PN) nahmen an der Testreihe teil. Begonnen wurde mit einer Dosis von 20 ��g Methacholinchlorid (= eine Inhalation); beendet wurde der Versuch bei einer Kumulativdosis von 2000 ��g Methacholinchlorid, wenn nicht vorher ein Kriterium f��r einen positiven Test und damit f��r einen Versuchsabbruch erf��llt wurde. Abbruchkriterien waren entweder ein Abfall der FEV1 um 20 % des Ausgangswertes oder ein Anstieg des totalen Atemwegswiderstandes auf ��� 0,5 kPa*s/l. Mittels linearer Regression wurden die Provokationsdosen PD 20 FEV1 und PD Rtot ��� 0,5 berechnet. Im Vergleich mit anderen Protokollen zeigte sich, dass auch das neue Protokoll zuverl��ssig und sicher zwischen gesund und krank unterscheidet. Der Median der PD 20 FEV1 liegt in der Gruppe der Asthmatiker bei 222 ��g, bei den Lungengesunden bei 2000 ��g; daraus ergibt sich ein p-Wert von < 0,001. In Bezug auf die PD Rtot ��� 0,5 liegt der Median bei den Asthmatikern bei 122 ��g, in der Gruppe der Lungengesunden bei 2000 ��g; hieraus errechnet sich ebenfalls ein p-Wert von < 0,001. Sensitivit��t und Spezifit��t der Methode wurden mittels ROC-Kurven untersucht. Basierend auf der PD 20 FEV1 liefert die Methode f��r die Diagnose einer bronchialen Hyperreagibilit��t bei einer Enddosis von 1000 ��g Methacholinchlorid eine Sensitivit��t von ��ber 93 % und eine Spezifit��t von 83 %; basierend auf der PD Rtot ��� 0,5 liegt die Sensitivit��t bei einer Dosis von 1000 ��g bei 90 %, die Spezifit��t bei 89 %. F��r die gemeinsame Betrachtung der parameterspezifischen Provokationsdosen PD 20 FEV1 und PD Rtot ��� 0,5, der PD Minimal, bei 1000 ��g liegt die Sensitivit��t bei ��ber 93 % und die Spezifit��t bei 83 %. Daher k��nnen 1000 ��g als Schwellendosis f��r den Ausschluss einer bronchialen Hyperreagibilit��t zum Untersuchungszeitpunkt angesehen werden, und der Test darf an diesem Punkt abgebrochen werden. Grunds��tzlich ist festzustellen, dass die Diagnostik der bronchialen Hyperreagibilit��t sicher und genau mit Hilfe eines Dosimeterprotokolls erfolgen kann, das die Methacholin-Dosis nur durch die Steigerung der Inhalationen bei gleichbleibender Konzentration der Methacholinl��sung erh��ht. Die Schwellendosis zwischen normaler und pathologischer bronchialer Reaktion, Sensitivit��t und Spezifit��t sowie die Trennsch��rfe der Methode sind sehr gut vergleichbar mit anderen bisher etablierten Protokollen.

Die Beeinflussung einer Th2-Zell-vermittelten Immunantwort durch Interleukin-1-alpha am Beispiel des murinen allergischen Asthmas

Dass durch IL-1�� die Th1-vermittelte Immunreaktion der kutanen Leishmaniasis beeinflusst werden kann, konnte unsere Arbeitsgruppe bereits zeigen. Daran ankn��pfend war das Ziel meiner Dissertation zu pr��fen, ob sich diese Erkenntnisse im Modell des murinen allergischen Asthmas reproduzieren lassen, auch im Sinne eines zuk��nftigen therapeutischen Nutzens f��r die Behandlung dieser epidemiologisch hochrelevanten Erkrankung. Daneben sollte die Verwendung der gesamten murinen Lunge als Quelle f��r Untersuchungsmaterial erschlossen werden. Zu diesem Zweck wurden bei BALB/c M��usen ein (OVA)/Alum-induziertes allergisches Asthma in Gegenwart oder Abwesenheit von IL-1�� generiert. Anschlie��end wurde eine broncheoalveol��re Lavage (BAL) durchgef��hrt, bzw. die komplette linke Lunge gewonnen und prozessiert. Der Einfluss von IL-1�� auf den Ph��notyp der Th2-vermittelten Immunantwort lie�� sich auf zytomorphologischer, durchflusszytometrischer und Zytokin-Ebene nachweisen. So zeigte ein Teil unserer Ergebnisse, dass nach der fr��hen Gabe eine Tendenz zur Verlagerung des Gewichtes der Abwehrreaktion von Th2 in Richtung Th1 besteht. Ebenso fanden sich Hinweise f��r eine relative Augmentation der Th2-Antwort durch den Einsatz von IL-1�� zu einem sp��teren Zeitpunkt. Eine absolute Verst��rkung der Th2-Reaktion auf OVA durch IL-1�� konnten wir nicht messen. Hier scheint mit OVA allein schon eine maximale Auspr��gung erreicht zu sein. Neben den Th1/Th2-Effekten wurden auch einige gegenl��ufige Beobachtungen gemacht, welche nicht a priori durch das Th1/Th2-Paradigma zu erkl��ren sind, sondern den Einflu�� von IL-1�� auf andere Systeme belegen, wie z. B. die Wirkung auf CCL28 und regulatorische T-Zellen. F��r die Gewinnung von inflammatorischen Zellen aus der kompletten Lunge und deren weitere Untersuchung konnten wir eine Methode entwickeln und standardisieren, welche relativ einfach in der Durchf��hrung ist und zuverl��ssig eine im Verh��ltnis zur BAL hohe Zellzahl liefert, was wiederum ein breites Spektrum an weiteren Untersuchungen erlaubt. Durch den Vorgang der mechanischen und enzymatischen Prozessierung scheinen die funktionellen Eigenschaften der Zellen nicht wesentlich beeintr��chtigt zu sein. Der Einsatz von IL-1�� resultierte letztendlich in einem Mischbild an hervorgerufenen Ver��nderungen und es bedarf noch weiterer Studien, um die unterschiedlichen induzierten Mechanismen sauber voneinander zu trennen und den therapeutischen Nutzen von IL-1�� im allergischen Asthma zu evaluieren.

Einfluss prebiotischer Oligosaccharide und probiotischer Bakterien auf den Ph��notyp und die Funktion dendritischer Zellen

Neben der Therapie allergischer Erkrankungen, wie dem allergischen Asthma oder der atopischen Dermatitis, nehmen pr��ventive Ma��nahmen zur Vermeidung einer Sensibilisierung einen immer h��heren Stellenwert ein. Hierbei scheint der Einsatz von Pre- und Probiotika vielversprechend zu sein. rnrnIm Rahmen dieser Dissertation wurde der Einfluss von Pre- und Probiotika auf den Ph��notyp und die Funktion von DCs untersucht. Hierzu wurden unreife DCs aus Vorl��uferzellen im Knochenmark von M��usen differenziert (BM-DCs). Nach Behandlung der Kulturen w��hrend der Differenzierung der BM-DCs mit neutrale Humanmilch-analoge Oligosaccharide-enthaltenden Pr��parationen (NOS-Pr��parationen) konnte ein Einfluss auf die Zellen nachgewiesen werden; die NOS-Pr��parationen sind in der Lage, die durch LPS induzierte Ausreifung der BM-DCs zu supprimieren. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die prim��rstimulatorische Kapazit��t LPS-stimulierter BM-DCs, die in Anwesenheit von NOS-Pr��parationen differenziert wurden, sowohl f��r allogene als auch f��r syngene T-Zellen signifikant vermindert war. Die Charakterisierung dieser T-Zellen ergab zwar eine verst��rkte Expression des f��r regulatorische T-Zellen charakteristischen Transkriptionsfaktors FoxP3, auf funktioneller Ebene konnte jedoch keine Induktion von regulatorischen T-Zellen beobachtet werden; allerdings wurde in diesen T-Zellen eine Anergie induziert. Der Befund, dass verschiedene NOS-Pr��parationen unterschiedliche Wirkungen auf die Differenzierung von BM-DCs aufweisen, muss weitergehend untersucht werden. rnrnWeiterhin wurden im Rahmen dieser Arbeit die Auswirkungen einer Kultivierung der BM-DCs mit den beiden probiotischen Bakterien Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) und Lactobacillus fermentum analysiert. Hier induzierte ein Kontakt unreifer BM-DCs mit den Bakterien eine Maturierung der Zellen. Das Potential zur Produktion von IL-10 konnte dabei nicht erh��ht werden. Im Gegensatz dazu induzierte eine Supplementierung der Kulturen w��hrend der Differenzierungsphase der DCs kontr��re Effekte; die LGG-Gabe resultierte hier in einer unvollst��ndigen Ausreifung der DCs nach LPS-Stimulus. Dies konnte auch auf funktioneller Ebene als stark vermindertes Potential zur T-Zellstimulation best��tigt werden. Inwieweit die Supplementierung mit LGG in tolerogenen DCs resultiert, welche Tregs induzieren k��nnen, muss weiter analysiert werden.

Suppression des allergischen Asthmas durch regulatorische T-Zellen: Mechanismen und potenzielle therapeutische Ans��tze

Das allergische Asthma ist eine weit verbreitete, immunologische Erkrankung, deren Pr��valenz in den vergangenen 20 Jahren vor allem in industrialisierten Regionen drastisch zugenommen hat. Trotz intensiver Forschung und Entwicklung medikament��ser Therapien steigt die Zahl der Patienten stetig an. Charakteristisch f��r diese Erkrankung sind entz��ndliche Ver��nderungen in der Lunge, erh��hte Atemwegs��berempfindlichkeit (AHR), Mukusproduktion und in chronischen F��llen auch Atemwegsobstruktion. Bei der Entstehung des allergischen Asthmas wird ein anf��lliges Individuum durch die Inhalation eines normalerweise unsch��dlichen, in der Umwelt vorkommenden Antigens (Allergen) sensibilisiert, wodurch im K��rper eine eigentlich unangebrachte Immunreaktion in Gang gesetzt wird. CD4+ T-Lymphozyten und ganz besonders die Subpopulationen der T-Helfer 1 (Th1) und Th2 Zellen spielen in dem Prozess eine zentrale Rolle. Obwohl ein Gro��teil der Asthmatiker mit einer Atemwegseosinophilie und erh��hter Expression der Th2-typischen Zytokine IL-4 und IL-13 ein Th2-typisches Krankheitsbild aufweisen, wurden weitere Asthmaph��notypen identifiziert. Vornehmlich in Patienten, die an schwerem Asthma leiden, sind dominierende Neutrophilie und erh��hte Mengen IFN-�� in den Atemwegen nachweisbar, was auf eine Th1-gesteuerte Immunreaktion hindeutet. Eine effektive, heilende Therapie des Asthmas wurde bislang nicht entwickelt. Die Inhibition der T-Zellantwort etwa durch Applikation allergenspezifischer, regulatorischer T-Zellen (Tregs) gilt als ein vielversprechender, aber nicht vollst��ndig erforschter Ansatz zur Kontrolle der Krankheitssymptome. In diesem Zusammenhang wurden in der vorliegenden Arbeit die Mechanismen und Effekte nat��rlich vorkommender CD4+CD25+Foxp3+ regulatorischer T-Zellen (nTregs) auf eine Th1 bzw. Th2-induzierte allergische Atemwegserkrankung untersucht. Anhand eines adoptiven Zelltransfermodells unter Einsatz lymphozytendefizienter Rag2-/- M��use konnte gezeigt werden, dass sowohl Th1 als auch Th2 Zellen, kombiniert mit mehrfacher, inhalativer Allergenprovokation, eine erh��hte AHR induzieren. W��hrend der Transfer allergenspezifischer Th2 Zellen eine Eosinophilie in der bronchoalveol��ren Lavage (BAL) und vermehrte Mukusproduktion in den Atemwegen hervorrief, war in Th1-transferierten Tieren zwar eine massive Infiltration neutrophiler Granulozyten zu beobachten, eine Becherzellmetaplasie mit vermehrten, mukusproduzierenden Atemwegsepithelzellen blieb allerdings aus. In vitro und in vivo waren voraktivierte nTregs (preTregs) nur eingeschr��nkt in der Lage, die Th2-gesteuerte Atemwegserkrankung zu inhibieren. Im Gegensatz dazu konnten die Th1-Effektorfunktionen in vitro und die Th1-induzierte AHR und Atemwegsentz��ndung in vivo durch preTregs effektiv gehemmt werden, was auf eine unterschiedliche Empfindlichkeit der Th-Subpopulationen weist. Innerhalb der nTreg-vermittelten Suppression wird der sekund��re Botenstoff cAMP auf die zu supprimierende Zelle ��bertragen und f��hrt zur Hemmung von Proliferation und Zytokinproduktion. Dass dieser Mechanismus nicht nur in vitro, sondern auch in der Suppression der Th2-gesteuerten allergischen Atemwegserkrankung eine Rolle spielt, konnte durch die St��rung des intrazellul��ren cAMP-Abbaus mittels PDE4-Inhibitoren verdeutlicht werden. Sowohl die prophylaktische, als auch die therapeutische Applikation der PDE4-Inhibitoren verst��rkte den regulativen Effekt der nTregs auf AHR und Entz��ndung, korrelierend mit erh��hten, zytosolischen cAMP-Konzentrationen in den Th2 Zellen der Lunge. Trotz des Fortschritts in der Isolation und In vitro-Expansion humaner nTregs ist die Ausbeute an Zellen ��u��erst limitiert und die ��bertragbarkeit gr����erer Zellmengen nicht zuletzt aufgrund von hohem Kontaminationsrisiko w��hrend mehrt��giger In vitro-Expansion fragw��rdig. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass eine Behandlung mit dem PDE4-Inhibitor die suppressive Kapazit��t der allergenspezifischen nTregs deutlich erh��hte. Den nTreg-vermittelten Suppressionsmechanismus durch den Einsatz von Pharmazeutika zu unterst��tzen bietet einen viel versprechenden und realistischen Ansatz zur Therapie des allergischen Asthmas.