Proteolyse des Amyloid-Vorläufer-Protein-verwandten APLP2 durch alpha-Sekretasen

Die im Laufe der Evolution konservierte Genfamilie des Amyloid-Vorläufer-Proteins APP beinhaltet sowohl bei der Maus als auch beim Menschen die beiden APP-ähnlichen ProteineAPLP1 und APLP2. Ziel dieser Arbeit war es, die proteolytische Prozessierung des APLP2 zu charakterisieren und die beteiligten Proteasen aufzuzeigen. Ausgehend von Stimulations- und Inhibitionsversuchen wurde die Metzincin-Familie der Metalloproteinasen als APLP2-Proteasen identifiziert. Durch Überexpression von ADAM10 und TACE (ADAM17) konnten zwei wichtige Prozessierungs-Enzyme des APLP2 charakterisiert werden. Damit wurde zum ersten Mal eine α-Sekretase-ähnliche Enzymaktivität analog zu der Spaltung des APP an APLP2 beschrieben. Untersuchungen an ADAM10-transgenen Mäusen bestätigten die proteolytische Prozessierung des APLP2 in vivo. Durch die Untersuchung neuronaler Differenzierung mit Retinsäure und Apoptose in Neuroblastoma-Zellen gelang der Nachweis einer funktionellen Koregulation von APLP2 und seiner Protease ADAM10, die zu einer erhöhten Freisetzung des neurotrophen löslichen APLP2 bei der Differenzierung und zu einer Reduktion bei Apoptose führt. In den Gehirnen von Alzheimer-Patienten gibt es sowohl Hinweise auf einen gestörten Vitamin A Metabolismus als auch auf verstärkte apoptotische Vorgänge, so dass hier erstmalig eine Verknüpfung der APLP2-Proteolyse mit zwei pathogenen Prozessen des Morbus Alzheimergezeigt werden konnten. Eine therapeutische Aktivierung der α-Sekretasen hätte die verstärkte Bildung von neurotrophem APPsα und APLP2s zur Folge. Es bestünde jedoch gleichzeitig die Gefahr von Nebenwirkungen durch die Spaltung weiterer Substrate wie der Notch-Rezeptoren oder des Prionenproteins. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Notch-1 prinzipiell ein Substrat für ADAM10 darstellt, die Auswirkungen in vivo jedoch begrenzt und altersabhängig sind. Für das Prionenprotein ergab sich keine direkte Beeinflussung durch eine Spaltung, sondern vielmehr eine Expressionsminderung durch die Überexpression von ADAM10 in Mäusen. Die Inkubationszeit bei der Prionenerkrankung hängt von der Menge des endogenen zellulären Prionenproteins ab. Daher ergibt sich aus einer Steigerung der α-Sekretase-Aktivität eine potentielle Prävention gegenüber einer Infektion mit der pathogenen Scrapie-Form des Prionenproteins.

Sequence-controlled synthesis of soluble oligo(p-benzamide)s

This work focused on the synthesis of novel monomers for the design of a series of oligo(p-benzamide)s following two approaches: iterative solution synthesis and automated solid phase protocols. These approaches present a useful method to the sequence-controlled synthesis of side-chain and main-chain functionalized oligomers for the preparation of an immense variety of nanoscaffolds. The challenge in the synthesis of such materials was their modification, while maintaining the characteristic properties (physical-chemical properties, shape persistence and anisotropy). The strategy for the preparation of predictable superstructures was devote to the selective control of noncovalent interactions, monodispersity and monomer sequence. In addition to this, the structure-properties correlation of the prepared rod-like soluble materials was pointed. The first approach involved the solution-based aramide synthesis via introduction of 2,4-dimethoxybenzyl N-amide protective group via an iterative synthetic strategy The second approach focused on the implementation of the salicylic acid scaffold to introduce substituents on the aromatic backbone for the stabilization of the OPBA-rotamers. The prepared oligomers were analyzed regarding their solubility and aggregation properties by systematically changing the degree of rotational freedom of the amide bonds, side chain polarity, monomer sequence and degree of oligomerization. The syntheses were performed on a modified commercial peptide synthesizer using a combination of fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) and aramide chemistry. The automated synthesis allowed the preparation of aramides with potential applications as nanoscaffolds in supramolecular chemistry, e.g. comb-like-

Synthese und Charakterisierung von zylindrischen Bürsten mit Polypeptidseitenketten

In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass durch die grafting-from-Methode verschiedene geschützte Polypeptidbürsten basierend auf L-glutaminsäure, L-asparaginsäure, L-lysin und L-ornithin synthetisch zugänglich sind. Zur Verwirklichung dieser Synthesestrategie wurde mehrstufig ein Makroinitiator auf Basis von N-methacrylamid-1,6-diaminohexan hergestellt, der die ringöffnende Polymerisation von Leuchs´schen Anhydriden zur Entwicklung von geschützten Polypeptidseitenketten initiieren kann. Durch stark saure bzw. alkalische Abspaltbedingungen war es möglich, die Schutzgruppen bei allen geschützten Bürsten bis auf eine Spezies erfolgreich zu entfernen. Weitergehende Untersuchungen an den positiv bzw. negativ geladenen Polyelektrolytbürsten mittels statischer Lichtstreuung und Kapillarelektrophorese zeigten, dass lediglich die Z-geschützten Poly-L-lysinbürsten ohne Kettenabbau entschützt werden konnten. In allen anderen Fällen wurden nach Abspaltung der Schutzgruppen lineare Kettenfragmente detektiert. Durch die Zugabe von NaClO4 oder Methanol zu den wässrigen Lösungen der Poly-L-lysinbürsten konnte mittels CD-Spektroskopie gezeigt werden, dass die Seitenketten von einer ungeordneten Konformation in eine helikale Konformation übergehen. In weiterführenden Experimenten wurde mittels statischer Lichtstreuung, dynamischer Lichtstreuung, SAXS, und AFM-Aufnahmen in Lösung bewiesen, dass die helikale Konformation der Seitenketten eine deutliche Abnahme des Zylinderquerschnitts und des Querschnittträgheitsradius zur Folge hat, die Topologie der Bürste allerdings unverändert bleibt. Weiterhin konnte mittels Kapillarelektrophorese die elektrophoretische Mobilität der Poly-L-lysinbürsten und ihrer linearen Analoga bestimmt werden. Mit diesen Resultaten war es in Kombination mit statischen Lichtstreuexperimenten möglich, die effektive Ladung von linearem und verzweigten Poly-L-lysin nach einer Theorie von Muthukumar zu berechnen. Das Ergebnis dieser Rechnungen bestätigt die Ergebnisse früherer Untersuchungen von Peter Dziezok, der in seiner Dissertation durch Leitfähigkeits und Lichtstreumessungen an linearem PVP und PVP-Bürsten herausfand, dass die effektive Ladung von Polymerbürsten mindestens um einen Faktor 10 kleiner ist als bei den korrespondierenden linearen Analoga.

Funktionelle Charakterisierung der Metalloendopeptidasen Meprin alpha und Meprin beta unter besonderer Berücksichtigung pathologischer Umstände in der menschlichen Dermis

Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei neuentdeckte Astacin-ähnliche-Proteasen LAST undrnLAST_MAM aus dem Pfeilschwanzkrebs Limulus polyphemus funktionell charakterisiert.rnInsbesondere LAST_MAM, eignet sich zur phylogenetischen Untersuchung, hinsichtlich derrnEvolution von Astacin-ähnlichen-Proteasen mit MAM-Domäne, zu denen auch die Meprinernzählen. Es wurde deutlich, dass LAST_MAM nicht unmittelbar mit anderen Astacinen, diernüber eine MAM-Domäne verfügen, verwandt ist, und dass von einer divergenten Entwicklungrndieser Proteasen und der MAM-Domäne selbst ausgegangen werden muss.rnMeprin Metalloendopeptidasen werden in membrangebundener und sezernierter Form,rnvorwiegend in Epithelien aber auch in intestinalen Leukozyten und bestimmten Krebszellenrnexprimiert. Meprin

Untersuchungen zum Ectodomain shedding des Receptor for advanced glycation endproducts

Zu den Liganden des Zelloberflächenrezeptors RAGE gehören AGEs, S100-Proteine, HMGB1 und Aβ. RAGE wird daher eine Rolle bei verschiedenen neurologischen Erkrankungen sowie Diabetes, Arteriosklerose und Krebs zugesprochen. Des Weiteren geht eine Verringerung der Menge an sRAGE häufig mit diesen Krankheiten einher. Aus diesen Gründen stellt die pharmakologische Stimulierung der Proteolyse von RAGE eine vielversprechende Therapieform dar. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass eine Steigerung der sRAGE-Bildung über PAC1-, V2- und OT-Rezeptoren möglich ist. Die Untersuchung der PAC1-Signalwege zeigte, dass PKCα/PKCβI, CaMKII, Ca2+-Ionen, PI3-Kinase und der MAP-Kinase-Weg wichtig für die Stimulierung sind und dass der PKA-Weg nicht beteiligt ist. Die dreimonatige Behandlung von Mäusen mit PACAP-38 weist darauf hin, dass eine Stimulierung des Ectodomain Sheddings von RAGE auch in vivo erfolgen kann. Die Untersuchung der Signalwege, ausgehend von den V2- und OT-Rezeptoren, zeigte, dass ebenfalls PKCα/PKCβI, CaMKII, Ca2+-Ionen zur Aktivierung der Proteasen führen, dagegen konnte weder ein Einfluss des PKA- noch des MAP-Kinase-Weges festgestellt werden. Außerdem wurden sowohl MMP-9 als auch ADAM-10 als RAGE-spaltende Proteasen identifiziert. Die nähere Untersuchung der RAGE-Spaltstelle erbrachte, dass keine spezifische Sequenz, sondern vielmehr die Sekundärstruktur eine Rolle bei der Erkennung durch die Proteasen spielt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde weiterhin ein anti-RAGE Antikörper anhand einer neu entwickelten Methode zunächst gereinigt und dann erfolgreich an ein mit dem Fluoreszenzfarbstoff Rhodamin markiertes Polymer gekoppelt. Die Stimulierung der Proteolyse von Meprin β wurde auch untersucht und es konnte ebenfalls eine Beteiligung von ADAM-10 an der Spaltung nachgewiesen werden.