Beitr��ge zur Steuerung und Analyse von technischen Bearbeitungssystemen mit Methoden der nichtlinearen Zeitreihenanalyse

Die Nichtlineare Zeitreihenanalyse konnte in den letzten Jahren im Rahmen von Laborexperimenten ihre prinzipelle Brauchbarkeit beweisen. Allerdings handelte es sich in der Regel um ausgew��hlte oder speziell konstruierte nichtlineare Systeme. Sieht man einmal von der ��berwachung von Prozessen und Produkten ab, so sind Anwendungen auf konkrete, vorgegebene dynamische Probleme im industriellen Bereich kaum bekannt geworden. Ziel dieser Arbeit war es, an Hand von zwei Problemen aus der technischen Praxis zu untersuchen, ob die Anwendung des kanonischen Schemas der Nichtlinearen Zeitreihenanalyse auch dort zu brauchbaren Resultaten f��hrt oder ob Modifikationen (Vereinfachungen oder Erweiterungen) notwendig werden. Am Beispiel der Herstellung von optischen Oberfl��chen durch Hochpr��zisionsdrehbearbeitung konnte gezeigt werden, da�� eine aktive St��rungskompensation in Echtzeit mit einem speziell entwickelten nichtlinearen Vorhersagealgorithmus m��glich ist. Standardverfahren der Nichtlinearen Zeitreihenanalyse beschreiten hier den allgemeinen, aber sehr aufwendigen Weg ��ber eine m��glichst vollst��ndige Phasenraumrekonstruktion. Das neue Verfahren verzichtet auf viele der kanonischen Zwischenschritte. Dies f��hrt zu einererheblichen Rechenzeitersparnis und zus��tzlich zu einer wesentlich h��heren Stabilit��t gegen��ber additivem Me��rauschen. Mit den berechneten Vorhersagen der unerw��nschten Maschinenschwingungen wurde eine St��rungskompensation realisiert, die die Oberfl��cheng��te des bearbeiteten Werkst��cks um 20-30% verbesserte. Das zweite Beispiel betrifft die Klassifikation von K��rperschallsignalen, die zur ��berwachung von Zerspansprozessen gemessen werden. Diese Signale zeigen, wie auch viele andere Prozesse im Bereich der Produktion, ein hochgradig nichtstation��res Verhalten. Hier versagen die Standardverfahren der Nichtlinearen Datenanalyse, die FT- bzw. AAFT-Surrogate benutzen. Daher wurde eine neue Klasse von Surrogatdaten zum Testen der Nullhypothese nichtstation��rer linearer stochastischer Prozesse entwickelt, die in der Lage ist, zwischen deterministischen nichtlinear chaotischen und stochastischen linearen nichtstation��ren Zeitreihen mit change points zu unterscheiden. Damit konnte gezeigt werden, da�� die untersuchten K��perschallsignale sich statistisch signifikant einer nichtstation��ren stochastischen Folge von einfachen linearen Prozessen zuordnen lassen und eine Interpretation als nichtlineare chaotische Zeitreihe nicht erforderlich ist.

Funktionale Analyse des CpY/DmX Gens aus Chironomus und Drosophila melanogaster

Zusammenfassung: Funktionale Analyse des CpY/DmX Gens aus Chironomus und Drosophila melanogaster Bei CpY und DmX handelt es sich um homologe neuartige Gene aus den Dipteren Chironomus piger und Drosophila melanogaster. CpY und DmX bestehen aus 15 Exons, die f��r eine mRNA von ca. 11,5 kb kodieren.Das Gen hat eine genomische L��nge von ca. 15 kb. Die abgeleiteten Genprodukte sind durch eine hohe Anzahl von WD-Repeats gekennzeichnet.WD-Proteine besitzen in der Regel regulatorische Funktionen in allen m��glichen Bereichen. Ein Strukturvergleich mit homologen Genen legt die Vermutung nahe, da�� sich sowohl am N- als auch am C-Terminus eine WD-Propellerstruktur befindet. CpY aus Chironomus piger ist in einem hromosomalen Abschnitt lokalisiert, der den Kern eines evolvierendenGeschlechtschromosoms darstellt. Dieses Gen besitzt im Gegensatz zu DmX geschlechtsspezifisch in Introns integrierte Transposons und wird quantitativ geschlechtsspezifisch gesplei��t. DmX ist auf dem X-Chromosom im Bereich 5D6-5E1 lokalisiert, es konnte jedoch kein geschlechtsspezifisches Expressionsmuster diagnostiziert werden. Die Transkriptionsanalyse ergab,da�� DmX w��hrend der Oogenese und der gesamten Embryonalentwicklung transkribiert wird. Dabei wird neben einer ubiquit��ren Grundexpression DmX in einer gewebespezifischen Weise exprimiert. Die DmX-Transkriptewandern offensichtlich - wie die CpY-Transkripte - in gro��er Menge in die reifende Oozyte. Bei DmX/CpY k��nnte es sich also um ein maternales Effektgen handeln. W��hrend der Embryogenese k��nnen zun��chst DmX-Transkripte am posterioren Pol nachgewiesen werden. Danach f��rben die vorderen und hinteren Mitteldarmvorl��ufer, dann spezifische Zellen im ZNS und in reifen Embryonen das gesamte ZNS, Sinnesorgan-Anlagen im Kopf, sowie der Enddarm. Das dem DmX benachbarte Gen DmSPX, welchen mit diesem einen gemeinsamen 174 bp gro��en bidirektionalen Promoter besitzt, zeigt ein von DmX unterschiedliches Transkriptionsmuster. Mit einer Reihe von Keimbahntransformationen konnten die f��r eine ordnungsgem����e Expression hinreichenden regulatorischen Bereiche identifiziert werden. In Versuchen, mittels verschiedener 'Antisense'-Strategien einen Ph��notyp zu generieren, konnte kein spezifischer Ph��notyp nachgewiesen werden. Durch die erfolgreiche Keimbahntranformationeines Rettungsvektors, welcher ein intaktes DmX-Gen enth��lt, konnte der Ph��notyp von EMS-DmX-Mutanten identifiziert werden: Nach anf��nglich normaler Embryonalentwicklung werden die Larven im Laufe des L1-Stadiums schlaff und inaktiv, jedoch nicht paralytisch und stellen Bewegung und Nahrungsaufnahme ein. Kurz nachdem wildtypische Larven das L2-Stadium erreichen, sterben die Mutanten ab. Der Ph��notyp wei'st starke ��hnlichkeit zu Synaptotagmin I-Mutanten und zu alpha-Adaptin-Mutanten auf. Das Transkriptionsmuster ��hnelt dem von alpha-Adaptin und AP50. Alle diese Gene spielen in der Endozytose eine Rolle

Untersuchungen zur genetischen Differenzierung von Vitis Genotypen und Unterlagsrebsorten sowie deren Klone mit Hilfe der RAPD-, AFLP- und SAMPL-Analyse

Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Routinemethode zur Differenzierung und Identifizierung von Unterlagssorten in jedem Verarbeitungsstadium, wie Holz, Pfropfrebe, bereits im Weinberg gepflanzte Rebe, entwickelt. Hierf��r wurde eine Methode erarbeitet, die es erm��glicht, DNA aus Bl��ttern, Holz und Wurzeln gleicherma��en zu extrahieren. Vermischungen von Unterlagssorten in einem Unterlagenholzb��ndel konnten bis zu 10% Fremd-Unterlagenholz durch eine RAPD-PCR nachgewiesen werden. Mit den 12mer Primer #722b und #722c wurden sortenspezifische Banden f��r die Unterlagssorten B��rner, 8B, 3309C und 5BB festgestellt. Der Primers # 751 war in der Lage von 151 Unterlagssorten und Wildarten 144 Genotypen zu unterschieden. Mit Hilfe der Optimierung von RAMP-Zeiten konnten die Bandenmuster der sieben in Deutschland am h��ufigsten verwendeten Unterlagssorten auf zwei unterschiedlichen Thermocyclern reproduziert werden. Aufgrund der Optimierung der RAPD-PCR war es m��glich, die zur Unterscheidung notwendigen Banden durch eine lineare Transformation anhand einer ermittelten Referenzbande mathematisch und graphisch darzustellen. Klone der Unterlagssorten SO4, 125AA und 5C, sowie die Unterlagssorte Binova, wurden auf die Unterscheidungsm��glichkeit hin mit RAPD, AFLP und SAMPL untersucht. Innerhalb der AFLP-/SAMPL-Methode bildeten die zu einer Sorte geh��renden Unterlagenklone ein Cluster, wobei Binova innerhalb der SO4 Klone zu finden war. Es wurden ������unterlagssortenspezifische Banden������, ������wiederholende Banden������ und ������Einzelbanden������ gefunden.

Vergleichende Sequenzierung und Analyse eines ca. 250 kb gro��en Bereiches der humanen Chromosomenregion 11p15.3 und der homologen Region der Maus

In der vorliegenden Dissertation wurde im Rahmen des Deutschen Humangenomprojektes ein 243 966 bp grosser genomischer Bereich um das humane Gen WEE1 in der Chromsomenregion 11p15.3 und der 192 519 bp lange orthologe Bereich auf dem murinen Chromosom 7 anhand von PAC-Klonen sequenziert. Der Sequenzierung ging die Erstellung von PAC-Klon-Contigs voraus, welche die zu untersuchenden genomischen Regionen in Mensch und Maus l��ckenlos abdecken. Nach der Etablierung von Hochdurchsatzmethoden zur Probenherstellung und ��verarbeitung wurden die Konsensussequenzen in Mensch und Maus ermittelt. Zur Identifizierung aller Gene wurde die Sequenz einer Kombination von Datenbanksuchen, computergest��tzten Exonvorhersageprogrammen und der komparativen Sequenzanalyse mit Hilfe von Dotplot- und PIP-Darstellungen unterzogen. In den untersuchten genomischen Regionen der beiden Spezies konnten insgesamt drei orthologe Genpaare (WEE1, ZNF143 und RanBP7) und ein humanes Pseudogen (Pseudogen L23a) lokalisiert werden.Das am Zellzyklus beteiligte WEE1-Gen, das auch als Ausgangspunkt f��r die Isolierung der PAC-Klone zur Erstellung der genomischen Contigs diente, ist sowohl in der humanen als auch in der murinen Sequenz vollst��ndig enthalten. Hierbei konnte die publizierte mRNA-Sequenz des murinen Wee1-Gens, unterst��tzt von EST-Daten, korrigiert werden. Sowohl das ZNF143-Gen als auch sein murines Orthologes, mStaf, sind in den genomischen Sequenzen vollst��ndig enthalten. Somit muss die in 11p15.4 publizierte Lokalisation des ZNF143-Gens in die Region 11p15.3 berichtigt werden. Weiterhin wurde die cDNA-Sequenz des humanen ZNF143-Gens um ein bisher noch nicht beschriebenes Exon im 5��-Bereich und die des murinen mStaf-Gens um knapp 170 bp im 3��-Bereich verl��ngert. Der in der ZNF143-mRNA-Sequenz publizierte 3��-UTR konnte in der vorliegenden genomischen Sequenz nicht lokalisiert werden. Es scheint sich hierbei um ein von Chromosom 14 stammendes Klonierungsartefakt zu handeln. Das im Menschen beschriebene RanBP7-Gen wurde mit Ausnahme des Exons 1 vollst��ndig in der untersuchten genomischen Sequenz lokalisiert. ��ber Datenbank-Suchen konnte ein EST-Klon identifiziert werden, der die bisher bekannte RanBP7-mRNA um knapp 2,4 kb in den 3��-Bereich hinein verl��ngert. Eine Best��tigung der Transkriptl��nge erfolgte ��ber Northern Blot-Analyse. Das bisher unbekannte murine Orthologe, mRanBP7, konnte aufgrund komparativer Sequenzanalyse und Datenbanksuchen in der vorliegenden genomischen Maus-Sequenz ermittelt werden, wobei die Sequenz ��ber RT-PCR-Experimente generiert und die Transkriptl��nge durch Northern Blot-Analyse best��tigt werden konnte. Neben den drei bekannten Genen konnte in der humanen Sequenz dar��ber hinaus ein Pseudogen (Pseudogen L23a) identifiziert werden, welches ��ber einen Bereich von 549 bp eine 92%-ige Sequenzidentit��t zu dem humanen ribosomalen Protein L23a aufweist und die typischen, 13 bp langen direkten Sequenzwiederholungen besitzt. Acht der insgesamt 10 Nukleotidaustausche f��hren im Vergleich zu L23a zu einem Aminos��ureaustausch, wodurch u. a. ein vorzeitiger Translations-Stop bedingt ist. Die komparative Sequenzanalyse deckte neben den konservierten Gen-Bereichen zwischen Mensch und Maus insgesamt vier konservierte Bereiche auf. Bei der Analyse dieser Regionen mit Hilfe von EST-Daten bzw. Exonvorhersageprogrammen konnte jedoch keiner dieser vier konservierten Regionen eine eindeutige kodierende Funktion nachgewiesen werden. Es k��nnte sich hierbei somit um funktionell bedeutsame regulatorische Regionen handeln. Die Analysen der ermittelten genomischen Sequenzen zeigten, dass der Anteil an repetitiven Elementen mit 55,26% in der untersuchten humanengenomischen Region gegen��ber der murinen Sequenz (41,87%) deutlich erh��ht ist. Durch die vergleichende Sequenzanalyse k��nnen Artefakte in den EST-analysiert und somit die Zuverl��ssigkeit der verwendeten Exonvorhersage-Programme optimiert werden.Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass die Kombination von komparativer Sequenzanalyse, Datenbank-Suchen und Exonvorhersageprogrammen die Sicherheit bei der Identifikation von kodierenden Sequenzen stark verbessert.

Analyse und Modulation kontaktallergischer Reaktionen

Analyse und Modulation kontaktallergischer Reaktionen In der vorliegenden Arbeit wurde in einem ersten Teil die Bedeutung des Tumor-Necrosis-Faktors auf eine Kontaktallergie anhand von TNFR1- und TNFR2-defizienten M��usen untersucht. Mit Hilfe des Ohrschwellungsverlaufs einer von DNFB ausgel��sten kontaktallergischen Reaktion konnte bei TNFR1-defizienten M��usen eine leichte ��berreaktivit��t und bei TNFR2-defizienten M��usen eine statistisch abgesicherte ��berreaktivit��t festgestellt werden. Eine ebenfalls ��berreaktive Schwellungsreaktion konnte bei TNFR2-defizienten M��usen, die vorher mit Oxazolon behandelt worden waren, beobachtet werden. In den anschlie��end durchgef��hrten histologischen Untersuchungen der Langerhans-Zellen aus den TNFR-defizienten M��usen zeigten sich keine sichtbaren Differenzen in bezug auf MHC II-Expression und Verteilung der Zellen. Eine unterschiedliche Stimulationskapazit��t konnte bei Langerhans-Zellen, die aus TNFR1- bzw. TNFR2-defizienten M��usen isoliert worden waren, nicht beobachtet werden.In Migrationsstudien, bei denen FITC als Kontaktallergen von Langerhans-Zellen aufgenommen, prozessiert und nach der Wanderung in die Lymphknoten pr��sentiert wurde, konnte keine verringerte Anzahl der migrierenden Zellen bei TNFR1-defizienten M��usen festgestellt werden. Jedoch wurde eine reduzierte Anzahl FITC- und MHC II-doppelt-positiver Zellen aus TNFR2-defizienten M��usen beobachtet.Um Aufschl��sse ��ber die Expression von TNF-Rezeptoren auf murinen Langerhans-Zellen gewinnen zu k��nnen, wurde mit Hilfe von Epidermal Sheets, zytofluorometrischen Analysen und RT-PCR-Analysen von Langerhans-Zellen die Expression der TNF-Rezeptoren untersucht. In Vorversuchen konnte die Expression von TNF-Rezeptoren auf Fibroblasten und T-Zellen gefunden werden. Weiterhin konnten beide TNF-Rezeptoren auf der Keratinozyten-Zellinie PAM 212 nachgewiesen werden. Auf frisch isolierten Langerhans-Zellen, die mittels MicroBeads aus epidermalen Zellsuspensionen gewonnen wurden, konnten keine TNF-Rezeptoren beobachtet werden. Bei kultivierten Langerhans-Zellen konnte dagegen die Expression des TNFR2 festgestellt werden. Mit Hilfe von RT-PCR-Analysen konnte die mRNA des TNFR1 sowohl bei frisch isolierten als auch bei kultivierten Langerhans-Zellen nachgewiesen werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Wirkung des Immunmodulators Leflunomid (LF) auf eine Kontaktallergie untersucht. Es konnte eine signifikant geringere Schwellungsreaktion im Zuge einer DNFB-induzierten Kontaktallergie bei LF-behandelten M��usen festgestellt werden. Bei Experimenten zur Untersuchung des Wirkungszeitraums der inhibitorischen Wirkung von LF bei einer kontaktallergischen Reaktion konnte ein langanhaltender Effekt beobachtet werden. Weiterhin konnte die inhibitorische Wirkung von LF auf eine von Oxazolon induzierte kontaktallergische Schwellungsreaktion und auf eine irritative Schwellungsreaktion beobachtet werden. Wie in einem weiteren Experiment festgestellt werden konnte, wirkte LF gr����enteils antigenspezifisch.Der Wirkungszeitpunkt von LF konnte in verschiedenen Experimenten, bei dem LF vor, w��hrend oder nach der Sensibilisierungsreaktion verabreicht worden war, festgestellt werden. Eine suppressive Wirkung von LF war nur dann zu beobachten, wenn LF w��hrend der Sensibilisierungsphase gegeben worden war. Weiterhin konnte in Transfer-Experimenten festgestellt werden, da�� die Inhibition der kontaktallergischen Schwellungsreaktion auf naive Tiere ��bertragbar ist. Au��erdem wurden Hinweise gefunden, da�� CD8+-T-Zellen als Effektorzellen bei der Suppression eine Rolle spielen. Desweiteren konnten anhand von Untersuchungen von Epidermal Sheets von LF-behandelten M��usen, die mit DNFB konfrontiert worden waren, keine morphologischen Unterschiede gefunden werden. Nach Erstellung von Migrationsanalysen f��r die zum Einsatz gekommenen Versuchsgruppen, d.h. sowohl f��r die LF-behandelten als auch f��r die Kontroll-M��use, konnte kein Einflu�� von LF auf die Wanderungsf��higkeit von LC konstatiert werden. Anhand von FACS-Analysen konnte bei einer mit LF kultivierten T-Zellinie eine reduzierte Expression des IL-2-, und Transferrin-Rezeptors, sowie von CD44 beobachtet werden. Schlie��lich wurde bei Untersuchungen einer topischen Applikationsform von LF festgestellt, da�� LF nur oral appliziert wirksam war.

Analyse der Mechanismen zur Regulation der Zellzyklus-abh��ngigen Stabilit��t der MARCKS-mRNA

Die Expression des PKC-Hauptsubstrates MARCKS (myristoylated alanine-rich C kinase substrate) wird in Swiss 3T3-Fibroblasten in Abh��ngigkeit des Zellzyklus durch Variation der mRNA-Stabilit��t reguliert. In der vorliegenden Arbeit wurde die Beteiligung der 3' nichttranslatierten Region (3'UTR) der MARCKS-mRNA an der Stabilit��tskontrolle analysiert. Durch Einsatz der RNase/EMSA-Technik konnten zwei cis-Elemente der MARCKS 3'UTR identifiziert und lokalisiert werden, die mit RNA-bindenden Swiss 3T3-Proteinen (trans-Faktoren) interagieren. Diese neu identifizierten cis-Elemente sind AU-reiche Elemente (ARE) der Klasse III, da sie sehr gro��e Sequenzhomologie zu ARE dieser Klasse aufweisen und der MARCKS 3'UTR, wie f��r ARE typisch, Instabilit��t vermitteln.Durch UV-crosslinking wurden vier Proteine mit Molek��lmassen von 55, 40, 36 und 30 kDa nachgewiesen, die spezifisch an das 52nt lange Haupt-ARE (MARCKS 52nt) mit unterschiedlicher Affinit��t binden konnten. Mit Hilfe von rekombinant hergestellten ELAV/Hu-Proteinen und einem ELAV/Hu-spezifischen, affinit��tsgereinigten Antiserum konnte eines der vier Proteine (p36) als das ELAV/Hu-Protein HuR identifiziert werden. Die Funktion der ELAV/Hu-Proteine f��r die Stabilit��tskontrolle der MARCKS-mRNA lie�� sich durch transiente und stabile Transfektion von HuR und neuronenspezifischem HuD mit dem Tetracyclin induzierbaren Expressionssystem (Tetoff) in Swiss 3T3- bzw. MEF/3T3-Tetoff-Zellen verdeutlichen: Durch ��berexpression von HuR und HuD wurde die wachstumsinduzierte Destabilisierung der MARCKS-mRNA bei Wiedereintritt der Zellen in den Zellzyklus unterbunden.

Analyse der Einweisungsdiagnose in einer universit��ren Schmerzambulanz unter dem besonderen Aspekt des Anteils therapiebed��rftiger psychischer St��rungen bei Patienten mit R��ckenschmerzen, Morbus Sudeck, Phantomschmerzen sowie

Es wurde eine retrograde Analyse von Patientenakten der Schmerzambulanzder Klinik f��r An��sthesiologie der Universit��tsklinik Mainz durchgef��hrt, indie alle Patienten mit bestimmten Einschlu��kriterien derBehandlungsjahrg��nge1996 und 1997 aufgenommen wurden.Dies waren die vier Diagnosegruppen multilokul��re Schmerzen,R��ckenschmerzen, Phantomschmerz und Morbus Sudeck (SRD). Das Ziel dervorliegenden Arbeit war die Frage nach der H��ufigkeit von Psychotherapie alserg��nzende Therapieempfehlung seitens der Schmerzambulanz herauszuarbeiten.Psychotherapie (ambulant, station��r, Bestandteil vonRehabilitationsaufenthalten) in vielgestaltiger Weise wurde h��ufigerempfohlen, 1. je l��nger die Schmerzerkrankung bestand,2. je j��nger die Patienten waren,3. je l��nger sie arbeitsunf��hig waren,4. wenn belastende biographische Ereignisse festgestellt werden konnten5. je h��her das Chronifizierungsstadium nach Gerbershagen war. Im Einzelnenspielten die zeitlichen Aspekte der Erkrankung, Lokalisationseinfl��sse sowieAspekte vorheriger Behandlungen und schmerzbedingter Krankenhausaufenthalteeine besondere Rolle.6. wenn Patienten nicht berentet waren.

Analyse molekularer Mechanismen der Immundominanz MHC Klasse I-pr��sentierter Antigene bei Humaner Cytomegalovirus-Infektion

Das Humane Cytomegalovirus (HCMV) ist ein Erreger von gro��er klinischer Relevanz. Die HCMV-Infektion, die insbesondere bei immunsupprimierten Patienten mit hoher Morbidit��t und Mortalit��t assoziiert ist, wird vorwiegend durch CD8+-zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) kontrolliert. Das Tegumentprotein pp65 und das immediate early 1-Protein (IE1) waren als die dominanten CTL-Antigene bekannt. Ziel dieser Arbeit war es, die zur Immundominanz des pp65 f��hrenden molekularen Mechanismen aufzukl��ren und die Grundlagen f��r die Analyse der IE1-spezifischen Immunantwort zu erarbeiten. Durch Peptidimmunisierung HLA-A2-transgener M��use wurden hochaffine pp65-spezifische CTL-Klone generiert. F��r die Generierung ��hnlicher CTL-Klone gegen IE1 konnte erstmals ein konserviertes HLA-A2-bindendes Peptid identifiziert werden. Mit Hilfe der pp65-spezifischen CTL-Klone konnte gezeigt werden, dass das durch Viruspartikel in die Zelle eingebrachte pp65 die Erkennung infizierter Zellen durch CD8+-CTL vermittelt. Durch den Nachweis der au��ergew��hnlichen Stabilit��t von pp65 in der Zelle gelang es, eine hohe metabolische Umsatzrate als eine Ursache von Immundominanz auszuschlie��en. Dagegen hob die Blockierung des CRM1-vermittelten nukle��ren Exportweges durch Zugabe von Hemmstoffen oder Zutransfektion kompetitiver Inhibitoren die Erkennung des pp65 nahezu auf. Hiermit wurde erstmalig eine Abh��ngigkeit der Pr��sentation eines immundominanten nukle��ren Proteins vom nukleozytoplasmatischen Transport nachgewiesen. Die Erkenntnisse dieser Arbeit stellen die Grundlage f��r die detaillierte Analyse der Zusammenh��nge zwischen nukle��rem Export und Antigenpr��sentation dar.

In-vitro-Rekonstitution des vesikul��ren Transportes zu Recycling-Endosomen und Analyse von sekretiertem Caveolin-1 aus humanen Prostatakrebszellen

Der Transferrin-Zyklus ist ein wichtiges Modell f��r denintrazellul��ren Transport, daher sollten in der vorliegendenArbeit einzelne, immer noch unverstandene Prozesse desvesikul��ren, intrazellul��ren Transportes durch dieCharakterisierung einen in vitro-Transportassay untersuchtwerden. Der Ansatz eines in vitro-Systems wurde deshalbgew��hlt, um mit Experimenten in denen einzelne Faktoren undbestimmte Konditionen untersucht werden sollten, diese unterdefinierten, reproduzierbaren Konditionen durchzuf��hren, diein einem in vivo-System kaum zu gew��hrleisten sind. Ohne denEinfluss von ��st��renden��, weil unkontrollierten Faktoren,wie es bei in vivo-Systemen der Fall ist, konnte imvorliegende Ansatz der Transport zu immunisoliertenRecycling-Endosomen (die Isolierung erfolgte hierbei mitanti-Rab11-Antik��rpern, einem Marker f��rRecycling-Endosomen) unter bestimmten Bedingungen untersuchtwerden. Dabei wurde als Marker Acridinium-markiertesTransferrin gew��hlt, welches in Zellen internalisiert wurde.Die Spezifit��t des Transportes in dem zellfreien System warhierbei sehr hoch, wie Kontrollexperimente inImmunisolierungsans��tzen ohne Rab11-Antik��rper zeigten. ImRahmen einer ersten Charakterisierung des Transportassayswurden essentielle, f��r den in vivo-Transport essentielleParameter auch in den in vitro-Experimenten untersucht.Hierbei wurde zum einen der Faktor Temperatur gew��hlt, daTransport in Zellen bei 4��C in der Regel zum Erliegen kommt.Dies konnte auch in dem vorgestellten System gezeigt werden.Ein weiterer, essentieller Faktor ist Energie in Form vonATP. ATP-Depletion wurde in den Experimenten durch Hinzugabeeines ATP-ersch��pfenden Systems erzielt. Auch hier zeigteder Transport von Ac-Tfn zu Recycling-Endosomen eine starkeInhibierung. Mit Hilfe des so charakterisierten Assayskonnten anschlie��end weitere Experimente durchgef��hrtwerden, die den Einfluss von bestimmten Reagenzien undKonditionen auf den Transport untersuchten. So zeigte derTransport in Zeitverlaufsexperimenten einen Anstieg desTransportes bis 30 Minuten, bei 30 Minuten wurde ein Maximumerreicht. Nach Erreichen dieses Maximums war nachfolgendeine leichte Abnahme des Transfers von Ac-Tfn zu denRecycling-Endosomen zu beobachten. Da Rab-Proteine alsSchl��sselregulatoren f��r den intrazellul��ren, vesikul��renTransport gelten, und die Immunisolierungen mitanti-Rab11-Antik��rpern durchgef��hrt wurden, wurde somit auchder Einfluss dieser GTPasen auf das Transportsystemuntersucht. Zugegebenes GDI, welches in der Lage istRab-Proteine in GDP-gebundener Form von spezifischenMembranen zu extrahieren, und daher ein gut untersuchterInhibitor von Rab-Funktionen ist, konnte auch in diesemTransportassay den Transport von Transferrin inhibieren. Einweiterer Aspekt war die Rolle des Cytoskelettes imintrazellul��ren Transport. Da in fr��heren Untersuchungen(Trischler et al., 1999) Aktin auf Recycling-Endosomengefunden wurde, erfolgte in diesen Arbeiten eineKonzentration auf die Rolle des Aktin in diesenTransportprozessen. Durch die Zugabe von Cytochalasin D, daseinen Aufbau von Aktinger��sten verhindert, wurde derTransport ebenfalls inhibiert. Durchaffinit��tschromatographische Aufreinigungen konnte einestarke Interaktion von Aktin an immobilisiertes Rab11gezeigt werden. Die eluierten Fraktionen, die neben Aktinnoch weitere, jedoch unbekannte Proteine enthielten, konntenin dem in vitro-Fusionsassay eingesetzt werden und f��hrtendort zu einer Stimulation des Transportes. Neben demgefundenen Aktin, k��nnten somit noch weitere, unbekannteProteine in dem Proteingemisch wichtige Funktionen imintrazellul��ren, vesikul��ren Transport ��bernehmen. EineIdentifizierung dieser Proteine ist dabei f��r weiterf��hrendeArbeiten essentiell.Caveolin-1, Markerprotein f��r die Caveolae-Membrandom��newird ��berraschenderweise von verschiedenen Zellensekretiert. Da Caveolin-1 normalerweise ein integralesMembranprotein ist, wird von einer Sekretion alsLipoproteinpartikel ausgegangen. Die Rolle diesessekretierten Partikels ist unbekannt, wobei einige Autoreneine Funktion als autokrinen/ parakrinen Faktor vorschlagen(Tahir et al., 2001). In der vorliegenden Arbeit solltendiese Partikel daher aufgereinigt und erstmalscharakterisiert werden. Die Partikel wurden aus transienttransfizierten LNCaP-Zellen gewonnen, die Cav-1 in dasserumfreie Medium abgaben. In einer erstenGr����enuntersuchung durch FPLC konnte ein Molekulargewichtzwischen 2.000.000 Da und 660.000 Da bestimmt werden. DieseResultate konnten durch den Ansatz der nativenBlau-Gelelektrophorese best��tigt werden. In einem weiterenAnsatz, der die Dichte der Partikel charakterisieren sollte,wurde in zwei unterschiedlichen Ans��tzen (CsCl-, sowieOptiprep Dichtezentrifuagtion) eine ��hnliche Dichte desPartikels wie HDL ermittelt. Um eine st��rkere Aufreinigungder Partikel zu erzielen, wurde eine Aufreinigung mit Hilfevon Ni-NTA-Agarose durchgef��hrt. Dies war m��glich, denn diebei der Transfektion verwendete C-DNA trug einen His6-tag.Die so aufgereingten Partikel verloren auch nach derNi-NTA-Chromatographie nicht ihre biochemischenEigenschaften, wie in ��berpr��fenden CsCl-Gradienten zu sehenwar. Die Partikel konnten anschlie��end zum ersten Mal inelektronenmikroskopischen Aufnahmen (Negativkontrastierung)visualisiert werden. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es,zu untersuchen ob auf Cav-1 Lipoproteinpartikeln nochweitere Proteine zu finden waren. Durch eine kombinierteAufreinigung ��ber Ni-NTA Chromatographie undCsCl-Dichtezentrifugation und im Vergleich mit demAusgangsmaterial konnten in der Silberf��rbung Proteinbandenerkannt werden, die wie Cav-1 in den Fraktionen angereichertvorlagen. Eine massenspektroskopische Identifikation einerder Banden ergab, dass es sich hierbei um nm 23(Nukleosid-diphosphat-kinase) handelte, einem Protein dasebenfalls von verschiedenen Tumoren sekretiert wird.

Analyse von Biotransformationen und Naturstoffsynthesen in pflanzlichen Zellkulturen unter Anwendung der in vivo NMR-Spektroskopie ohne Markierung

Die Aufkl��rung von Biosynthesewegen erfolgt h��ufig mit Hilfe von F��tterungsexperimenten mit radioaktiven oder stabilen Isotopen markierten Pr��kusoren oder auf der Basis der Enzymreinigung mit anschlie��ender molekularbiologischer Charakterisierung. Die erstgenannte Methode verlangt die Isolierung der Produkte. Jedoch besteht bei Aufarbeitung und Extraktion immer die Gefahr, da�� sich der Metabolit teilweise oder vollst��ndig chemisch ver��ndert. Ein weiterer Nachteil der genannten Methoden ist, da�� diese generell m��hsam und zeitaufwendig sind. Mit Hilfe der in vivo NMR-Spektroskopie k��nnen diese Nachteile umgangen werden. In der vorliegenden Arbeit wurden Biotransformationen und Biosynthesesequenzen des Ajmalin-Biosyntheseweges mit Hilfe der in vivo NMR-Spektroskopie in Pflanzenzellkulturen von Rauvolfia serpentina und Rauvolfia serpentina x Rhazya stricta anhand der nat��rlichen 13C-H��ufigkeit untersucht. Daf��r wurden ein 700 MHz, 800 MHz und ein 500 MHz CryoProbe Spektrometer eingesetzt, um die Biotransformationen von Isatin-3-oxim und Isatin sowie die Metabolisierungen der Alkaloide Vellosimin, Vinorin, Vomilenin, Ajmalin, N��-Methyl-dihydrochano-ajmalin und Perakin mit der 1H-13C invers korrelierten NMR-Spektroskopie zu verfolgen.

Verhaltensphysiologische Analyse des Farbensehens bei einem m��nnlichen Vogel Strauss (struthio camelus australis)

In dieser Arbeit wurde das Farbensehen bei einem m��nnlichenVogel Strauss verhaltensphysiologisch untersucht. Anhand vonDressurexperimenten wurden die spektrale Empfindlichkeit unddie Wellenl��ngenunterscheidungsf��higkeit analysiert und mitden mikrospektrophotometrisch ermittelten Eigenschaften derZapfen (nach Wright und Bowmaker, 2001) verglichen. DerVogel Strauss besitzt vier Zapfentypen mit unterschiedlichgef��rbten ��ltr��pfchen (Typ Y, R, C, T). ��ltr��pfchen wirkenals Kantenfilter, in dem sie im UV-Bereich und bei kurzenWellenl��ngen kein Licht hindurchlassen. Die Maxima dereffektiven Zapfenempfindlichkeit verschieben sich dadurch zul��ngeren Wellenl��ngen. Die in den Dressurexperimenten ermittelten Maxima derspektralen Empfindlichkeit liegen bei 404nm, 495nm, 544nmund 602,7nm und entsprechen gut der Umh��llenden dermikrospektrophotometrisch ermittelten effektivenZapfenempfindlichkeitsfunktion. Die Wellenl��ngenunterscheidung beim Vogel Strauss zeigt sichin einer Delta-Lambda-Funktion mit stark ausgepr��gten Maxima(bei 474nm und zwischen 529,5nm und 540nm) und Minima(zwischen 402,5nm und 452nm, bei ca. 500nm und 596,5nm) undweist auf ein tetrachromatisches Farbensehen hin. Die Delta-Lambda-Funktion des Strauss und der Schildkr��te,die ebenfalls ��ber ��ltr��pfchen verf��gt, sind ��hnlich. Sostimmen die Stellen bester Unterscheidung bei ca. 400nm,500nm und 600nm ��berein. Abweichungen zeigen sich imkurzwelligen Bereich, in dem der Strauss ��ber bessereUnterscheidbarkeit verf��gt als die Schildkr��te. Im Gegensatzzu anderen untersuchten Vogelarten (Kolibri und Taube) zeigtsich die Wirkung der ��ltr��pfchen beim Vogel Strauss in derUnterscheidungsf��higkeit f��r Wellenl��ngen sehr deutlich.

Genetische Analyse des Somatostatin-Systems

Somatostatin ist ein Molek��l mit multifunktinonellem Charakter, dem Neurotransmitter-, Neuromodulator- und (Neuro)-Hormoneigenschaften zugeschrieben werden. Gem���� seiner ubiquit��ren Verteilung in Geweben beeinflusst es Stoffwechsel- und Entwicklungsprozesse, bis hin zu Lern-und Ged��chtnisleistungen. Diese Wirkungen resultieren aus dem lokalen und zeitlichen Zusammenspiel eines Liganden und f��nf G-Protein gekoppelter Rezeptoren (SSTR1-5). Zur Charakterisierung der biologischen Bedeutung des Somatostatin-Systems im Gesamtorganismus wurde eine Mutationsanalyse einzelner Systemkomponenten durchgef��hrt. Sie umfa��te die Inaktivierung der Gene f��r das Somatostatin-Pr��propeptid und die der Rezeptoren SSTR3 und SSTR4 durch Gene Targeting. Die entsprechenden Ausfallmutationen belegen: Weder die Rezeptoren 3 und 4, noch Somatostatin sind f��r das ��berleben des Organismus unter Standardhaltungsbedingungen notwendig. Die entsprechenden Mauslinien zeigen keine unmittelbar auff��lligen Einschr��nkungen ihrer Biologie. Die Somatostatin-Nullmaus wurde zum Hauptgegenstand einer detaillierten Untersuchung aufgrund der ��bergeordneten Position des Liganden in der Signalkaskade und verf��gbaren Hinweisen zu seiner Funktion. Folgende Schlu��folgerungen konnten nach eingehender Analyse gezogen werden: Der Ausfall des Somatostatin-Gens hat erh��hte Plasmakonzentrationen an Wachstumshormon (GH) zur Konsequenz. Dies steht im Einklang mit der Rolle Somatostatins als hemmender Faktor der Wachstumshormon-Freisetzung, die in der Mutante aufgehoben ist. Durch die Somatostatin-Nullmaus wurde zudem deutlich: Somatostatin interagiert als wesentliches Bindeglied zwischen der Wachstums- und Stre��achse. Permanent erh��hte Corticosteron-Werte in den Mutanten implizieren einen negativen tonischen Einflu�� f��r die Sekretion von Glukocorticoiden in vivo. Damit zeigt die Knockout-Maus, da�� Somatostatin normalerweise als ein entscheidendes inhibierendes Kontrollelement der Steroidfreisetzung fungiert. Verhaltensversuche offenbarten ein Defizit im motorischen Lernen. Somatostatin-Nullm��use bleiben im Lernparadigma ���Rotierender Stabtest��� hinter ihren Artgenossen zur��ck ohne aber generell in Motorik oder Koordination eingeschr��nkt zu sein. Diese motorischen Lernvorg��nge sind von einem funktionierenden Kleinhirn abh��ngig. Da Somatostatin und seine Rezeptoren kaum im adulten, wohl aber im sich entwickelnden Kleinhirn auftreten, belegt dieses Ergebnis die Funktion transient in der Entwicklung exprimierter Neuropeptide ��� eine lang bestehende, aber bislang experimentell nicht nachgewiesene Hypothese. Die ��berpr��fung weiterer physiologischer Parameter und Verhaltenskategorien unter Standard-Laborbedingunggen ergab keine sichtbaren Abweichungen im Vergleich zu Wildtyp-M��usen. Damit steht nun ein Tiermodell zur weiterf��hrenden Analyse f��r die Somatostatin-Forschung bereit: In endokrinologischen, elektrophysiologischen und verhaltens-biologischen Experimenten ist nun eine unmittelbare Korrelation selektiv mit dem Somatostatin-Peptid bzw. mit den Rezeptoren 3 und 4 aber auch in Kombination der Ausfallmutationen nach entsprechenden Kreuzungen m��glich.

Analyse genomischer Imbalancen in hepatozellul��ren Karzinomen und pr��neoplastischen Leberl��sionen

Das hepatozellul��re Karzinom (HCC) ist mit ungef��hr 1,000,000 neuen F��llen pro Jahr einer der h��ufigsten malignen Tumore weltweit. Es ist haupts��chlich in S��dost-Asien und im s��dlichen Afrika verbreitet. Risikofaktoren sind chronische Infektionen mit Hepatitis Viren (HBV, HCV), Aflatoxin B1-Belastung und chronischer Alkoholkonsum. Um Ver��nderungen auf genomischer Ebene in HCCs zu untersuchen, wurden in der vorliegenden Untersuchung Frischgewebeproben von 21 Patienten mit HCCs und formalin-fixiertes, paraffineingebettetes Material von 6 Dysplastischen Knoten mittels Comparativer genomischer Hybridisierung (CGH) analysiert. In den untersuchten HCCs konnte Zugewinne auf 1q (12/21), 6p ( 6/21), 8q (11/21), 17q (6/21), 20q (6/21), sowie Verluste auf 4q (7/21), 6q (4/21), 10q (3/21), 13q (4/21), 16q (3/21) identifiziert werden. Die Validit��t der mit diesem Ansatz erzielten Ergebnisse konnte anhand von unabh��ngigen Kontrollexperimenten mit Interphase-FISH-Analyse nachgewiesen werden. Die in Dysplastische Knoten identifizierten Ver��nderungen sind Gewinne auf 1q (50% ) sowie Verluste auf 8p und 17p. Daher stellt 1q eine Kandidatenregion f��r die Identifizierung jener Gene dar, die bereits im fr��hem Stadium der Hepatokarzinogenese aktiviert sind. Die Gen-Expressionsanalyse eines HCCs mit Gewinnen auf 1q, 8q, und Xq zeigte die ��berexpression von einigen Genen, die in den amplifizierten Regionen liegen. Daher kann spekuliert werden, dass die DNA-Amplifikation in der Hepatokarzinogenese bei einigen Genen ein Mechanismus der Aktivierung sein kann. Zusammengefasst konnte somit durch CGH-Analyse charakteristische, genomische Imbalances des HCC ermittelt werden. Der Vergleich mit Ver��nderungen bei pr��malignen L��sionen erlaubt die Unterscheidung fr��her (pr��maligner) und sp��ter (progressionsassoziierter) Ver��nderungen

Analyse der tempor��ren Neuroblastenbildung und der segmentalen Spezifizierung des Neuroblasten 6-4 im embryonalen zentralen Nervensystem von Drosophila melanogaster

Die vorliegende Arbeit gew��hrte neue Einblicke in zwei fundamentale Vorg��nge der fr��hen Neurogenese von Drosophila melanogaster. Der erste Teil untersuchte die zeitliche Spezifizierung der Neuroblastenidentit��ten. Durch die Expression verschiedener Gene entlang der Dorsoventral- und der Anterioposteriorachse wird ein kartesisches Koordinatensystem aufgebaut, indem ein Neuroblast (NB), der in einem bestimmten Quadranten entsteht, eine spezifische Identit��t erh��lt. Die Delamination der NBs erfolgt in f��nf Segregationswellen, wobei in jeder Welle die gleiche Population NBs gebildet wird. In dieser Arbeit konnte nun gezeigt werden, dass es nicht nur einen r��umlichen, sondern auch einen zeitlichen Aspekt bei der Entstehung der NBs gibt: So zeigten Transplantationsexperimente, dass sowohl im fr��hen als auch im sp��ten Neuroektoderm extrinsische induktive Signale an der Spezifizierung der Neuroblastenidentit��t beteiligt sind. Die Natur dieser Signale bleibt noch unklar. Allerdings stellen die Segmentpolarit��tsgene aufgrund ihrer dynamischen Expression eine potenzielle Kandidatengruppe dar. Der zweite Teil besch��ftigte sich mit der segmentalen Spezifizierung der Neuroblasten. F��r diesen Prozess zeigten fr��here Genexpressionsstudien, dass NBs, die zwar an korrespondierenden Positionen innerhalb des kartesischen Systems, aber in unterschiedlichen Segmenten gebildet werden, die gleichen Genexpressionsmuster aufweisen und fast identische Zellstammb��ume hervorbringen. Einige dieser seriell homologen NBs generieren jedoch segmentspezifische Zellstammb��ume ��� ein solches Beispiel ist der NB6-4, der als Modellsystem benutzt wurde. F��r die thorakale Variante dieses NBs konnte ich zeigen, dass die Hom��otischen Gene zur Spezifizierung nicht notwendig sind ��� thorakales Schicksal ist eine Grundidentit��t. Diese wird in abdominalen Segmenten jedoch durch die Funktion der Hom��otischen Gene abdominal-A (abd-A) und Abdominal-B (Abd-B) in abdominales Schicksal transformiert. Dieser segmentale Unterschied wird durch die Regulation des Zellzyklusgens CycE bewerkstelligen. Genauer: CycE ist notwendig, um neurogliales Schicksal in thorakalen Segmenten zu generieren und ausreichend, dieses Schicksal ebenfalls in abdominalen Segmenten zu erzeugen. Eine direkte Inhibierung der Expression von CycE durch Abd-A in abdominalen Segmenten f��hrt dagegen zu einer differenziellen Expression von CycE im neuronalen thorakalen Anteil des Zellstammbaums. Weiterhin konnten in einem Enhancerelement, das f��r die Expression von CycE im Nervensystem verantwortlich ist, mehrere Bindestellen f��r Abd-A und Abd-B gefunden werden. Die gewonnen Daten legen ��� in Verbindung mit bereits bekannten Ergebnissen ��� den Schluss nahe, dass diese neuronspezifizierende Funktion von CycE unabh��ngig von seiner Rolle im Zellzyklus ist.

Genetische Kartierung und QTL-Analyse agronomischer Eigenschaften der Weinrebe unter besonderer Ber��cksichtigung der Pilzresistenz

153 Nachkommen einer Kreuzung aus der pilzresistenten Rebsorte ���Regent��� und ���Lemberger��� als klassischer pilzsensitiver Sorte zeigen quantitative Merkmalsvariation bez��glich der Resistenz gegen Plasmopara viticola und Uncinula necator sowie f��r weitere Eigenschaften, die z.B. das Eintreten der Beerenreife betreffen. Auf dem Weg ��ber die genetische Kartierung mit molekularen Markern und der Lokalisierung von QTL-Effekten konnten Hinweise auf weinbaulich relevante Genomregionen gewonnen werden; dies liefert z.B. die Basis f��r markergest��tzte Selektion bei Zuchtvorhaben mit dem Resistenztr��ger ���Regent��� (vgl. auch FISCHER et al., 2004). Ein Major-QTL f��r die Resistenz gegen den Echten Mehltau Uncinula necator sowie zwei Major QTL f��r die Resistenz gegen den Erreger des Falschen Mehltau, Plasmopara viticola, traten mit hoher Signifikanz auf drei verschiedenen Kopplungsgruppen von ���Regent��� auf. Auch Regionen mit Relevanz f��r das Eintreten der Beerenreife wurden beschrieben. ��ber die Isolierung, Sequenzierung und anschlie��ende Analyse einzelner Markerfragmente mit Methoden der Bioinformatik ist es gelungen, ein putatives T10P12.4-Ortholog der Weinrebe (ein thioredoxin��hnliches Protein) in enger Kopplung zu einem Major-QTL-Maximum f��r Plasmopara viticola-Resistenz zu identifizieren, das als Kandidat f��r die Beteiligung an der Pathogenantwort in Frage kommt. Es konnte exemplarisch gezeigt werden, dass die eingesetzten Methoden der Kartierung und QTL-Analyse unter Verwendung PCR-basierter Markertypen wie SSR und AFLP und einer beschleunigten Analyse ��ber computergest��tzte Kapillargelelektrophorese in vertretbarem Zeitrahmen bis zur Isolation potentieller Schl��sselgene f��hren k��nnen. Die grunds��tzliche Eignung der QTL-Analyse als effizientes Werkzeug gezielter Z��chtungsplanung f��r den Weinbau best��tigte sich. Ihre Anwendung im Rahmen der vorliegenden Dissertation hat die Basis f��r die Nutzung von QTL-Information bei dem Vergleich etablierter und der Entwicklung neuer Sorten gelegt und zum Verst��ndnis von Prozessen beigetragen, die den betrachteten Eigenschaften wie der Pilzresistenz m��glicherweise zu Grunde liegen. Ein gro��er Teil der gewonnenen Daten bringt auch die Untersuchungen anderer Kultivare voran und ist intervarietal ��bertragbar. Dar��ber hinaus haben sich Chancen f��r vergleichende Studien zwischen der Weinrebe einerseits und der Modellpflanze Arabidopsis thaliana sowie weiteren Kulturpflanzen andererseits abgezeichnet. Die Hinweise auf die zentrale Rolle und universelle Natur des Redox-Signalling haben interessante Perspektiven zum Verst��ndnis organismen��bergreifender physiologischer Zusammenh��nge er��ffnet. Dies betrifft z.B. auch die Reaktion auf Verwundung oder die Pathogenantwort.