Ion channels in mixed tethered bilayer lipid membranes

Mixed tethered bilayer lipid membranes (tBLMs) are described based on the self-assembly of a monolayer on template stripped gold, of an archea analogue thiolipid, 2,3-di-o-phytanyl-sn-glycerol-1-tetraethylene glycol-D,L--lipoic acid ester lipid (DPTL), and a newly designed dilution molecule, tetraethylene glycol-D,L--lipoic acid ester (TEGL). The usage of spacer and addition of extra dilution molecules between the substrate and the bilayer is that this architecture provides an ionic reservoir underneath the membrane, avoiding direct contact of the embedded membrane proteins with the gold electrodes and increasing the lateral diffusion of the bilayer, thus allowing for the incorporation of complex channels proteins which are failed in non-diluted systems. The tBLM is completed by fusion of liposomes made from a mixture of 1,2-diphythanolyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPhyPC), cholesterol, and 1,2-diphytanoyl-sn-Glycero-3-phosphate (DPhyPG) in a molar ratio of 6:3:1. Varying the mixing ratio, the optimum mixing ratio was obtained at a dilution factor of DPTL and TEGL at 90%:10%. Only under these conditions, the mixed tBLM showed electrical properties, as shown by EIS, which are comparable to a BLM. With higher dilution factors, a defect-free lipid bilayer was not formed. Formation of bilayers have been characterized by different techniques, such as surface plasmon resonance (SPR), electrochemical impedance spectroscopy (EIS), atomic force microscopy (AFM), and quartz crystal microbalance (QCM). Different proteins such as hemolysin, melittin, gramicidin, M2, Maxi-K, nAChR and bacteriohodopsin are incorporated into these tBLMs as shown by SPR and EIS studies. Ionic conductivity at 0 V vs. Ag|AgCl, 3M KCl were measured by EIS measurements. Our results indicate that these proteins have been successfully incorporated into a very stable tBLM environment in a functionally active form. Therefore, we conclude that the mixed tBLMs have been successfully designed as a general platform for biosensing and screening purposes of membrane proteins.

Effect of drug physicochemical properties on the release from liposomal systems in vitro and in vivo

Liposomes were discovered about 40 years ago by A. Bangham and since then they became very versatile tools in biology, biochemistry and medicine. Liposomes are the smallest artificial vesicles of spherical shape that can be produced from natural untoxic phospholipids and cholesterol. Liposome vesicles can be used as drug carriers and become loaded with a great variety of molecules, such as small drug molecules, proteins, nucleotides and even plasmids. Due to the variability of liposomal compositions they can be used for a large number of applications. In this thesis the β-adrenoceptor antagonists propranolol, metoprolol, atenolol and pindolol, glucose, 18F-Fluorodeoxyglucose (FDG) and Er-DTPA were used for encapsulation in liposomes, characterization and in vitro release studies. Multilamellar vesicles (MLV), large unilamellar vesicles (LUV) and smaller unilamellar vesicles (SUV) were prepared using one of the following lipids: 1,2-Dimyristoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine (DMPC), 1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine (DSPC), Phospholipone 90H (Ph90H) or a mixture of DSPC and DMPC (1:1). The freeze thawing method was used for preparation of liposomes because it has three advantages (1) avoiding the use of chloroform, which is used in other methods and causes toxicity (2) it is a simple method and (3) it gives high entrapping efficiency. The percentage of entrapping efficiencies (EE) was different depending on the type and phase transition temperature (Tc) of the lipid used. The average particle size and particle size distribution of the prepared liposomes were determined using both dynamic light scattering (DLS) and laser diffraction analyzer (LDA). The average particle size of the prepared liposomes differs according to both liposomal type and lipid type. Dispersion and dialysis techniques were used for the study of the in vitro release of β-adrenoceptor antagonists. The in vitro release rate of β-adrenoceptor antagonists was increased from MLV to LUV to SUV. Regarding the lipid type, β-adrenoceptor antagonists exhibited different in vitro release pattern from one lipid to another. Two different concentrations (50 and 100mg/ml) of Ph90H were used for studying the effect of lipid concentration on the in vitro release of β-adrenoceptor antagonists. It was found that liposomes made from 50 mg/ml Ph90H exhibited higher release rates than liposomes made at 100 mg/ml Ph90H. Also glucose was encapsulated in MLV, LUV and SUV using 1,2-Dimyristoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine (DMPC), 1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine (DSPC), Phospholipone 90H (Ph90H), soybean lipid (Syb) or a mixture of DSPC and DMPC (1:1). The average particle size and size distribution were determined using laser diffraction analysis. It was found that both EE and average particle size differ depending on both lipid and liposomal types. The in vitro release of glucose from different types of liposomes was performed using a dispersion method. It was found that the in vitro release of glucose from different liposomes is dependent on the lipid type. 18F-FDG was encapsulated in MLV 1,2-Dimyristoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine (DMPC), 1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine (DSPC), Phospholipone 90H (Ph90H), soybean lipid (Syb) or a mixture of DSPC and DMPC (1:1). FDG-containing LUV and SUV were prepared using Ph90H lipid. The in vitro release of FDG from the different types of lipids was accomplished using a dispersion method. Results similar to that of glucose release were obtained. In vivo imaging of FDG in both uncapsulated FDG and FDG-containing MLV was performed in the brain and the whole body of rats using PET scanner. It was found that the release of FDG from FDG-containing MLV was sustained. In vitro-In vivo correlation was studied using the in vitro release data of FDG from liposomes and in vivo absorption data of FDG from injected liposomes using microPET. Erbium, which is a lanthanide metal, was used as a chelate with DTPA for encapsulation in SUV liposomes for the indirect radiation therapy of cancer. The liposomes were prepared using three different concentrations of soybean lipid (30, 50 and 70 mg/ml). The stability of Er-DTPA SUV liposomes was carried out by storage of the prepared liposomes at three different temperatures (4, 25 and 37 °C). It was found that the release of Er-DTPA complex is temperature dependent, the higher the temperature, the higher the release. There was an inverse relationship between the release of the Er-DTPA complex and the concentration of lipid.

Identifizierung eines adaptiven antibakteriellen Abwehrmechanismus des marinen Schwammes Suberites domuncula

Schwämme (Porifera) sind die phylogenetisch ältesten Metazoa. Sie besitzen komplexe Abwehrsysteme, welche vor allem auf der Synthese bioaktiver niedermolekularer Sekundärmetaboliten beruhen und diese Tiere zu einer der reichhaltigsten Quellen für medizinisch nutzbare Wirkstoffe machen. Besonders der marine Einsiedler-Korkschwamm (Suberites domuncula) hat sich in den letzten Jahren zur Untersuchung der molekularen Zusammenhänge dieser Abwehrmechanismen als besonders geeignet herausgestellt. So wurden in diesem Schwamm beispielsweise zwei lyso-PAF (plättchenaktivierender Faktor) Derivate (1-O Hexadecyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholin und 1-O-Octadecyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholin) identifiziert und charakterisiert, sowie deren ausgeprägte antibakterielle Aktivität besonders gegenüber gramnegativen Bakterien demonstriert. Eine Behandlung mit der Modellsubstanz zur Simulation einer bakteriellen Infektion, dem Endotoxin Lipopolysaccharid (LPS), für insgesamt 72 Stunden resultierte in einem Anstieg der Expressionslevel zweier an der Biosynthese dieser bioaktiven Etherphospholipide beteiligten Proteine. Unter Anwendung der Methode des Differential Display konnte einerseits das Schlüsselenzym der Etherphospholipid Biosynthese Alkyl- Dihydroxyacetonphosphat (DHAP)-Synthase und andererseits die regulatorische Untereinheit der PAF-deacetylierenden PAF Acetylhydrolase I

Laboruntersuchungen zur Aufnahme von N 2 O 5, HNO 3 und NO 2 auf Mineralstaub

Mit Hilfe eines Aerosolströmungsreaktors wurden erstmals die heterogenen Reaktionen der Spurengase N2O5, HNO3 und NO2 mit verschiedenen synthetischen Mineralstäuben und dem natürlichen Mineralstaub Saharastaub untersucht. Es wurden Aufnahmekoeffizienten für die Reaktion von N2O5 mit Saharastaub, Arizona Teststaub, Kalzit und Quartz bei Zimmertemperatur, Atmosphärendruck, unterschiedlichen relativen Feuchten und N2O5-Konzentrationen zwischen 5·10^12 und 3·10^13 Moleküle/cm^3 bestimmt. Die Aufnahmekoeffizienten für N2O5 auf Mineralstaub lagen zwischen 1,90·10^−2 (Saharastaub) und 0,63·10^−2 (Kalzit), unabhängig von der relativen Feuchte und der N2O5-Konzentration. Als Reaktionsprodukt wurde HNO3 in der Gasphase gefunden. Es wurde eine Aufnahme von HNO3 auf Saharastaub beobachtet, NO2 wurde nicht caufgenommen. Für NO2 konnte eine obere Grenze von gamma = 4·10^−4 für den Aufnahmekoeffizienten gewonnen werden. Die Aufnahme von N2O5 und auch HNO3 beeinflusst die photochemischen Kreisläufe von NOx und NOy in der Troposphäre. Zum einen führt die Aufnahme von N2O5 zu einer Abnahme in Ozonkonzentrationen und zum anderen zu einer Reduktion von NO3, was beides die oxidative Kraft in der Troposphäre herabsetzt.

Silylsubstituierte Tetrylene in der Synthese niedervalenter Zinn- und Bleiverbindungen

Bei den schweren Tetrylenen [ERR’, E = Si—Pb; R, R’ = Organyl-, elementorganischer Rest] zeigt sich ein Lewis-amphoterer Charakter, der bei den silylsubstituierten besonders ausgeprägt ist, wodurch sie wertvolle Vorstufen für Folgereaktionen darstellen. Bis zur Fertigstellung der Arbeit waren von den schwersten Vertretern lediglich vier homoleptische silylsubstituierte Stannylene/Distannene und zwei Plumbylene bekannt und strukturell charakterisiert. Im Rahmen dieser Arbeit wurden nun zwei weitere homoleptische silylsubstituierte Stannylene und zwei Plumbylene charakterisiert [E{Si(SiMe3)2SiMe2t-Bu}2, E{Si(SiMe3)2Sii-Pr3}2, E =Sn, Pb]. Diese Stannylene und Sn[Si(SiMe3)3]2 reagieren mit AlH3NMe3 beziehungsweise LiAlH4 in einer α-Addition. Geht man zu dem sterisch weniger anspruchsvollen Silylsubstituenten Si(SiMe3)2Et über, so lassen sich ein neues Kaliumplumbanid und das bislang erste stabile einkernige Blei(III)-Radikal Pb[Si(SiMe3)2Et]3 synthetisieren. Analog lassen sich E[Si(SiMe3)3]3 [E = Sn, Pb] darstellen, von denen bislang nur die Zinnverbindung isoliert werden konnte. Pb[Si(SiMe3)3]2 reagiert mit Lewis-Basen [THF, NH3, KN(SiMe3)2, „KI"] zu den entsprechenden Addukten. Darüberhinaus wurden zwei Aluminiumsilylverbindungen [AlH2[Si(SiMe3)2SiMe2t-Bu]NMe3, LiAlH3[Si(SiMe3)3]] und die bislang ersten röntgenographisch charakterisierten tetrasilylsubstituierten Plumbane [Pb[Si(SiMe3)2Et]3R, R = SiMe3, Si(SiMe3)2Et] isoliert.

Reaktion von Übergangsmetallhydrid-Komplexen mit Tetrylenen und Ein-Elektronen-Reduktion von Halogentetranen

Das Stannylen SnHyp2 (Hyp = Si(SiMe3)3) reagiert mit den Übergangsmetallhydrid-Komplexen Cp2MH2 (Cp = C5H5, M = Mo, W) in einer alpha-Additionsreaktion zu Cp2MSn(H)Hyp2. Ferner bilden sich unter Abspaltung von HSi(SiMe3)3 auch vierkernige Verbindungen der Form [Cp2MSn(H)Hyp]2, welche für M = Mo röntgendiffraktometrisch nachgewiesen wurden. Erhöht man den sterischen Anspruch der Silylreste des Stannylens, so nimmt die Tendenz der Adduktbildung ab, so dass nur die vierkernigen Komplexe nachweisbar sind. Im Fall für SnSit2 (Sit = Si(SiMe3)2SiMe2tBu) konnten sogar Stereoisomere der vierkernigen Verbindungen [Cp2MoSn(H)Sit]2 nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu reagiert das Plumbylen PbHyp2 mit Cp2MoH2 in einer Substitutionsreaktion zu dem nachgewiesenen Cp2Mo(H)Hyp. Bei größer werdendem Silylrest werden andere Reaktionsabläufe bevorzugt. Auf dem Forschungsgebiet der Ein-Elektronen-Reduktion von Halogenstannanen und -plumbanen XER2R´ (X = Halogen; E = Sn, Pb; R = Silylrest; R = Aryl- / Alkylrest) mit dem 19-Elektronen-Komplex Decamethylcobaltocen CoCp*2 (Cp* = C5Me5) konnten Unterschiede zwischen den Verbindungen des Zinns und des Bleis festgestellt werden: Bei der Reduktion von Halogenstannanen fallen die erwarteten Decamethylcobaltocenium-Halogenide [CoCp*2]X aus und ESR-Messungen bestätigen die Anwesenheit von Stannylradikalen, während bei der Reduktion von hypersilylierten Halogenplumbanen unterschiedliche Folgeprodukte entstehen und Plumbylradikale via ESR-Spektroskopie nicht feststellbar sind. Bei alkylhaltigen Halogenplumbanen XPbHyp2R (R = Alkyl) findet eine Spaltung der Pb-C-Bindung statt und es bilden sich Plumbate der Form [CoCp*2][PbHyp2X], während die Reduktion von einem arylhaltigen Halogenplumban IPbHyp2Ph (Ph = Phenyl) das erwartete Decamethylcobaltocenium-Salze ergibt.