Charakterisierung der Vinorin-Synthase aus Rauvolfia serpentina durch Reinigung, Expression, Mutation und Kristallisation

ABSTRACTDie vorliegende Arbeit befasste sich mit der Reinigung,heterologen Expression, Charakterisierung, molekularenAnalyse, Mutation und Kristallisation des EnzymsVinorin-Synthase. Das Enzym spielt eine wichtige Rolle inder Ajmalin-Biosynthese, da es in einerAcetyl-CoA-abhängigen Reaktion die Umwandlung desSarpagan-Alkaloids 16-epi-Vellosimin zu Vinorin unterBildung des Ajmalan-Grundgerüstes katalysiert. Nach der Reinigung der Vinorin-Synthase ausHybrid-Zellkulturen von Rauvolfia serpentina/Rhazya strictamit den fünf chromatographischen TrennmethodenAnionenaustauschchromatographie an SOURCE 30Q, HydrophobeInteraktionen Chromatographie an SOURCE 15PHE,Chromatographie an MacroPrep Ceramic Hydroxyapatit,Anionenaustauschchromatographie an Mono Q undGrößenausschlußchromatographie an Superdex 75 konnte dieVinorin-Synthase aus 2 kg Zellkulturgewebe 991fachangereichert werden.Das nach der Reinigung angefertigte SDS-Gel ermöglichte eineklare Zuordnung der Protein-Bande als Vinorin-Synthase.Der Verdau der Enzymbande mit der Endoproteinase LysC unddie darauffolgende Sequenzierung der Spaltpeptide führte zuvier Peptidsequenzen. Der Datenbankvergleich (SwissProt)zeigte keinerlei Homologien zu Sequenzen bekannterPflanzenenzyme. Mit degenerierten Primern, abgeleitet voneinem der erhaltenen Peptidfragmente und einer konserviertenRegion bekannter Acetyltransferasen gelang es, ein erstescDNA-Fragment der Vinorin-Synthase zu amplifizieren. Mit derMethode der RACE-PCR wurde die Nukleoidsequenzvervollständigt, was zu einem cDNA-Vollängenklon mit einerGröße von 1263 bp führte, der für ein Protein mit 421Aminosäuren (46 kDa) codiert.Das Vinorin-Synthase-Gen wurde in den pQE2-Expressionsvektorligiert, der für einen N-terminalen 6-fachen His-tagcodiert. Anschließend wurde sie erstmals erfolgreich in E.coli im mg-Maßstab exprimiert und bis zur Homogenitätgereinigt. Durch die erfolgreiche Überexpression konnte dieVinorin-Synthase eingehend charakterisiert werden. DerKM-Wert für das Substrat Gardneral wurde mit 20 µM, bzw.41.2 µM bestimmt und Vmax betrug 1 pkat, bzw. 1.71 pkat.Nach erfolgreicher Abspaltung des His-tags wurden diekinetischen Parameter erneut bestimmt (KM- Wert 7.5 µM, bzw.27.52 µM, Vmax 0.7 pkat, bzw. 1.21 pkat). Das Co-Substratzeigt einen KM- Wert von 60.5 µM (Vmax 0.6 pkat). DieVinorin-Synthase besitzt ein Temperatur-Optimum von 35 °Cund ein pH-Optimum bei 7.8.Homologievergleiche mit anderen Enzymen zeigten, dass dieVinorin-Synthase zu einer noch kleinen Familie von bisher 10Acetyltransferasen gehört. Alle Enzyme der Familie haben einHxxxD und ein DFGWG-Motiv zu 100 % konserviert. Basierendauf diesen Homologievergleichen und Inhibitorstudien wurden11 in dieser Proteinfamilie konservierte Aminosäuren gegenAlanin ausgetauscht, um so die Aminosäuren einer in derLiteratur postulierten katalytischen Triade(Ser/Cys-His-Asp) zu identifizieren.Die Mutation aller vorhandenen konservierten Serine undCysteine resultierte in keiner Mutante, die zumvollständigen Aktivitätsverlust des Enzyms führte. Nur dieMutationen H160A und D164A resultierten in einemvollständigen Aktivitätsverlust des Enzyms. Dieses Ergebniswiderlegt die Theorie einer katalytischen Triade und zeigte,dass die Aminosäuren H160A und D164A exklusiv an derkatalytischen Reaktion beteiligt sind.Zur Überprüfung dieser Ergebnisse und zur vollständigenAufklärung des Reaktionsmechanismus wurde dieVinorin-Synthase kristallisiert. Die bis jetzt erhaltenenKristalle (Kristallgröße in µm x: 150, y: 200, z: 200)gehören der Raumgruppe P212121 (orthorhombisch primitiv) anund beugen bis 3.3 Å. Da es bis jetzt keine Kristallstruktureines zur Vinorin-Synthase homologen Proteins gibt, konntedie Struktur noch nicht vollständig aufgeklärt werden. ZurLösung des Phasenproblems wird mit der Methode der multiplenanomalen Dispersion (MAD) jetzt versucht, die ersteKristallstruktur in dieser Enzymfamilie aufzuklären.

Interactions of inhaled nanoparticles with the alveolar-capillary barrier of the human respiratory tract

In dieser Arbeit wurden zytotoxische Effekte sowie die inflammatorische Reaktionen des distalen respiratorischen Traktes nach Nanopartikelexposition untersucht. Besondere Aufmerksamkeit lag auch auf der Untersuchung unterschiedlicher zellulärer Aufnahmewege von Nanopartikeln wie z.B. Clathrin- oder Caveolae-vermittelte Endozytose oder auch Clathrin- und Caveolae-unabhängige Endozytose (mit möglicher Beteiligung von Flotillinen). Drei unterschiedliche Nanopartikel wurden hierbei gewählt: amorphes Silica (aSNP), Organosiloxan (AmorSil) und Poly(ethyleneimin) (PEI). Alle unterschiedlichen Materialien gewinnen zunehmend an Interesse für biomedizinische Forschungsrichtungen (drug and gene delivery). Insbesondere finden aSNPs auch in der Industrie vermehrt Anwendung, und stellen somit ein ernstzunehmendes Gesundheitsrisiko dar. Dieser wird dadurch zu einem begehrten Angriffsziel für pharmazeutische Verabreichungen von Medikamenten über Nanopartikel als Vehikel aber bietet zugleich auch eine Angriffsfläche für gesundheitsschädliche Nanomaterialien. Aus diesem Grund sollten die gesundheitsschädigenden Risiken, sowie das Schicksal von zellulär aufgenommenen NPs sorgfältig untersucht werden. In vivo Studien an der alveolaren-kapillaren Barriere sind recht umständlich. Aus diesem Grund wurde in dieser Arbeit ein Kokulturmodel benutzt, dass die Alveolar-Kapillare Barrier in vivo nachstellt. Das Model besteht aus dem humanen Lungenepithelzelltyp (z.B. NCI H441) und einem humanen microvasculären Endothelzelltyp (z.B. ISO-HAS-1), die auf entgegengesetzten Seiten eines Transwell-Filters ausgesät werden und eine dichte Barriere ausbilden. Die NP Interaktion mit Zellen in Kokultur wurde mit denen in konventioneller Monokultur verglichen, in der Zellen 24h vor dem Experiment ausgesät werden. Diese Studie zeigt, dass nicht nur die polarisierte Eigenschaft der Zellen in Kokultur sondern auch die unmittelbare Nähe von Epithel und Endothelzelle ausschlaggebend für durch aSNPs verursachte Effekte ist. Im Hinblick auf inflammatorische Marker (sICAM, IL-6, IL8-Ausschüttung), reagiert die Kokultur auf aSNPs empfindlicher als die konventionelle Monokultur, wohingegen die Epithelzellen in der Kokultur auf zytotoxikologischer Ebene (LDH-Ausschüttung) unempfindlicher auf aSNPs reagierten als die Zellen in Monokultur. Aufnahmestudien haben gezeigt, dass die Epithelzellen in Kokultur entschieden weniger NPs aufnehmen. Somit zeigen die H441 in der Kokultur ähnliche epitheliale Eigenschaften einer schützenden Barriere, wie sie auch in vivo zu finden sind. Obwohl eine ausreichende Aufnahme von NPs in H441 in Kokultur erreicht werden konnte, konnte ein Transport von NPs durch die epitheliale Schicht und eine Aufnahme in die endotheliale Schicht mit den gewählten Inkubationszeiten nicht gezeigt werden. Eine Clathrin- oder Caveolae-vermittelte Endozytose von NPs konnte mittels Immunfluoreszenz weder in der Mono- noch in der Kokultur nachgewiesen werden. Jedoch zeigte sich eine Akkumulation von NPs in Flotillin-1 und-2 enthaltende Vesikel in Epithelzellen aus beiden Kultursystemen. Ergebnisse mit Flotillin-inhibierten (siRNA) Epithelzellen, zeigten eine deutlich geringere Aufnahme von aSNPs. Zudem zeigte sich eine eine reduzierte Viabilität (MTS) von aSNP-behandelten Zellen. Dies deutet auf eine Beteiligung von Flotillinen an unbekannten (Clathrin oder Caveolae -unabhängig) Endozytosemechanismen und (oder) endosomaler Speicherung. Zusammenfassend waren die Aufnahmemechanismen für alle untesuchten NPs in konventioneller Monokultur und Kokultur vergleichbar, obwohl sich die Barriereeigenschaften deutlich unterscheiden. Diese Arbeit zeigt deutlich, dass sich die Zellen in Kokultur anders verhalten. Die Zellen erreichen hierbei einen höheren Differenzierungsgrad und eine Zellkommunikation mit anderen relevanten Zelltypen wird ermöglicht. Durch das Einbringen eines dritten relevanten Zelltyps in die Kokultur, des Alveolarmakrophagen (Zelllinie THP-1), welcher die erste Verteidigungsfront im Alveolus bildet, wird diese Aussage weiter bekräftigt. Erste Versuche haben gezeigt, dass die Triplekultur bezüglich ihrer Barriereeigenschaften und IL-8-Ausschüttung sensitiver auf z.B. TNF- oder LPS-Stimulation reagiert als die Kokultur. Verglichen mit konventionellen Monokulturen imitieren gut ausgebildete, multizelluräre Kokulturmodelle viel präziser das zelluläre Zusammenspiel im Körper. Darum liefern Nanopartikelinteraktionen mit dem in vitro-Triplekulturmodel aufschlussreichere Ergebnisse bezüglich umweltbedingter oder pharmazeutischer NP-Exposition in der distalen Lung als es uns bisher möglich war.

Funktion der C 4-Dicarboxylat-Transporter DctA und DcuB als Co-Sensoren von DcuS in Escherichia coli

Escherichia coli kann C4-Dicarboxylate sowohl unter aeroben als auch unter anaeroben Bedingungen zur Energiekonservierung nutzen. Die Synthese der beteiligten Transporter und Enzyme wird auf der Transkriptionsebene durch das Zweikomponentensystem DcuSR reguliert. DcuS ist der Sensor für C4-Dicarboxylate. Der Antwortregulator DcuR wird von DcuS aktiviert und induziert die Expression des C4-Dicarboxylat-Transporters DctA unter aeroben Verhältnissen. Anaerob verstärkt DcuSR die Expression des Fumarat/Succinat-Antiporters DcuB, der Fumarase B und der Fumaratreduktase FrdABCD. DctA und DcuB agieren als Co-Sensoren von DcuS und üben einen negativen Effekt auf die Genexpression von dctA bzw. dcuB aus.rnIn dieser Arbeit wurde die Funktion von DctA und DcuB als Co-Sensoren von DcuS untersucht. Sowohl für DcuB als auch für DctA wurde eine direkte Protein-Protein-Interaktion mit DcuS über ein bakterielles Two-Hybrid System nachgewiesen. DcuS bildete ein Transporter-Sensor-Cluster mit DctA und DcuB. C-terminale Verkürzung und die Mutagenese einzelner Aminosäuren der C-terminalen Helix 8b von DctA führten zu einem Verlust der Interaktion mit DcuS. Mit dieser Interaktion gingen sowohl die regulatorische Funktion als auch die Transportfunktion der Punktmutante DctA-L414A verloren. Ein Verlust der Interaktion wurde ebenfalls zwischen einer konstitutiv aktiven DcuS-Mutante und wildtypischem DctA beobachtet. Ebenso zeigte sich eine partielle Reduktion der Interaktion von DcuS mit DctA, wenn DcuS nach der zweiten Transmembranhelix verkürzt wurde. Die Interaktion zwischen DcuS und DctA wurde durch den Effektor Fumarat modifiziert, ging aber nicht komplett verloren.rnDctA konnte in verschiedenen Plasmidsystemen überproduziert werden und bildete Homotrimere. Die Topologie von DctA wurde mit experimentellen und in silico Methoden aufgeklärt. DctA ähnelt der Struktur und Topologie des Aminosäuretransporters Glt aus Pyrococcus horikoshii. DctA besitzt acht Transmembranhelices mit einem cytosolischen N- und C-Terminus sowie zwei Haarnadelschleifen. Die Substratbindung findet höchstwahrscheinlich in den Haarnadelschleifen statt und der Transport erfolgt nach dem „alternating access“ Modell.rnAußerdem wurde die Funktion des Transporters YfcC untersucht. Das Gen yfcC wurde mit Schlüsselgenen des Acetatstoffwechsels co-transkribiert. In yfcC-Deletionsstämmen zeigte sich ein stammspezifischer Defekt bei Wachstum mit Acetat und Transport von Acetat.

Characterisation of human co-culture systems for applications in bone tissue engineering

For the successful integration of bone tissue engineering constructs into patients, an adequate supply with oxygen and nutrients is critical. Therefore, prevascularisation of bone tissue engineering constructs is desirable for bone formation, remodelling and regeneration. Co-culture systems, consisting of human endothelial cells and primary osteoblasts (pOB) as well as osteosarcoma cell lines, represent a promising method for studying the mechanisms involved in the vascularisation of constructs in bone tissue en- gineering and could provide new insights into the molecular and cellular mechanisms that control essential processes during angiogenesis. The present study demonstrated the im- portant components of co-culture systems with a focus on bone tissue replacement and the angiogenic effects of pOB and osteosarcoma cell lines on human endothelial cells. Furthermore, the studies emphasised an overall approach for analysis of signal molecules that are involved in the angiogenic activation of human endothelial cells by the regulation of VEGF-related pathways at the transcriptional and translational levels. The osteosarcoma cell lines Cal-72, MG-63 and SaOS-2, as well as pOB from several donors, differed in their angiogenesis-inducing potential in 2-D and 3-D co-culture systems. SaOS-2 cells appeared to have a high osteogenic differentiation level with no detectable angiogenesis-inducing potential in co-culture with human endothelial cells. The angiogenic potential of the osteoblast-like cells is mainly correlated with the upregulation of essential angiogenic growth factors, such as VEGF, bFGF and HGF and the downregulation of the angiogenesis inhibitor, endostatin. However, other factors involved in angiogenic regulation were found to differ between SaOS-2 cells, compared to Cal-72 and MG-63. The present study focuses on VEGF pathway-effecting genes as key players in the regulation of angiogenesis. The levels of VEGF and VEGF-effecting genes, such as TGF-α and TIMP-2 are down-regulated in SaOS-2 cells. In contrast, direct regulators of VEGF, such as IL6, IL8 and TNF are strongly upregulated, which indicates disruptions in growth factor regulating pathways in SaOS-2 cells. Potential pathways, which could be involved include MEK, PI3K, MAPK, STAT3, AKT or ERK. Additional treatment of co-cultures with single growth factors did not accelerate or improve the angiogenesis-inducing potential of SaOS-2 cells. Knowledge of the detailed molecular mechanisms involved in angiogenesis control will hopefully allow improved approaches to be developed for prevascularisation of bone tissue engineering constructs.

Antigenspezifische DNA-Immunisierung in Kombination mit IDO-kodierenden Plasmiden zur Therapie der experimentellen Typ I-Allergie

Derzeit stellt die allergenspezifische Immuntherapie die einzige nicht allein antisymptomatische Behandlungsform zur langfristigen Therapie von Typ I-Allergien dar, welche grundlegende Änderungen im immunologischen Geschehen induziert. Sie ist jedoch verbesserungswürdig in Bezug auf Behandlungsdauer, Erfolgschancen und Nebenwirkungen. Daher wurde in dieser Arbeit eine Strategie zur Therapie von Typ I-Allergien entwickelt und evaluiert, welche auf der Inhibition allergenspezifischer T-Zellen durch Dendritische Zellen (DC), die selektiv nach DNA-Immunisierung sowohl das relevante Allergen als auch Indolamin 2,3-dioxygenase (IDO) konstitutiv produzieren, basiert. IDO ist ein Enzym aus dem Tryptophan-Stoffwechsel, dessen Produktion durch DC einen lokalen immunsuppressiven Mechanismus induziert und in verschiedenen Situationen mit der Induktion peripherer Toleranz assoziiert ist. Zunächst wurden Plasmide hergestellt, die entweder IDO alleine oder IDO zusammen mit dem Antigen unter der Kontrolle des ubiquitär aktiven CMV- bzw. des DC-spezifischen Fascin-Promotors kodieren. Die Überprüfung der IDO-Expression durch die monocistronischen Plasmide anhand von Transfektionsexperimenten in vitro ergab, dass die IDO-Expression unter der Kontrolle des CMV-Promotors sehr viel stärker ausfiel als unter der Kontrolle des Fascin-Promotors. Nach Transfektion mit den bicistronischen Vektoren, in denen die Transgene für das Antigen und IDO durch eine IRES-Sequenz verbunden waren, war die IDO-Expression jedoch insgesamt sehr schwach. Im Rahmen der Überprüfung der Funktionalität der IDO-Expressionplasmide in vivo unter Verwendung der Genpistole wurden daher lediglich Plasmide getestet, die alleine IDO unter der Kontrolle des CMV-Promotors bzw. des Fascin-Promotors kodieren. Auch in vivo wurde eine stärkere IDO-Expression nach biolistischer Transfektion mit solchen Vektoren beobachtet, in denen der CMV-Promotor zur Expressionskontrolle verwendet wurde. Die Analyse des Einflusses einer Koexpression von IDO auf die durch biolistische Immunisierung mit einem antigenkodierenden Vektor induzierte systemische Immunantwort offenbarte einen inhibitorischer Effekt für den Fall, dass die Antigenproduktion mittels des Fascin-Promotors auf DC fokussiert war und die Expression des koapplizierten IDO-Transgens unter der Kontrolle des CMV-Promotors stand. In diesem Fall wurde eine Reduktion der antigenspezifischen IgG1- und IgG2a-Produktion, eine verringerte Sekretion von IFN-y durch restimulierte Milz- und Lymphknotenzellen sowie eine Reduktion der Zahl antigenspezifischer CD8+ Effektor-T-Zellen nachgewiesen. Im Mausmodell der IgE-vermittelten Typ I-Allergie wurde weiterhin gezeigt, dass nach prophylaktischer biolistischer Vakzinierung unter Verwendung dieser Vektorkombination eine Inhibition der durch die Vakzinierung bedingten antigenspezifischen Th1-Immunantwort ausgelöst wurde. Die Suppression der Th2-Antwort, welche durch Transfektion mit dem Antigenkodierenden Vektor unter Kontrolle des Fascin-Promotors bewirkt wurde, wurde durch Kotransfektion mit den IDO-kodierenden Vektoren aufrecht erhalten.

Translationsregulation des Myelin basischen Proteins in Gliazellen

Im zentralen Nervensystem (ZNS) myelinisieren Oligodendrozyten neuronale Axone, indem sie ihre Zellfortsätze mehrfach um axonale Segmente wickeln. Die Ausbildung dieser multilamellaren Membranstapel ermöglicht eine saltatorische und damit rasche und energie-effiziente Erregungsleitung (Nave, 2010). Eine Schädigung des Myelins beeinträchtigt die Reizweiterleitung und führt zur Degeneration der Axone, wie es zum Beispiel bei der Multiplen Sklerose der Fall ist. Das Myelin basische Protein (MBP) ist ein Hauptbestandteil des Myelin und ist essentiell für die Kompaktierung der Myelinmembran (Wood et al., 1984). Die MBP mRNA wird in hnRNP A2 enthaltenen RNA Granulen in einem translations-inaktiven Zustand zu den distalen Fortsätzen transportiert. Vermittelt durch axonale Signale wird nach axo-glialem Kontakt die Translation von MBP ermöglicht (White et al., 2008). Der genaue Mechanismus der differentiellen Genregulation des MBP Proteins ist bisher nur unzureichend aufgeklärt. In der vorliegenden Arbeit konnte eine kleine regulatorische RNA (sncRNA) identifiziert werden, welche über die seed Region mit der MBP mRNA interagieren und die Translation regulieren kann. In primären Oligodendrozyten führt die Überexpression der sncRNA-715 zu reduzierten MBP Protein Mengen und die Blockierung der endogenen sncRNA-715 führt zu einer gesteigerten MBP Synthese. Interessanterweise korreliert während der Differenzierung der Oligodendrozyten in vitro und in vivo die Synthese des MBP Proteins invers mit der Expression der sncRNA-715. In Oligodendrozyten beeinflusst eine experimentell erhöhte sncRNA-715 Menge die Zellmorphologie und induziert Apoptose. Weiterhin ist sncRNA-715 in zytoplasmatischen granulären Strukturen lokalisiert und assoziiert mit MBP mRNA in hnRNP A2 Transport- Granula. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass sncRNA-715 ein Bestandteil der hnRNP A2 Granula sein könnte und dort spezifisch die Translation der MBP mRNA während des Lokalisationsprozesses inhibiert. In chronischen MS Läsionen sind Olig2+-Zellen zu finden. Obwohl die MBP mRNA in diesen Läsionen nachzuweisen ist, kann kein Protein synthetisiert werden. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass in diesen Läsionen die Expression der sncRNA-715 erhöht ist. SncRNA-715 könnte die Translation von MBP verhindern und folglich als Inhibitor der Remyelinisierung während des Krankheitsverlaufs fungieren. Schwann-Zellen sind die myelinisierenden Zellen im peripheren Nervensystem (PNS). Im Zuge der Myelinisierung wird die MBP mRNA in diesen Gliazellen ebenfalls in die distalen Fortsätze transportiert und dort lokal translatiert und in die Myelinmembran eingebaut (Trapp et al., 1987). Im Gegensatz zum ZNS ist im PNS nur wenig über den Transportmechanismus der mRNA bekannt (Masaki, 2012). Es ist es sehr wahrscheinlich, dass in Schwann-Zellen und Oligodendrozyten die Lokalisation und die translationale Hemmung der MBP mRNA ähnlichen Mechanismen unterliegen. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass hnRNP A2 und sncRNA-715 in Schwann-Zellen exprimiert werden und in zytoplasmatischen Granula-ähnlichen Strukturen lokalisiert sind. Während der Differenzierung dieser Gliazellen in vivo und in vitro korreliert die Expression der sncRNA-715 invers mit der Synthese des MBP Proteins. HnRNP A2 und sncRNA-715 scheinen in Schwann-Zellen assoziiert zu sein und könnten wie in Oligodendrozyten den Transport der MBP mRNA vermitteln.

Tissue engineering strategies for biomaterial-based anticancer drug delivery and enhancement of angiogenesis in tumor-resected bone

Patienten, die an Osteosarkom leiden werden derzeit mit intravenös applizierten krebstherapeutischen Mitteln nach Tumorresektion behandelt, was oftmals mit schweren Nebenwirkungen und einem verzögerten Knochenheilungsprozess einhergeht. Darüber hinaus treten vermehrt Rezidive aufgrund von verbleibenden neoplastischen Zellen an der Tumorresektionsstelle auf. Erfolgreiche Knochenregeneration und die Kontrolle von den im Gewebe verbleibenden Krebszellen stellt eine Herausforderung für das Tissue Engineering nach Knochenverlust durch Tumorentfernung dar. In dieser Hinsicht scheint der Einsatz von Hydroxyapatit als Knochenersatzmaterial in Kombination mit Cyclodextrin als Medikamententräger, vielversprechend. Chemotherapeutika können an Biomaterial gebunden und direkt am Tumorbett über einen längeren Zeitraum freigesetzt werden, um verbliebene neoplastische Zellen zu eliminieren. Lokal applizierte Chemotherapie hat diverse Vorteile, einschließlich der direkten zytotoxischen Auswirkung auf lokale Zellen, sowie die Reduzierung schwerer Nebenwirkungen. Diese Studie wurde durchgeführt, um die Funktionsfähigkeit eines solchen Arzneimittelabgabesystems zu bewerten und um Strategien im Bereich des Tissue Engineerings zu entwickeln, die den Knochenheilungsprozess und im speziellen die Vaskularisierung fördern sollen. Die Ergebnisse zeigen, dass nicht nur Krebszellen von der chemotherapeutischen Behandlung betroffen sind. Primäre Endothelzellen wie zum Beispiel HUVEC zeigten eine hohe Sensibilität Cisplatin und Doxorubicin gegenüber. Beide Medikamente lösten in HUVEC ein tumor-unterdrückendes Signal durch die Hochregulation von p53 und p21 aus. Zudem scheint Hypoxie einen krebstherapeutischen Einfluss zu haben, da die Behandlung sensitiver HUVEC mit Hypoxie die Zellen vor Zytotoxizität schützte. Der chemo-protektive Effekt schien deutlich weniger auf Krebszelllinien zu wirken. Diese Resultate könnten eine mögliche chemotherapeutische Strategie darstellen, um den Effekt eines zielgerichteten Medikamenteneinsatzes auf Krebszellen zu verbessern unter gleichzeitiger Schonung gesunder Zellen. Eine erfolgreiche Integration eines Systems, das Arzneimittel abgibt, kombiniert mit einem Biomaterial zur Stabilisierung und Regeneration, könnte gesunden Endothelzellen die Möglichkeit bieten zu proliferieren und Blutgefäße zu bilden, während verbleibende Krebszellen eliminiert werden. Da der Prozess der Knochengeweberemodellierung mit einer starken Beeinträchtigung der Lebensqualität des Patienten einhergeht, ist die Beschleunigung des postoperativen Heilungsprozesses eines der Ziele des Tissue Engineerings. Die Bildung von Blutgefäßen ist unabdingbar für eine erfolgreiche Integration eines Knochentransplantats in das Gewebe. Daher ist ein umfangreich ausgebildetes Blutgefäßsystem für einen verbesserten Heilungsprozess während der klinischen Anwendung wünschenswert. Frühere Experimente zeigen, dass sich die Anwendung von Ko-Kulturen aus humanen primären Osteoblasten (pOB) und humanen outgrowth endothelial cells (OEC) im Hinblick auf die Bildung stabiler gefäßähnlicher Strukturen in vitro, die auch effizient in das mikrovaskuläre System in vivo integriert werden konnten, als erfolgreich erweisen. Dieser Ansatz könnte genutzt werden, um prä-vaskularisierte Konstrukte herzustellen, die den Knochenheilungsprozess nach der Implantation fördern. Zusätzlich repräsentiert das Ko-Kultursystem ein exzellentes in vitro Model, um Faktoren, welche stark in den Prozess der Knochenheilung und Angiogenese eingebunden sind, zu identifizieren und zu analysieren. Es ist bekannt, dass Makrophagen eine maßgebliche Rolle in der inflammatorisch-induzierten Angiogenese spielen. In diesem Zusammenhang hebt diese Studie den positiven Einfluss THP-1 abgeleiteter Makrophagen in Ko-Kultur mit pOB und OEC hervor. Die Ergebnisse zeigten, dass die Anwendung von Makrophagen als inflammatorischer Stimulus im bereits etablierten Ko-Kultursystem zu einer pro-angiogenen Aktivierung der OEC führte, was in einer signifikant erhöhten Bildung blutgefäßähnlicher Strukturen in vitro resultierte. Außerdem zeigte die Analyse von Faktoren, die in der durch Entzündung hervorgerufenen Angiogenese eine wichtige Rolle spielen, eine deutliche Hochregulation von VEGF, inflammatorischer Zytokine und Adhäsionsmoleküle, die letztlich zu einer verstärkten Vaskularisierung beitragen. Diese Resultate werden dem Einfluss von Makrophagen zugeschrieben und könnten zukünftig im Tissue Engineering eingesetzt werden, um den Heilungsprozess zu beschleunigen und damit die klinische Situation von Patienten zu verbessern. Darüber hinaus könnte die Kombination der auf Ko-Kulturen basierenden Ansätze für das Knochen Tissue Engineering mit einem biomaterial-basierenden Arzneimittelabgabesystem zum klinischen Einsatz kommen, der die Eliminierung verbliebener Krebszellen mit der Förderung der Knochenregeneration verbindet.