Regulation der Stress-aktivierten Proteinkinasen durch den gentoxischen Benzo[a]pyren-Metaboliten BPDE

Polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAK) sind ubiquitäre Verschmutzungen der Umwelt und entstehen während der unvollständigen Verbrennung organischen Materials wie Holz, Kohle und Erdöl. Werden diese chemisch nicht reaktiven PAK in den Körper aufgenommen, durchlaufen sie eine Reihe von enzymatischen Umsetzungen, die unter der Bezeichnung Fremdstoffmetabolismus zusammengefasst werden. Die chemische Umsetzung des PAK und Prokarzinogens Benzo[a]pyren (B[a]P) führt u.a. zur Bildung des reaktiven Metaboliten B[a]P-7,8-dihydrodiol-9,10-epoxid (BPDE). BPDE ist stark elektrophil und kann auf Grund dieser Eigenschaft an nukleophile Makromoleküle wie Proteine und DNA binden. Die Bildung von BPDE-DNA-Addukten resultiert in der Entstehung von Mutationen und kann zur Tumorbildung führen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte die Wirkung von BPDE als Modellsubstanz für gentoxische Agenzien auf intrazelluläre Signalkaskaden und die Konsequenzen der BPDE-Exposition bezüglich der Zellaktivität untersucht werden. Es konnte gezeigt werden, dass BPDE-Behandlung von Mausfibroblasten eine intrazelluläre Signalkaskade induziert, welche zur Aktivierung der Stressaktivierten Proteinkinasen (SAPK) JNK und p38 führt. An dieser Signalkaskade sind Src-ähnliche Kinasen beteiligt. BPDE-Behandlung führt in den untersuchten Mausfibroblasten zur Induktion von DNA-Einzelstrangbrüchen, deren Auftreten zeitlich mit der SAPK-Aktivierung korreliert. Die BPDEinduzierten DNA-Strangbrüche sind die Folge der Entfernung dieser Läsionen aus dem Genom durch die Nukleotidexzisionsreparatur (NER). Erkannt werden BPDE-DNA-Addukte durch die NERProteine XPA und XPC (Xeroderma Pigmentosum Komplementationsgruppe A und C). Nach der Erkennung von BPDE-DNA-Addukten kommt es zur Rekrutierung von Nukleasen, welche die vorliegende Läsion und umliegende Nukleotide aus dem Genom entfernen. In XPA- und XPCdefizienten Mausfibroblasten induziert BPDE daher keine DNA-Strangbrüche. Jedoch ist nur in XPCdefizienten Zellen, aber nicht in XPA-defizienten Zellen, die SAPK-Aktivierung drastisch reduziert. Behandlung von Mausfibroblasten mit Benzo[c]phenanthren-3,4-Diol-1,2-Epoxid, einem PAK, dessen DNA-Addukte schlecht durch NER-Faktoren erkannt und repariert werden, führt zu keiner SAPKAktivierung. Die Aktivierung von p38 und JNK scheint demnach abhängig zu sein von der Erkennung des primären DNA-Schadens. Die XPC-abhängige SAPK-Aktivierung schützt die Zellen vor BPDEabhängiger Toxizität, da sowohl XPC- als auch p38-defiziente Mausfibroblasten eine höhere Sensitivität gegenüber BPDE zeigen als korrespondierende Wildtypzellen. Zusamenfassend konnte in dieser Arbeit ein neuer Signalweg beschrieben werden, in dem DNASchäden, verursacht durch BPDE, über die XPC-abhängige DNA-Schadenserkennung, die Aktivierung der SAPK induziert. Diese Aktivierung der SAPK schützt vor BPDE-induzierter Toxizität.

Struktur-Dynamik-Beziehungen in amorphen festen Lösungen

Feste Lösungen homogen dispergierter Wirkstoffmoleküle in amorphen Polymermatrizen sind wichtige Materialien in vielen pharmazeutischen Anwendungen, bei denen eine kontrollierte Abgabe wasserunlöslicher Wirkstoffe in wässrige Systeme eine Rolle spielt. Die intermolekulare Bindungs-stärke zwischen Polymer- und Wirkstoffmolekülgruppen bestimmt die Stabilität der festen Lösung und steuert somit die biologische Aktivität der Wirkstoffmoleküle. In festen Lösungen, die aus acryl-säurehaltigen Copolymeren (Protonendonoren) und basischen Wirkstoffmolekülen (Protonenakzepto-ren) hergestellt werden, sind intermolekulare Wasserstoffbrücken zwischen den Systemkomponenten Triebkraft für die Bildung einer stabilen homogenen Dispersion und für die Entstehung struktureller Merkmale zwischen den Molekülgruppen der Systemkomponenten. Zudem ist die Bindungsstärke der Wasserstoffbrücken im Hinblick auf die kontrollierte Abgabe der Wirkstoffe von Bedeutung. Da dynamische chemische Gleichgewichte bei der Bildung der Wasserstoffbrücken eine wichtige Rolle spielen müssen neben strukturellen Parametern auch dynamische Faktoren beleuchtet werden. Ziel dieser Arbeit ist neben der Ermittlung von intermolekularen Bindungsstärken vor allem die Identifika-tion struktureller Verhältnisse zwischen den Systemkomponenten auf molekularer Ebene. Die Be-stimmung der Abhängigkeit dieser Parameter von der Struktur der verwendeten Polymere und einer Vielzahl weiterer Einflüsse wie z.B. Feuchtigkeit, Lagerdauer oder Wirkstoffkonzentration soll ein kontrolliertes Design fester Lösungen mit definierten anwendungsspezifischen Eigenschaften ermögli-chen. Temperaturabhängige 1H-Festkörper-MAS-NMR (Magic Angle Spinning Nuclear Magnetic Resonance) Experimente an festen Lösungen mit unterschiedlichen Copolymer-Zusammensetzungen weisen die Existenz dynamischer chemischer Gleichgewichte in den komplexen Wasserstoffbrücken-netzwerken nach. Veränderungen in der chemischen Verschiebung und in der Linienform der Reso-nanzlinien acider Protonen erlauben einen tiefen Einblick in die Architektur dieser Netzwerke und legen die Bindungsverhältnisse unter Berücksichtigung der Polymerchemie und der Mobilität der Systemkomponenten dar, wobei die Befunde mithilfe quantenchemischer Rechnungen untermauert werden können. Die Gegenwart acider Protonen ermöglicht einen einfachen 1H-2H-Austausch, wor-aufhin mithilfe rotorsynchronisierter temperaturabhängiger 2H-MAS-NMR Experimente die Wasser-stoffbrückenbindungsstärke bestimmt werden kann. Mit 1H-1H-Korrelationsexperimenten (Doppelquantenspektroskopie) stehen Methoden für die Bestimmung homonuklearer dipolarer 1H-1H-Kopplungen zur Verfügung, die strukturelle Aussagen aufgrund von bevorzugten räumlichen Kontak-ten bestimmter Molekülgruppen ermöglichen. Weiterhin können diese Experimente verwendet werden, um Wasserstoffbrücken zwischen Polymergruppen von Polymer-Wirkstoff-Wasserstoffbrücken zu unterscheiden, wodurch eine quantitative Beschreibung des Bindungsnetzwerks und der Konkurrenz-prozesse zwischen den einzelnen wasserstoffverbrückten Spezies ermöglicht wird. Eine Kristallisation der Wirkstoffmoleküle ist in vielen Anwendungen unerwünscht, da sie die biologische Verfügbarkeit des Wirkstoffs reduzieren. Mit 1H-Festkörper-MAS-NMR Experimenten können kristalline von amorph dispergierten Wirkstoffmolekülen unterschieden werden, wodurch eine Quantifizierung der Destabilisierungsprozesse ermöglicht wird, die durch Exposition der festen Lösungen mit Wasserdampf ausgelöst werden können. Die Zeit- und Konzentrationsabhängigkeit der Wasseraufnahme kann mit NMR-Experimenten verfolgt werden, wobei unterschiedlich mobile Was-serspezies an unterschiedlichen Bindungsorten identifiziert werden können, was zum molekularen Verständnis der Destabilisierungsprozesse beiträgt. Zusätzlich wird die Mobilität der Wirkstoffmole-küle bestimmt, die sich – wie auch die Wirkstoffkonzentration - als wichtige Größe in der Beschrei-bung der Destabilisierung erweist. Aufbauend auf den Beobachtungen wird ein Zusammenhang zwischen der Copolymerzusammensetzung und einer kritischen Wirkstoffkonzentration hergestellt, der für die Anwendungen amorpher fester Lösungen in biologischen Systemen von großer Bedeutung ist.

Identifizierung von Hexosecarriern und Regulation des Phosphoketolasewegs in Oenococcus oeni

Oenococcus oeni ist ein heterofermentatives Milchsäurebakterium, das Hexosen über den Phosphoketolaseweg zu Lactat, Acetyl-P und CO2 umsetzt. In Anhängigkeit von der C-Quelle werden Ethanol, Acetat, Mannit und geringe Mengen an Erythrit gebildet. Im Genom von O. oeni PSU-1 wurden neun Gene für sekundäre Carrier identifiziert, die aufgrund ihrer Sequenz und Lage im Genom als Kandidaten für Hexosecarrier in Frage kommen. In Stamm O. oeni B1 wurde die Expression der Gene OEOE_0819 und OEOE_1574 stark durch Glucose induziert. Die Gene konnten jedoch Hexosetransport-Defektmutanten von E. coli nicht komplementieren. Die deutliche Induktion der Gene deutet auf ihre Funktion im Hexosetransport hin. Bei den Carriern 819 und 1574 handelt es sich vermutlich um früher identifizierte Δp-getriebene sekundäre Hexosetransporter. Die Expression der Kandidaten zeigte teilweise Unterschiede bei verschiedenen O. oeni Stämmen. Auch die Funktion von Phosphotransferasesystemen bei der Aufnahme von Hexosen wurde durch Expressionsmessungen untersucht. Einige Systeme weisen Ähnlichkeit zu Glucose- und Fructose-transportierenden Systemen auf und kommen als Aufnahmesysteme für Hexosen in Frage. Das Phosphotransferasesystem OEOE_0464-0466 wird besonders durch Fructose induziert. O. oeni bildet in Abhängigkeit von der C-Quelle unterschiedliche Wege zur Reoxidation des im zentralen Phosphoketolaseweg entstandenen NAD(P)H aus. Die Regulation des Zentralstoffwechsels und des peripheren Stoffwechsels wurde durch Bestimmung der relativen Genexpression und durch Proteomanalysen untersucht. Die Anwesenheit von Citrat und Pyruvat ändert die Expression der Gene deutlich. Bei Zucht mit Ribose, Glucose oder Fructose jedoch bleibt die der meisten Gene konstant. Am stärksten wird der Ethanolweg reguliert, der hauptsächlich nach Zucht mit Glucose zur Reoxidation des NAD(P)H genutzt wird. Die Expression des adhE-Gens der Acetaldehyd- und Alkohol-Dehydrogenase nimmt bei Zucht auf anderen C-Quellen stark ab. Pyruvat ist ein zentrales Intermediat des Energiestoffwechsels und Ausgangsprodukt für Reaktionen des Bausstoffwechsels. Die Expression einiger Pyruvat-liefernder und Pyruvat-verbrauchender Reaktionen wurde bestimmt, um so die Entstehung und den Verbrauch des Pyruvats abhängig von der Stoffwechselsituation beurteilen zu können.

Objektive Schläfrigkeitsmessung unter Alkoholeinfluss

Alkohol und Schläfrigkeit sind die wichtigsten fahrerbezogenen Faktoren bei der Entstehung von Autounfällen. Bislang gibt es relativ wenige konkrete Erkenntnisse über die schläfrigkeitsfördernde Wirkung von Alkohol. Mit der vorliegenden Arbeit sollte erstmals eine quantitative und objektive Analyse der (Tages-)Schläfrigkeit unter Alkoholeinfluss während der gesamten Alkoholumsetzungskurve erstellt werden. Mit dem pupillographischen Schläfrigkeitstest (PST) steht ein Verfahren zur Verfügung, mit dem es möglich ist, Schläfrigkeit unter Alkoholeinfluss quantitativ zu bestimmen. Diese Methode beruht auf der Vermessung der Pupille, deren Durchmesser der efferenten sympathischen Steuerung unterliegt. Bei zunehmender Schläfrigkeit lässt der sympathische Einfluss auf die Pupillenweite nach und es kommt zu typischen Oszillationen der Pupille. Diese Oszillationen, sogenannte „Fatigue Waves“, werden in einem ruhigen, abgedunkelten Raum mittels Infrarotkamera über 11 Minuten kontinuierlich aufgezeichnet und als Pupillen-Unruhe-Index (PUI) in mm / min ausgegeben. Für diesen Wert existieren Normwerte, welche eine Einteilung der PUI-Werte in „normal“, „erhöht“ und „pathologisch“ ermöglichen. Es wurde ein standardisiertes Kollektiv von 53 Probanden zwischen 20 und 60 Jahren untersucht. Dieses bestand aus 28 Männern und 25 Frauen. Die Probanden wurden wahlweise mit Bier oder Wein stufenweise unter Blutalkohohol-konzentrationen von annähernd 0,3, 0,5 und 0,8 ‰ gesetzt, die genaue BAK wurde jeweils durch Gaschromatographie und ADH-Methode bestimmt. Während dieser Anflutungsphase wurde bei jeder der drei Stufen die Schläfrigkeit bestimmt. Dies geschah zum einen mittels objektivem PST und zum anderen durch die subjektive Stanford Sleepiness Scale (SSS), eine siebenstufige Skala zur Einschätzung der eigenen Schläfrigkeit. In der Eliminationsphase der Alkoholumsetzungskurve wurde wiederum bei 0,5 und 0,3 ‰ sowohl die subjektive als auch die objektive Schläfrigkeit gemessen. Eine Kontrollgruppe von 11 Probanden aus dem genannten Kollektiv wurde zu einem späteren Zeitpunkt unter gleichen Bedingungen ohne Alkoholeinfluss untersucht. Im Ergebnis zeigte die Anflutungsphase zunächst ein signifikantes Absinken des PUI um 5,9 %, gleichbedeutend mit einer höheren Vigilanz. Im weiteren Verlauf war das Maximum der Schläfrigkeit in der Eliminationsphase bei einer verhältnismäßig geringen BAK von durchschnittlich 0,54 ‰ zu beobachten. Der PUI hatte sich im Vergleich zum Ausgangswert um durchschnittlich 17,4 % erhöht und 40,4 % der Probanden wiesen erhöhte oder pathologische Schläfrigkeitswerte auf. Dieser Anteil lag um hochsignifikante 110 % höher als bei der Ausgangsmessung. Insgesamt ließ sich keine Korrelation zwischen objektiver und subjektiver Schläfrigkeit feststellen, obwohl auch die subjektive Schläfrigkeit stieg. Das Maximum der subjektiven Schläfrigkeit fiel zusammen mit dem Maximum der Alkoholisierung von 0,8 ‰. Wirkung auf das Ausmaß der Schläfrigkeit hatten die Häufigkeit des Alkoholkonsums, der Body-Mass-Index (BMI) und das Geschlecht. Je häufiger die Probanden nach eigenen Angaben Alkohol tranken und je höher der jeweilige BMI war, desto geringer war der Einfluss des Alkohols auf die Schläfrigkeit. Mit der Eigenschaft „weibliches Geschlecht“ ging eine höhere objektive Schläfrigkeit einher, allerdings auch eine höhere subjektive Einschätzung der eigenen Schläfrigkeit. Ein Einfluss der Getränkeart ließ sich hingegen nicht nachweisen. Für die Abnahme der Vigilanz spielte es keine Rolle, ob dies durch Bier oder Wein verursacht worden war. Bedenklich erschien die Tatsache, dass zum einen die Probanden das Ausmaß der eigenen Schläfrigkeit sogar unter relativ geringer Alkoholisierung nicht adäquat einschätzen konnten, und dass zum anderen das Maximum der Schläfrigkeit – und damit auch des mutmaßlichen Unfallrisikos – in der Eliminationsphase lag. Ein Zeitpunkt, zu dem sicherlich die meisten Alkoholfahrten unternommen werden.

Einfluss von oxidativem Stress auf die DNA-Reparatur in Säugerzellen

Gegenstand dieser Arbeit war es, das Zusammenspiel zwischen DNA-Reparatur und zellulärem anitoxidativen Abwehrsystem in Melanomzellen und gesunden Hautfibroblasten näher zu untersuchen. Dabei konnte gezeigt werden, dass die dominierenden DNA-Läsionen im Falle einer Bestrahlung mit sichtbarem Licht (400 – 800 nm) Fpg-sensitive Läsionen, zu denen die Basenmodifikation 7,8-Dihydro-8-oxoguanin (8-oxoG) gehört, und im Falle der UVA-Bestrahlung Cyclobutan-Pyrimidindimere (CPDs) sind. Sowohl Melanomzellen als auch Hautfibroblasten waren problemlos in der Lage, die durch sichtbares Licht und UVA-Strahlung induzierten oxidativen DNA-Modifikationen zu reparieren. Jedoch reagierten Melanomzellen in einer adaptiven Antwort mit einer Erhöhung ihres Glutathion-Gehalts auf ein Maximum (nach circa 10 - 14 h) nach Bestrahlung mit sichtbarem Licht, wohingegen die Hautfibroblasten einen massiven Einbruch direkt nach Bestrahlung und eine extrem lange Erholungsphase über 48 h aufzuweisen hatten. Die darauffolgende Untersuchung der DNA-Reparaturkapazität der Zellen unter Bedingungen von oxidativem Stress mit vorangegangener Depletion intrazellulären Glutathions zeigten eine dramatische, nahezu vollständige Hemmung der Reparatur durch UVA- bzw. Sonnenlicht-induzierter Fpg-sensitiver DNA-Modifikationen (8-oxoG) - sowohl in Melanomzellen als auch in Hautfibroblasten. Dieser Effekt ließ sich durch den Zusatz von Dithiothreitol (DTT), nach erfolgter Bestrahlung der Glutathion-depletierten Zellen, wieder komplett revertieren. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass an der Reparatur ein redoxempfindliches Protein oder zellulärer Cofaktor beteiligt sein muß. Zudem konnte durch Untersuchungen der Nukleotidexzisionsreparatur (NER) und der Einzelstrangbruchreparatur nach dem gleichen Versuchsdesign gezeigt werden, dass es sich hierbei sehr wahrscheinlich um einen für die Basenexzisionsreparatur (BER) von 7,8-dihydro-8-oxo-guanine (8-oxoG) exklusiven Effekt handelte. Zwei der wichtigsten Reparaturproteine der BER, nämlich hOGG1 und APE1, wurden anschließend auf ihre Funktionsfähigkeit hin untersucht, da es naheliegend war, dass der Reparaturhemmung ein Funktionsverlust eines dieser beiden Enzyme zugrunde liegen könnte. Im Falle des APE1-Proteins konnte dies ausgeschlossen werden, da mit Hilfe der Alkalischen Elution die volle Funktionsfähigkeit für die Reparatur von AP-Läsionen nachgewiesen werden konnte. Interessanterweise zeigte aber das hOGG1-Protein eine zwischen der dritten und vierten Stunde nach Bestrahlung Glutathion-depletierter Zellen stark abfallende Aktivität der 8-oxoG-Glykosylasefunktion. Die Western-Blot-Analyse ergab allerdings keinen Hinweis auf eine Proteinoxidation von hOGG1. Möglicherweise wird nicht hOGG1 selbst, wohl aber ein anderes, für eine konzertierte Abfolge der einzelnen Reparaturschritte entscheidend notwendiges Protein innerhalb der Zelle durch ROS leicht oxidiert. In jedem Fall bleibt festzustellen, dass Glutathion eine wichtige Aufgabe hinsichtlich einer voll funktionsfähigen Basenexzisionreparatur zuzukommen scheint. Die Ergebnisse unterstreichen die mögliche Bedeutung von oxidativem Stress für die Entstehung von Krebs durch Sonnenlicht, insbesondere durch UVA, da die durch die Strahlung (und eventuell auftretende Entzündung) gebildeten ROS nicht nur DNA-Schäden induzieren, sondern auch ihre Reparatur verhindern können.

Der Einfluss der Zellalterung auf die pathobiochemischen Prozesse von Morbus Alzheimer und weiteren neurodegenerativen Erkrankungen

Die am häufigsten auftretende altersassoziierte neurodegenerative Krankheit ist die Alzheimer Demenz. Ein mit entscheidender Schritt bei der Entstehung der Alzheimer Erkrankung ist wahrscheinlich die Produktion des Aβ-Peptids durch proteolytische Spaltung das Amyloid-Vorläuferproteins APP. In der vorliegenden Arbeit wurde die altersabhängige Prozessierung des Amyloid-Vorläuferproteins (APP) in Fibroblasten von Hautbiopsien von Familiärer Alzheimer-, Trisomie21 und Niemann-Pick Typ C-Krankheit untersucht. Die in dieser Arbeit verwendeten Fibroblasten wurden bis zum Erreichen des zellulären Wachstumsstopps (replikative Seneszenz) seriell passagiert und die Untersuchungen erfolgten an Zellen aufsteigender PDL. Dabei zeigte sich, dass, unabhängig von dem durch die Krankheit vorliegenden genetischen biochemischen Hintergrund, die APP-Prozessierung im Laufe der Zellalterung progressiv verringert wird. Die altersabhängig ansteigenden Cholesterinspiegel führten zu einer Reduktion der APP-Reifung und infolge dessen nahmen sowohl die intrazellulären APP-Spaltfragmente (C99, C83 und AICD) als auch die extrazellulären APP-Fragmente (sAPPα, sAPP) ab. Ebenso konnte gezeigt werden, dass die γ-Sekretase-Aktivität abnimmt. Dies war verbunden mit einem Rückgang der Proteinspiegel von Nicastrin und Presenilin, beides Komponenten des γ-Sekretase-Komplexes. Obwohl die Proteinexpression der α-Sekretase ADAM10 altersassoziiert konstant blieb, nahm die α-Sekretase-Aktivität mit steigendem Lebensalter ab. Erste Untersuchungen zeigten, dass die NAD+-abhängige Histon-Deacetylase SIRT1 eine wichtige Rolle im Bezug auf die α-Sekretase-Aktivität spielen könnte. Im Gegensatz zu den Abnahmen der α- und γ-Sekretase-Aktivitäten konnte eine erhöhte Aktivität der β-Sekretase in seneszenten Zellen beobachtet werden. Die mRNA-Menge und Proteinspiegel der ß-Sekretase BACE1 blieben dabei unverändert. Des Weiteren zeigte sich eine Zunahme der β-Sekretase-Aktivität bei Behandlung von jungen Zellen mit konditioniertem Medium seneszenter Zellen. Da sensezente Zellen einem Proliferationsstopp in der G1-Phase unterliegen, wurde der Einfluss des Zellzyklus-Inhibitors Aphidicolin auf die β-Sekretase untersucht. Hier wurde sowohl in IMR90 Fibroblasten als auch in Neuroblastoma-Zellen N2a eine Zunahme der β-Sekretase-Aktivität nach Zugabe der Inhibitoren beobachtet. Auch kommt es im Zuge der Alterung zu einer verstärkten Expression inflammatorischer Zytokine, die mit der Entstehung von Aβ-Peptiden in Verbindung gebracht werden. Deshalb wurde der Einfluss von Zytokinen auf die β-Sekretase-Aktivität untersucht. Die Zugabe von Interferon-γ und Interleukin 6 führte bei jungen IMR90-Zellen zu einem Anstieg der β-Sekretase-Aktivität, während bei alten Zellen keine Änderung zu verzeichnen war.

Humane CD4 + CD25 + regulatorische T-Zellen: Charakterisierung von Subpopulationen und Identifizierung eines Markers

CD4+CD25+ regulatorische T-Zellen (CD4+CD25+ Tregs) sind essentiell an der Homöostase des Immunsystems beteiligt, indem sie eine antigenspezifische Toleranzinduktion in der Peripherie vermitteln und vor der Entstehung von Autoimmunerkrankungen schützen. Darüber hinaus sind diese Zellen wesentlich an der Kontrolle von Allergien, Infektionen und Tumoren beteiligt. Innerhalb dieser Arbeit konnten zwei bisher unbekannte Subpopulationen humaner CD4+CD25+ Tregs, isoliert aus dem peripheren Blut des Menschen, nachgewiesen werden. Diese Subpopulationen unterscheiden sich in ihrer Oberflächenexpression und exprimieren die Integrine a4b1 bzw. a4b7. Beide Treg-Subpopulationen supprimieren kokultivierte CD4+ T-Helferzellen Zellkontakt-abhängig und konvertieren gleichzeitig einen Teil dieser Zellen in sekundäre Suppressorzellen (iTregs). a4b1+ Tregs induzieren TGF-β-sezernierende iTregs, a4b7+ Tregs führen zur Bildung von IL-10-produzierenden iTregs. Differentielle Proteomanalysen humaner CD4+CD25+ Tregs, im Vergleich zu CD4+CD25- T-Helferzellen, führten zur Identifizierung von Galectin-10 als Markerprotein, das fast ausschließlich von CD4+CD25+ Tregs und nicht von CD4+ T-Helferzellen exprimiert wird. Galectin-10 ist ein intrazelluläres Protein, das essentiell für die funktionellen Eigenschaften humaner CD4+CD25+ Tregs ist. Die Blockade der Galectin-10-Bildung in den CD4+CD25+ Tregs durch RNA-Interferenz führte zu wesentlichen funktionellen Veränderungen der CD4+CD25+ Tregs. In Abwesenheit von Galectin-10 verlieren humane CD4+CD25+ Tregs ihre suppressiven Eigenschaften und ihren anergischen Phänotyp. Somit konnte mit Galectin-10 erstmals ein spezifischer Marker für humane CD4+CD25+ Tregs identifiziert werden, der wesentlich für den funktionellen Phänotyp dieser Regulatoren peripherer T-Zelltoleranz ist.

Elektrophysiologische, molekularbiologische und verhaltensbiologische Untersuchungen zur Funktion von N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptoren bei Gehirnentwicklung und Lernvorgängen

Im Zentralnervensystem der Säuger steuern N-Methyl-D-Aspartat-(NMDA)-Rezeptoren viele neuronale Prozesse, insbesondere während der Ontogenese sowie bei Lern- und Gedächtnisvorgängen. In der vorliegenden Arbeit wurde die Bedeutung dieser Rezeptoren während der Kortexentwicklung und bei Lernvorgängen mittels elektrophysiologischer, molekularbiologischer, pharmakologischer, histologischer, genetischer und verhaltensbiologischer Methoden an der Maus untersucht. Oszillatorische Netzwerkaktivität ist für die gesunde Entwicklung des Kortex essentiell. Mittels gepaarter patch-clamp Experimente an neonatalen Subplattenzellen wurde festgestellt, dass diese Neurone elektrisch gekoppelt sind. Damit könnten sie einen wichtigen Beitrag zur Entstehung bzw. Verstärkung von Netzwerkoszillationen leisten. Subplattenzellen erhalten afferenten Eingang aus dem Thalamus sowie von benachbarten Subplattenzellen. Die funktionellen und molekularen Eigenschaften dieser Synapsen differierten in eingangsspezifischer Weise. Subplatteninterne Verbindungen besaßen Integrations- und Summationsfähigkeiten, wenig synaptische Ermüdung, Paarpulsfazilitierung und einen erhöhten NR2D-Anteil in ihren NMDA-Rezeptoren. CA1-Pyramidenzellen des adulten Hippocampus zeigten eine den Subplattenzellen vergleichbare eingangsspezifische Verteilung der NMDA-Rezeptor-Untereinheiten. Synapsen von Schaffer-Kollateralen besaßen einen höheren NR2B-Anteil als temporo-ammonische Verbindungen. Die Aktivierung von Dopamin-Rezeptoren potenzierte NR2B-vermittelte synaptische Ströme in CA1-Neuronen. Bei komplexen Lernvorgängen, wie der Extinktion einer traumatischen Erinnerung, spielten NMDA-Rezeptoren von hippocampalen CA1-Zellen eine entscheidende Rolle. CA1-NMDA-Rezeptor-ko-Mäuse zeigten erhebliche Extinktionsdefizite nach Angstkonditionierung. Zudem entwickelten diese Mäuse erhöhte Ängstlichkeit und Hyperaktivität. Das sind beim Menschen Symptome für psychiatrische Angststörungen. Daher könnten CA1-NMDA-Rezeptor-ko-Mäuse als neues Tiermodell für solche Störungen dienen, die durch ein traumatisches Erlebnis ausgelöst werden, wie beim Posttraumatischen Stresssyndrom (PTSD).

Deciphering petrological signatures of reactive melt stagnation and cooling in the oceanic mantle underneath ultraslow-spreading ridges

The global mid-ocean ridge system creates oceanic crust and lithosphere that covers more than two-thirds of the Earth. Basalts are volumetrically the most important rock type sampled at mid-ocean ridges. For this reason, our present understanding of upper mantle dynamics and the chemical evolution of the earth is strongly influenced by the study of mid-ocean ridge basalts (MORB). However, MORB are aggregates of polybarically generated small melt increments that can undergo a variety of physical and chemical processes during their ascent and consequently affect their derivative geochemical composition. Therefore, MORB do not represent “direct” windows to the underlying upper mantle. Abyssal peridotites, upper mantle rocks recovered from the ocean floor, are the residual complement to MORB melting and provide essential information on melt extraction from the upper mantle. In this study, abyssal peridotites are examined to address these overarching questions posed by previous studies of MORB: How are basaltic melts formed in the mantle, how are they extracted from the mantle and what physical and chemical processes control mantle melting? The number of studies on abyssal peridotites is small compared to those on basalts, in part because seafloor exposures of abyssal peridotites are relatively rare. For this reason, abyssal peridotite characteristics need to be considered in the context of subaerially exposed peridotites associated with ophiolites, orogenic peridotite bodies and basalt-hosted xenoliths. However, orogenic peridotite bodies are mainly associated with passive continental margins, most ophiolites are formed in supra-subduction zone settings, and peridotite xenoliths are often contaminated by their host magma. Therefore, studies of abyssal peridotites are essential to understanding the primary characteristics of the oceanic upper mantle free from the influence of continental rifting, subduction and tectonic emplacement processes. Nevertheless, numerous processes such as melt stagnation and cooling-induced, inter-mineral exchange can affect residual abyssal peridotite compositions after the cessation of melting. The aim of this study is to address these post-melting modifications of abyssal peridotites from a petrological-geochemical perspective. The samples in this study were dredged along the axis of the ultraslow-spreading Gakkel Ridge in the Arctic Ocean within the “Sparsely Magmatic Zone”, a 100 km ridge section where only mantle rocks are exposed. During two expeditions (ARK XVII-2 in 2001 and ARK XX-2 in 2004), exceptionally fresh peridotites were recovered. The boulders and cobbles collected cover a range of mantle rock compositions, with most characterized as plagioclase-free spinel peridotites or plagioclase- spinel peridotites. This thesis investigates melt stagnation and cooling processes in the upper mantle and is divided into two parts. The first part focuses on processes in the stability field of spinel peridotites (>10 kb) such as melt refertilization and cooling related trace element exchange, while the second part investigates processes in the stability field of plagioclase peridotites (< 10 kb) such as reactive melt migration and melt stagnation. The dissertation chapters are organized to follow the theoretical ascent of a mantle parcel upwelling beneath the location where the samples were collected.

Comparative genomics and phylogenetics of the vertebrate CYP3 family

CYP3A verstoffwechselt mehr als 50% aller gegenwärtig in der Therapie eingesetzten Wirkstoffe, die häufig an klinisch relevanten Arzneimitttel-Wechselwirkungen beteiligt sind. Das Verständnis über die Bedeutung und die Regulation von einzelnen CYP3A Genen in der Pharmakologie und Physiologie ist unvollständig. Wir untersuchten die Evolution des CYP3 Genlokus über einen Zeitraum von 450 Millionen Jahre mittels genomischer Sequenzen von 16 Tierarten. Neue CYP3 Unterfamilien (CYP3B, C und D) entstanden über eine beschleunigte Evolution aus CYP3A Vorstufen von Clupeocephala Spezies. Ausgeprägte funktionelle Unterschiede traten zwischen CYP3A in Säugern und Clupeocephala CYP3 auf. Alle amnioten CYP3A Gene entwickelten sich aus zwei CYP3A Urgenen. Aufgrund der Entstehung von Säugern mit Plazenta ging eines von ihnen verloren während das andere eine neue genomische Umgebung infolge einer Translokation erlangte. In Primaten unterzog sich CYP3A mit mehreren Genduplikationen, Deletionen, Pseudogenisierung und Genkonversionen einer raschen evolutionären Veränderung. Die Entwicklung von CYP3A in Schmalnasenaffen (Alte Welt Affen, große Menschenaffen und Menschen) unterschieden sich wesentlich von Neue Welt Primaten (z.B. gewöhnlichen Krallenaffen) und Feuchtnasenaffen (z.B. Galago). Stellvertretend für die CYP3A Protein-codierende Sequenz entdeckten wir zwei frühe Episoden von besonders starker positiver Selektion: (1) auf CYP3A7 in der frühen hominoiden Evolution, welche im fetalen Zeitraum von einer Einschränkung der hepatischen Expression begleitet war, und (2) auf humanes CYP3A4 im Anschluss an die Teilung der Abstammungslinie in Schimpansen und Mensch. In Übereinstimmung mit diesen Befunden beeinflussen drei von vier positiv ausgewählten Aminosäuren, die in früheren biochemischen CYP3A Studien untersucht wurden, die Aktivität und Regioselektivität. Es ist somit naheliegend, dass CYP3A7 und CYP3A4 katalytische Funktionen erworben haben können, die besonders wichtig waren für die Evolution von Hominoiden und Menschen. Die Charakterisierung von CYP3A Promotoren in Primaten zeigte eine Anreicherung von ER6 Elementen in CYP3A Promotoren von Primaten und einen Trend in Richtung Erhöhung der ER6 Enstehung entlang den Abstammungslinien, die zu humanen und Schimpansen CYP3A4 führten. Die steigende Anzahl an ER6 Elementen kann durch die ausgeprägte CYP3A4 Induzierbarkeit und Expressionsvariabilität im Menschen verursacht sein.

Untersuchungen des Keratinfilament-Turnovers in lebenden Zellen

Das Zytoskelett eukaryotischer Zellen besteht aus drei verschiedenen Protein-Netzwerken: den Aktinfilamenten, Mikrotubuli und Intermediärfilamenten. Intermediärfilamente wurden ursprünglich als statische Strukturen angesehen, die die mechanische Stabilisierung der Zellen übernehmen. In den letzten Jahren hat sich dieses Bild jedoch geändert: Intermediärfilament-Netzwerke sind hochdynamisch und unterliegen kontinuierlichen Veränderungen, welche durch Phosphorylierungen reguliert werden. Sie interagieren mit anderen Zytoskelett-Proteinen und greifen in die Regulation von Schlüsselsignalwegen, die Zellwachstum und Zellteilung sowie Apoptose und Stressantwort bestimmen, ein. Die Mechanismen der Filamentplastizität konnten bisher jedoch nicht vollständig aufgeklärt werden. So ist beispielsweise unklar, wo Auf- und Abbau der Filamente stattfindet und welche Faktoren an der Netzwerkmodulation beteiligt sind. Ziel meiner Arbeit war es, einen Beitrag zur Aufklärung dieser Mechanismen am Beispiel der epithelialen Keratin-Intermediärfilamente zu leisten. Mit Hilfe von mikroskopischen Zeitrafferaufnahmen von fluoreszenzmarkierten Zellklonen wurden Nukleationszentren in der Zellperipherie identifiziert, in denen Keratinfilamentvorläufer gebildet werden. Es handelt sich dabei um fokale Adhäsionskomplexe, die als Anheftungsstellen zwischen der extrazellulären Matrix und dem intrazellulären Aktinfilament-System dienen. Es konnte gezeigt werden, dass diese Filamentvorläufer-Entstehung für alle untersuchten Keratinisoformen gültig ist und in epitelialen als auch nicht-epithelialen Zelltypen abläuft. Knock-Down der Adhäsionskomponente Talin verhinderte die Keratinfilamentbildung. Modulation der fokalen Adhäsionskinase, die den Auf- und Abbau der Adhäsionskomplexe koordiniert, beeinflusste ebenso die Bildung der Keratinfilamentnetzwerke. Es konnte weiterhin beobachtet werden, dass die N-terminalen Isoformen IE und IF des Zytolinkers Plectin in fokalen Adhäsionen lokalisieren und damit möglicherweise an der Vernetzung von Keratinfilamentvorläufern, Zelladhäsionen und Aktinfilamenten beteiligt sind. Letztlich stellte sich heraus, dass die Bildung der Keratinfilamentvorläufer unabhängig von Proteintranslation ist. In den mikroskopischen Zeitrafferaufnahmen wurde im Anschluss an die Keratinfilamentbildung ein kontinuierlicher zentripetaler Transport der wachsenden Vorläuferpartikel beobachtet. An Hand von pharmakologischen Experimenten konnte gezeigt werden, dass dieser Transport Aktinfilament-abhängig ist. Zeitgleich kommt es zu Partikelfusion und Integration in das periphere Netzwerk, das sich weiterhin in Richtung auf das Zellzentrum bewegt. Mit Hilfe von Photoaktivierungsversuchen und Zellfusionsexperimenten konnte die Hypothese bestätigt werden, dass der Abbau der einwandernden Keratinfilamente in lösliche, rasch diffusible Zwischenstufen den kontinuierlichen peripheren Neuaufbau ermöglicht. Aus den Beobachtungen und bereits bekannten Ergebnissen wurde ein Modell des Keratin-Zyklus entwickelt, das die folgenden Stadien umfasst: Nukleation von Keratinfilamentvorläufern an fokalen Adhäsionen in der Zellperipherie, Elongation und Fusion der Keratinfilamentvorläufer bei zeitgleichem Aktinfilament-abhängigem zentripetalen Transport, Integration der Keratinfilamentvorläufer in das periphere Netzwerk, Bündelung der Filamente, Filamentabbau in lösliche Untereinheiten und Neubeginn des Zyklus in der Zellperipherie. Eine Störung dieses Zyklus liegt bei mutierten Keratinen vor, welche die Ursache von Blasen-bildenden Hauterkrankungen sind. In der vorliegenden Arbeit wurde am Beispiel von Keratin 6a-Mutanten, welche die Hauterkrankung Pachyonychia congenita verursachen, gezeigt, dass bei diesen Keratinen die Nukleation zwar im Bereich der Adhäsionskomplexe regelrecht abläuft, die anschließende Elongation und Netzwerkbildung aber gestört ist, so dass statt dessen kurzlebige, hyperphosphorylierte Granula entstehen. Der resultierende frustrane Keratin-Zyklus in der Zellperipherie ist stark beschleunigt und kann durch p38-Inhibierung gestoppt werden. Bei Proteasomeninhibierung wird der Zyklus in Richtung der Granulabildung verschoben. In dieser Arbeit wird erstmals das Keratin-Tretmühlen-Modell vorgestellt, das den regulierbaren Auf- und Abbau-Zyklus des Keratinnetzwerks beschreibt. Damit liegen testbare Hypothesen für die Aufklärung der Keratinfilament-Plastizität in physiologischen und pathologischen Situationen vor, die nach unseren ersten Ergebnissen auch von Relevanz für andere Intermediärfilamenttypen sind.

Petrogenetic evolution of Uralian-Alaskan-type mafic-ultramafic complexes in the southern and middle Urals, Russia

The PhD thesis at hand consists of three parts and describes the petrogenetic evolution of Uralian-Alaskan-type mafic ultramafic complexes in the Ural Mountains, Russia. Uralian-Alaskan-type mafic-ultramafic complexes are recognized as a distinct class of intrusions. Characteristic petrologic features are the concentric zonation of a central dunite body grading outward into wehrlite, clinopyroxenite and gabbro, the absence of orthopyroxene and frequently occurring platinum group element (PGE) mineralization. In addition, the presence of ferric iron-rich spinel discriminates Uralian-Alaskan-type complexes from most other mafic ultramafic rock assemblages. The studied Uralian-Alaskan-type complexes (Nizhnii Tagil, Kytlym and Svetley Bor) belong to the southern part of a 900 km long, N–S-trending chain of similar intrusions between the Main Uralian Fault to the west and the Serov-Mauk Fault to the east. The first chapter of this thesis studies the evolution of the ultramafic rocks tracing the compositional variations of rock forming and accessory minerals. The comparison of the chemical composition of olivine, clinopyroxene and chromian spinel from the Urals with data from other localities indicates that they are unique intrusions having a characteristic spinel and clinopyroxene chemistry. Laser ablation-ICPMS (LA-ICPMS ) analyses of trace element concentrations in clinopyroxene are used to calculate the composition of their parental melt which is characterized by enriched LREE (0.5-5.2 prim. mantle) and other highly incompatible elements (U, Th, Ba, Rb) relative to the HREE (0.25-2.0 prim. mantle). A subduction-related geotectonic setting is indicated by a positive anomaly for Sr and negative anomalies for Ti, Zr and Hf. The mineral compositions monitor the evolution of the parental magmas and decipher differences between the studied complexes. In addition, the observed variation in LREE/HREE (for example La/Lu = 2-24) can be best explained with the model of an episodically replenished and erupted open magma chamber system with the extensive fractionation of olivine, spinel and clinopyroxene. The data also show that ankaramites in a subduction-related geotectonic setting could represent parental magmas of Uralian-Alaskan-type complexes. The second chapter of the thesis discusses the chemical variation of major and trace elements in rock-forming minerals of the mafic rocks. Electron microprobe and LA-ICPMS analyses are used to quantitatively describe the petrogenetic relationship between the different gabbroic lithologies and their genetic link to the ultramafic rocks. The composition of clinopyroxene identifies the presence of melts with different trace element abundances on the scale of a thin section and suggests the presence of open system crustal magma chambers. Even on a regional scale the large variation of trace element concentrations and ratios in clinopyroxene (e.g. La/Lu = 3-55) is best explained by the interaction of at least two fundamentally different magma types at various stages of fractionation. This requires the existence of a complex magma chamber system fed with multiple pulses of magmas from at least two different coeval sources in a subduction-related environment. One source produces silica saturated Island arc tholeiitic melts. The second source produces silica undersaturated, ultra-calcic, alkaline melts. Taken these data collectively, the mixing of the two different parental magmas is the dominant petrogenetic process explaining the observed chemical variations. The results further imply that this is an intrinsic feature of Uralian-Alaskan-type complexes and probably of many similar mafic-ultramafic complexes world-wide. In the third chapter of this thesis the major element composition of homogeneous and exsolved spinel is used as a petrogenetic indicator. Homogeneous chromian spinel in dunites and wehrlites monitors the fractionation during the early stages of the magma chamber and the onset of clinopyroxene fractionation as well as the reaction of spinel with interstitial liquid. Exsolved spinel is present in mafic and ultramafic rocks from all three studied complexes. Its composition lies along a solvus curve which defines an equilibrium temperature of 600°C, given that spinel coexists with olivine. This temperature is considered to be close to the temperature of the host rocks into which the studied Uralian-Alaskan-type complexes intruded. The similarity of the exsolution temperatures in the different complexes over a distance of several hundred kilometres implies a regional tectonic event that terminated the exsolution process. This event is potentially associated with the final exhumation of the Uralian-Alaskan-type complexes along the Main Uralian Fault and the Serov-Mauk Fault in the Uralian fold belt.

Vergleichende Phylogenie der Gimpel (Aves: Fringillidae: Pyrrhula Brisson, 1760)

Mit dieser Arbeit wird am Beispiel der Gimpel der Gattung Pyrrhula (Aves: Fringillidae) eine vergleichende phylogenetische Methodik angewandt. Der dafür gewählte Untersuchungsansatz beinhaltet v.a. molekulargenetische und morphologische Methoden, deren Ergebnisse vor dem biogeographischen Hintergrund der Gattung analysiert werden. Diese Arbeit bestätigt die traditionelle Abgrenzung der Gimpel gegenüber den anderen Formen der Finkenfamilie. Die Gattung stellt eine monophyletische Gruppe dar und ist sowohl anhand molekulargenetischer als auch morphologischer Merkmale hervorragend umgrenzbar. Eine Vereinigung mit der Schwestergattung Pinicola ist demgegenüber nicht gerechtfertigt. Die mit klassischen Untersuchungsverfahren bestimmten Gruppierungen der Gattung lassen sich auch mit modernen Methoden bestätigen. Pyrrhula besteht aus drei Hauptverwandtschaftsgruppen: „Südostasiatische Gimpel“ (P. nipalensis und P. leucogenis), „Himalayagimpel“ (P. aurantiaca, P. erythaca, P. erythrocephala) und „Eurasische Gimpel“ (P. pyrrhula s.l.). Innerhalb von P. pyrrhula s.l. lassen sich drei genetisch und morphologisch unterschiedlich differenzierte Untergruppierungen mit eigenständige Merkmalskombinationen ausmachen: P. (p.) murina, P. (p.) cineracea und P. (p.) griseiventris. Das Entstehungszentrum von Pyrrhula befand sich vermutlich im südöstlichen Asien. Anhand der molekulargenetischen und biogeographischen Daten lassen sich ungefähre Ausbreitungs- und Diversifizierungsprozesse datieren. Vom Entstehungszentrum ging eine präpleistozäne Ausbreitungswelle aus, die die Aufspaltung der Stammlinienvertreter der Südostasiatischen Gimpel und später die der Himalayagimpel-Stammlinie zur Folge hatten. Etwa zeitgleich begann die Ausbreitung der Vorfahren der Eurasischen Gimpel bis ins westliche Südeuropa. Im frühen Pleistozän spalteten sich die Vorläufer des rezenten P. aurantica ab, gefolgt von der Trennung der südostasiatischen Stammlinie in die Vorfahren von P. nipalensis und P. leucogenis. Daraufhin folgten rasche spätpleistozäne Ausbreitungen und Diversifizierungen, die das Überdauern von Gimpeln in südostchinesischen bzw. mediterranen Glazialrefugien nahelegen. Dabei trennten sich die Stammlinien von P. erythrocephala und P. erythaca ungefähr gleichzeitig mit jenen der Stammlinien von P. pyrrhula s.str., P. (p.) murina und P. (p.) griseiventris. Die P. (p.) cineracea-Stammlinie folgte wiederum etwas später. Die Vorläufer der heutigen P. pyrrhula s.str. nahmen im späten Pleistozän mehrfach ostwärts gerichtete Ausbreitungen vor, während derer sie sich über weite Teile Eurasiens bis nach Kamtschatka verbreiteten. Die morphologischen Differenzierungen der einzelnen Formen wurden wahrscheinlich stark durch die geographischen Verhältnisse beeinflusst. Neben Isolationseffekten auf Inseln (murina) spielten vermutlich auch pleistozäne Refugialgebiete der Mandschurei und Japans für die Entstehung der heutigen griseiventris und das nordmongolische Refugium für cineracea eine große Rolle. Der gefiedermorphologische Geschlechtsmonomorphismus von P. nipalensis und P. leucogenis könnte dabei einen stammesgeschichtlich ancestralen Zustand darstellen, jener von murina ist dagegen sicher eine sekundäre Reduktionserscheinung. Auf Grundlage des Biospezieskonzeptes erlauben die erarbeiteten phylogenetischen Daten, die Gattung Pyrrhula entweder in sechs oder in neun Arten (inkl. zweier Superspezies) zu unterteilen. Der zahlenmäßige Unterschied entsteht dabei durch die unterschiedliche Klassifikation der Formen murina, cineracea und griseiventris, die entweder P. pyrrhula als Subspezies angeschlossen werden oder als Angehörige einer Superspezies P. [pyrrhula] Artrang erhalten.

Untersuchungen mit Bodenpilzen aus der Rebstock-Rhizosphäre unterschiedlich bewirtschafteter Rebanlagen des Rheingaus unter besonderer Berücksichtigung ihrer Pathogenität

Ziel der Untersuchungen war, Pilze aus geschädigtem und ungeschädigtem Wurzelmaterial konventionell und ökologisch bewirtschafteter Weinbergsböden zu isolieren und diese auf ihre Durchsetzungsfähigkeit gegenüber den anderen Arten bzw. deren Pilzmetabolitsuspensionen unter unterschiedlichen Nahrungsbedingungen zu prüfen und eine eventuelle substratabhängige Verhaltensänderung bei den Spezies in Interaktion festzustellen. Zudem wurde in weiteren In-vitro- Versuchen das pathogene Potenzial der gefundenen Arten gegenüber Vitis spp. getestet. Hintergrund dieser Untersuchungen war die Hypothese, dass Absterbeerscheinungen in Rebanlagen nicht durch die Reblaus per se verursacht werden, sondern dass ein Zusammenhang zwischen der Bewirtschaftungsmethode und dem Schadbild in reblausbefallenen Rebanlagen besteht und dessen Entstehung auf pathogenkonduktive und –suppressive Eigenschaften des Bodens zurückgeführt werden kann. Aus rund 2400 Wurzelproben konnten insgesamt 49 Pilzarten isoliert und bestimmt und mehr als die Hälfte davon in Wurzeln beider Versuchsflächen nachgewiesen werden. Ein Großteil der Pilze wurde sowohl in geschädigten als auch in ungeschädigten Wurzelgeweben identifiziert. Darunter waren Arten, die in der Literatur als Parasiten und Saprobier beschrieben werden, aber auch Arten, die eine andere Lebensweise pflegen oder deren Lebensweise nicht bekannt ist. Mit Hilfe von Interaktionsversuchen auf unterschiedlichen Nährmedien (einem Voll- und einem Mangelmedium) konnte bei den untersuchten Arten teilweise starke substratabhängige Verhaltensänderung in Interaktion mit bestimmten Pilzkolonien festgestellt und auf die Verfügbarkeit von organischem Kohlenstoff zurückgeführt werden. Starke Konkurrenz um organischen Kohlenstoff und dadurch entstehende fungistatische und antibiotische Effekte können in diesem Zusammenhang pathogenkonduktive bzw. pathogensuppressive Bodeneigenschaften fördern oder hemmen. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass alle 15 in vitro an Vitis spp. inokulierten Pilze (Absidia glauca, Acremonium kiliense, Aspergillus ustus, Cylindrocarpon magnusianum, Cylindrocarpon sp., Fusarium culmorum, F. detonianum, F. oxysporum, F. sacchari, F. semitectum, Gliocladium roseum, Leptosphaeria coniothyrium, Penicillium expansum, Trichoderma harzianum, T. pseudokoningii), unter denen sich auch als Saprobier bekannte Arten befanden (P. expansum, T. harzianum), selbst bei Verfügbarkeit organischer Kohlenstoffverbindungen im Substrat, gegenüber Vitis spp. ein fakultativ pathogenes Potenzial besitzen. Diese aus In-vitro-Interaktionsversuchen gewonnenen Erkenntnisse geben Hinweise darauf, welchen Einfluss die Bewirtschaftung, insbesondere die Versorgung der Weinbergsböden mit organischem Kohlenstoff, auf fakultativ pathogene Sekundärparasiten in Form von Bodenpilzen und folglich auf die Entwicklung von Schadbildern an durch die Reblaus prädispositionierten Rebpflanzen in vivo haben kann.

Mechanismen und funktionelle Konsequenzen der Chlorid-Homöostase in unreifen Neuronen des Neocortex

GABA, der wichtigste inhibitorische Neurotransmitter im adulten Gehirn, bewirkt im unreifen Nervensystem eine Membrandepolarisation, vermutlich aufgrund der erhöhten intrazellulären Chloridkonzentration ([Cl-]i) in unreifen Nervenzellen. GABAerge Membrandepolarisationen sind essentiell für die korrekte Entwicklung des zentralen Nervensystems und die Entstehung kortikaler Netzwerkaktivität. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde mit Hilfe elektrophysiologischer und immunohistochemischer Methoden die Regulation der Chlorid-Homöostase in unreifen Neuronen des Neokortex untersucht. Die Experimente wurden an Cajal-Retzius (CR) Zellen, einem transienten Zelltyp der Marginalzone, in akuten Hirnschnittpräparaten neonataler Ratten (P0-P3) durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass CR Zellen eine hohe native [Cl-]i von ~30 mM aufweisen. Die hohe [Cl-]i wurde ausschließlich durch Bumetanid sensitiven und Na+-abhängigen aktiven Cl--Transport aufrechterhalten, was auf eine Cl--Akkumulation durch den Kationen-Chlorid-Cotransporter NKCC1 schließen lässt. Diese pharmakologischen Hinweise konnten durch den Nachweis der Expression von NKCC1 in der gesamten Marginalzone, speziell in CR Zellen, bestätigt werden. Die Transportgeschwindigkeit der NKCC1-abhängigen Cl--Akkumulation war gering, was auf eine limitierte Transportkapazität schließen lässt. In Übereinstimmung mit diesem Befund konnte gezeigt werden, dass die Cl--Leitfähigkeit in CR Zellen äußerst klein ist, so dass die NKCC1-abhängige Cl--Akkumulation ausreichend war, um unter Ruhebedingungen eine hohe [Cl-]i zu gewährleisten. Aufgrund dieser hohen [Cl-]i waren GABAA-Rezeptor vermittelte Antworten in CR Zellen exzitatorisch. Die Kapazität des NKCC1-vermittelten Cl--Transportes in CR Zellen konnte durch höherfrequente Stimulation überschritten werden, was dazu führte, dass die [Cl-]i abnahm und GABAerge Antworten unter diesen Bedingungen inhibitorisch wurden. Die inhibitorische Wirkung von GABA in CR Zellen wurde überwiegend durch die Reduktion des Eingangswiderstandes der Zelle vermittelt und beruhte nicht auf einer Verschiebung der Aktionspotentialschwelle.