Mikrobielle Synthese von Biopolymeren aus der nachwachsenden Rohstoffquelle Weizenstroh

Weizenstroh als erneuerbare Ressource zur Produktion von Biopolymeren und wichtigen Grundchemikalien stellt eine ökologisch sinnvolle Alternative dar. Durch die vom PFI durchgeführte Thermodruckhydrolyse konnte das Weizenstroh und die darin enthaltenen Zucker fast vollständig mobilisiert werden. Ein umfangreiches Screening nach Organismen, welche die Zucker des Weizenstrohs verwerten konnten, ergab, dass einige wenige Stämme zur PHB-Bildung aus Xylose befähigt waren (10 %). Zur PHB-Synthese aus Glucose waren indes ca. doppelt so viele Organismen in der Lage (20 %). Zwei der insgesamt 118 untersuchten Organismen zeigten besonders gute PHB-Bildung sowohl mit Xylose als auch mit Glucose als Substrat. Dabei handelte es sich um die hauseigenen Stämme Bacillus licheniformis KHC 3 und Bacillus megaterium KNaC 2. Nach Enttoxifizierung der hemicellulosischen Fraktion konnte diese als C-Quelle im Mineral Medium eingesetzt werden. Burkholderia sacchari DSM 17165 und Hydrogenophaga pseudoflava DSM 1034, sowie die hauseigenen Isolate Bacillus licheniformis KHC 3 und Bacillus megaterium KNaC 2 wurden für die Synthese von PHB aus der hemicellulosischen Fraktion verwendet. Die Zucker der hemicellulosischen Fraktion (Xylose, Glucose, Arabinose) konnten durch diese Organismen zur PHB-Synthese genutzt werden. Hierbei stellte sich heraus, dass die beiden Bacillus-Stämme besser zur Produktion von PHB aus dem hemicellulosischen Hydrolysat geeignet waren als die Stämme der DSMZ. Die alternative Umsetzung der im hemicellulosischem Hydrolysat enthaltenen Zucker (Xylose, Glucose und Arabinose) in die wichtigen Grundchemikalien Lactat und Acetat konnte durch die Verwendung von heterofermentativen Milchsäurebakterien verwirklicht werden. Die Bildung dieser wichtigen Grundchemikalien stellt eine interessante Alternative zur PHB-Synthese dar. Die Menge an teuren Zusätzen wie Tomatensaft, welcher für das Wachstum der MSB essentiell war, konnte reduziert werden. Die Glucose der zweiten Fraktion des Weizenstrohs, der cellulosischen Fraktion, konnte ebenfalls durch den Einsatz von Mikroorganismen in PHB umgewandelt werden. Kommerzielle Cellulasen der Firma Novozymes konnten große Mengen an Glucose (≥10 g/l) aus der cellulosischen Fraktion freisetzen. Diese freie Glucose wurde mit Hilfe von Cupriavidus necator DSM 545, Cupriavidus necator NCIMB 11599, Bacillus licheniformis KHC 3 und Bacillus megaterium KNaC 2 zu PHB fermentiert. Wie auch beim hemicellulosischen Hydrolysat konnten hier die beiden Bacillus-Stämme die besten Ergebnisse erzielen. Bei ihnen machte die PHB mehr als die Hälfte der Trockenmasse aus. Die Abtrennung des Zielprodukts ohne die Verwendung von umweltschädlichen Lösungsmitteln wurde durch die Lyse der Zielzellen durch eigens isolierte Enzyme aus Streptomyceten verwirklicht. Die Zelllyse durch die Enzyme aus Streptomyces globisporus subsp. caucasius DSM 40814 und Streptomyces albidoflavus DSM 40233 war erfolgreich und zeigte vor allem bei den Bacillen hohe Wirkung (83 % und 99 % Zelllyse). Bei dem Gram-negativen Organismus Cupriavidus necator DSM 428 konnte die anfangs niedrige Zelllyse von 38 % durch Ultraschallbehandlung auf ca. 75 % erhöht werden.

Rolle der FOS-Proteine und des MAPK-Signallings in der Regulation der zellulären Antwort auf genotoxischen Stress

Die mittlere Überlebenszeit nach Erkennung eines Glioblastoms ohne Behandlung liegt bei 3 Monaten und kann durch die Behandlung mit Temozolomid (TMZ) auf etwa 15 Monate gesteigert werden. Neben TMZ sind die chlorethylierenden Nitrosoharnstoffe die meistversprechendsten und am häufigsten eingesetzten Chemotherapeutika in der Gliomtherapie. Hier liegt die mittlere Überlebenszeit bei 17,3 Monaten. Um die Therapie des Glioblastoms noch effektiver zu gestalten und Resistenzen zu begegnen, werden unterschiedlichste Ansätze untersucht. Eine zentrale Rolle spielen hierbei das activator protein 1 (AP-1) und die mitogen aktivierten Proteinkinasen (MAPK), deren Funktion in bisherigen Arbeiten noch unzureichend beleuchtet wurde.rnBesonders mit der Rolle des AP-1-bildenden Proteins FRA-1 in der Therapie des Glioblastoms haben sich bisher nur wenige Arbeiten beschäftigt, weshalb im ersten Teil der vorliegenden Arbeit dessen Funktion in der Regulation der Chemosensitivität gegenüber dem chlorethylierenden Agenz ACNU genauer untersucht wurde. Es konnte gezeigt werden, dass die FRA 1-Expression durch Behandlung mit ACNU induziert wird. Die Induktion erfolgte über die beiden MAPKs ERK1/2 und p38K. JNK hatte keinen Einfluss auf die Induktion. Durch die Herunterregulation der FRA-1-Expression mit Hilfe von siRNA und eines shRNA exprimierenden Plasmids kam es zu einer signifikanten Sensitivierung gegenüber ACNU. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Herunterregulation der FRA-1-Expression in einer verminderten AP 1-Bildung, bedingt durch eine reduzierte Menge an FRA-1 im AP-1-Komplex resultiert. Die Sensitivierung gegenüber ACNU ist weder durch eine Veränderung in der DNA-Reparatur, noch in der Modulation der FAS-Ligand- bzw. FAS-Rezeptor-Expression bedingt. Auch die hier untersuchten BCL 2-Familienmitglieder wiesen keine Unterschiede in der Expression durch Modulation der FRA 1-Expression auf. Allerdings kam es durch die verminderte FRA-1-Expression zu einer Reduktion der Zellzahl in der G2/M-Phase nach Behandlung mit ACNU. Diese ging einher mit einer reduzierten Menge an phosphoryliertem und unphosphoryliertem CHK1, weshalb davon auszugehen ist, dass FRA 1 nach ACNU-Behandlung in Gliomzellen vor der Apoptose schützt, indem es modulierend auf die Zellzykluskontrolle einwirkt.rnIm zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Regulation der apoptotischen Antwort nach Behandlung mit ACNU und TMZ genauer beleuchtet, wobei ein spezielles Augen¬merk auf AP 1 und die MAPKs gelegt wurde. Hier konnte gezeigt werden, dass die Apoptose nach Behandlung mit ACNU bzw. TMZ sowohl durch Spaltung von Pro-Caspase 8, als auch Pro-Caspase 9 eingeleitet wird. Dabei akkumulierte in beiden Fällen p53 vermehrt im Zellkern. Eine Inhibierung der transkriptionellen Aktivität von p53 führte nach ACNU-Behandlung zu einer Sensitivierung der Zellen, nach TMZ-Behandlung kam es zu einem leichten Anstieg in der Vitälität. Der FAS-Rezeptor wurde nach ACNU- und nach TMZ-Behandlung aktiviert und auch die DNA-Reparaturproteine DDB2 und XPC wurden in beiden Fällen vermehrt exprimiert. Für die MAPKs JNK und ERK1/2 konnte gezeigt werden, dass diese pro-apoptotisch wirken. Die AP-1-Bildung nach ACNU-Behandlung erfolgte bereits nach 24 h und war von langer Dauer, wohingegen nach TMZ-Behandlung nur eine transiente AP 1-Bildung zu relativ späten Zeitpunkten detektiert werden konnte. Ebenso konnte für das AP-1-Zielgen FAS-Ligand nach ACNU-Behandlung eine relativ schnelle, lang anhaltende Aktivierung detektiert werden, wohingegen nach TMZ-Behandlung zu einem späten Zeitpunkt ein kurzer Anstieg im Signal zu verzeichnen war. In späteren Experimenten konnte gezeigt werden, dass das BCL-2-Familienmitglied BIM eine zentrale Rolle in der Regulation des intrinsischen Apoptosesignalweges nach Behandlung mit ACNU und TMZ spielt. Die hier entstanden Ergebnisse tragen entscheidend zum Verständnis der durch diese beiden Agenzien gesteuerten, apoptotischen Signalwege bei und bieten eine fundierte Grundlage für weitere Untersuchungen.rn

Synthese und Charakterisierung von zylindrischen Bürsten mit polypept(o)idischen Seitenketten als nanopartikuläre Trägersysteme

Zylindrische Polymerbürsten mit pept(o)idischen Seitenketten sind auf Grund ihrer elongierten Topologie, Bioverträglichkeit und hohen Dichte an funktionellen Gruppen vielversprechende Kandidaten für Anwendungen im Bereich des kontrollierten Wirkstoff- bzw. Gentransportes.In dieser Arbeit wurden Polylysin und Polysarkosin als Bestandteile der Seitenketten verwendet. Polylysin dient als positiv geladener Polypeptidblock für die Komplexierung von Polynukleotiden. Polysarkosin reduziert mit seinem „Stealth“-Effekt die Toxizität des Trägersystems und vermindert Wechselwirkungen mit dem Immunsystem. Über den „grafting from“-Ansatz und mit Hilfe der ringöffnenden NCA-Polymerisation konnten erstmals zylindrische Bürsten mit reinen Polysarkosin-Seitenketten sowie mit amphiphilen Seitenketten aus einem Polylysinkern und einer Polysarkosinschale hergestellt werden. Die Bürsten wurden mittels Lichtstreuung, GPC, CD-Spektroskopie und AFM charakterisiert. Die hohe Biokompatibilität beider Bürsten konnte durch Toxizitätstests und dynamische Lichtstreuung in humanem Blutserum nachgewiesen werden.Die Polysarkosin-Bürsten konnten zusätzlich an den Seitenkettenenden mit Azidgruppen funktionalisiert werden, welche eine effektive Biokonjugation ermöglichen. Die zylindrischen Bürsten zeigten nach ihrer Modifikation keine unspezifische Aufnahme in dendritische Zellen und könnten somit als Ausgangssubstanzen für die Synthese polymerbasierter Antikörper-Antigen-Konjugate in der Krebsimmuntherapie verwendet werden.Die Kern-Schale-Bürsten konnten erfolgreich mit siRNA komplexiert werden, ohne dass dabei eine Aggregation auftrat. In ersten Gen-Knockdown-Experimenten zeigten ihre Komplexe eine signifikante Verminderung der ApoB100-Proteinexpression in AML-12 Hepatozyten und könnten daher zukünftig als Transfektionsmittel in der Gentherapie ihren Einsatz finden.

Methodenentwicklung zur Charakterisierung von metallischen Nanopartikeln und deren potentieller Einsatz bei der Analyse von Biomolekülen mittels ICP-MS Kopplungstechniken

Die qualitative und quantitative Analyse von Biomolekülen hat in den letzten Jahren und Jahrzehnten immer mehr an Bedeutung gewonnen. Durch das Aufkommen und die kontinuierliche Weiterentwicklung neuer Separations- und Detektionsmethoden und deren Verbindung miteinander zu leistungsfähigen Einheiten, erlangte man Schritt für Schritt neue Erkenntnisse bei ihrer Untersuchung. Die Elementmassenspektrometrie als nachweisstarke Detektionsmethode wird von vielen wissenschaftlichen Arbeitsgruppen bei der Trennung und Quantifizierung von Proteinen und Metalloproteinen mittels Detektion der in den Biomolekülen vorkommenden Metalle und Heteroatome angewendet. Heteroatome (z.B. Schwefel, Phosphor) haben im Plasma des ICP-MS (inductively coupled plasma - mass spectrometer) schlechte Ionisationseigenschaften und dementsprechend deutlich höhere Nachweisgrenzen als Metalle. Ein Ansatz, schlecht oder nicht detektierbare Verbindungen (also solche, die keine Metalle oder Heteroatome enthalten) mit dem ICP-MS sichtbar zu machen, ist die Markierung der selbigen mit Metallionen oder -cluster. rnIn dieser Arbeit ist es gelungen, der Analyse ganz unterschiedlicher Substanzklassen, zum einen metallische Nanopartikel und zum anderen Proteine, neue Impulse zu geben und zukünftiges Potential bei der Anwendung gekoppelter Techniken zur Separation und Detektion aufzuzeigen. Durch die Verwendung einer alten, aber neu konzipierten Trenntechnik, der Gelelektrophorese (GE), und deren Kopplung an einen modernen Detektor, dem ICP-MS, kann die für die Proteinanalytik weit verbreitete Gelelektrophorese ihr enormes Potential bei der Trennung verschiedenster Verbindungsklassen mit der exzellenten Nachweisstärke und Elementspezifität des ICP-MS verbinden und dadurch mit deutlich weniger Arbeitsaufwand als bisher qualitative und auch quantitative Ergebnisse produzieren. Bisher war dies nur mit großem präparativem Aufwand unter Verwendung der laser ablation möglich. Bei der Analyse von Nanopartikeln konnte aufgezeigt werden, dass durch die GE-ICP-MS-Kopplung aufgrund der guten Trenneigenschaften der GE vorhandene Spezies bzw. Fraktionen voneinander separiert werden und mit Hilfe des ICP-MS Informationen auf atomarem Niveau gewonnen werden können. Es war möglich, das atomare Verhältnis der Metallatome im Kern und der Schwefelatome in der Ligandenhülle eines Nanopartikels zu bestimmen und damit die Größe des Partikels abzuschätzen. Auch konnte die Anzahl der Goldatome in einem dem Schmid-Cluster ähnlichen Nanopartikel bestimmt werden, was vorher nur mit Hilfe von MALDI-TOF möglich war. Bei der Analyse von Biomolekülen konnte auf einfache Weise der Phosphorylierungsgrad verschiedener Proteine bestimmt werden. Auch bei kleinen Molekülen erzielt die Gelelektrophorese ausgezeichnete Trennergebnisse, wie z. B. bei der Analyse verschiedener Brom- und Iodspezies.rnDie stöchiometrische Kopplung eines Proteins an einen Nanopartikel, ohne eine der beiden Verbindungen in einem größeren Maße zu verändern, stellte jedoch eine Herausforderung dar, die im Rahmen dieser Arbeit nicht vollständig gelöst werden konnte. Verschiedene Ansätze zur Kopplung der beiden Substanzen wurden erprobt, jedoch führte keine zu dem gewünschten Ergebnis einer stöchiometrisch vollständigen und spezifischen Modifikation eines Proteins mit einem Nanopartikel. Durch das Potential der GE-ICP-MS-Kopplung bei der Analyse beider Substanz-klassen und dem Beweis der Praktikabilität und Zuverlässigkeit der Methode ist jedoch der Grundstein für weitere Forschungen auf diesem Gebiet gelegt worden. Ist eine geeignete chemische Kopplung der beiden Substanzklassen gefunden und beherrscht, steht auf analytischer Seite eine leistungsstarke Kombination aus Trennung und Detektion zur Verfügung, um die Quantifizierung von Proteinen entscheidend zu verbessern.rn

Drug delivery, entry and intracellular trafficking of polymeric nanoparticles

Polymere Nanopartikel sind kleine Teilchen, die vielseitige Einsatzmöglichkeiten für den Transport von Wirkstoffen bieten. Da Nanomaterialien in diesen biomedizinischen Anwendungen oft mit biologischen Systemen in Berührung kommen, erfordert das eine genaue Untersuchung ihrer gegenseitigen Wechselwirkungen. In diesem speziellen Forschungsgebiet, welches sich auf die Interaktionen von Nanomaterialien mit biologischen Komponenten konzentriert, wurde bereits eine Vielzahl verschiedener Nanopartikel-Zell-Interaktionen (z. B. Nanotoxizität, Wirkstofftransport-mechanismen) analysiert. Bezüglich der Untersuchungen zu nanopartikulären Wirkstofftransport-mechanismen ist es im Allgemeinen akzeptiert, dass ein erfolgreicher zellulärer Transport hauptsächlich von der Aufnahme des Nanotransporters abhängt. Deshalb analysieren wir in dieser Arbeit (1) den Wirkstofftransportmechanismus für biologisch-abbaubare eisenhaltige Poly-L-Milchsäure Nanopartikel (PLLA-Fe-PMI) sowie (2) die Aufnahmemechanismen und die intrazellulären Transportwege von nicht-abbaubaren superparamagnetischen Polystyrolnanopartikeln (SPIOPSN). rnIn dieser Arbeit identifizieren wir einen bisher unbekannten und nicht-invasiven Wirkstoff-transportmechanismus. Dabei zeigt diese Studie, dass der subzelluläre Transport der nanopartikulärer Fracht nicht unbedingt von einer Aufnahme der Nanotransporter abhängt. Der identifizierte Arzneimitteltransportmechanismus basiert auf einem einfachen physikochemischen Kontakt des hydrophoben Poly-L-Milchsäure-Nanopartikels mit einer hydrophoben Oberfläche, wodurch die Freisetzung der nanopartikulären Fracht ausgelöst wird. In Zellexperimenten führt die membranvermittelte Freisetzung der nanopartikulären Fracht zu ihrem sofortigen Transport in TIP47+- und ADRP+- Lipidtröpfchen. Der Freisetzungsmechanismus („kiss-and-run") kann durch die kovalente Einbindung des Frachtmoleküls in das Polymer des Nanopartikels blockiert werden.rnWeiterhin wird in Langzeitversuchen gezeigt, dass die Aufnahme der untersuchten polymeren Nanopartikel von einem Makropinozytose-ähnlichen Mechanismus gesteuert wird. Im Laufe dieser Arbeit werden mehrere Faktoren identifiziert, die in diesem Aufnahmemechanismus eine Rolle spielen. Darunter fallen unter anderem die kleinen GTPasen Rac1 und ARF1, die die Aufnahme von SPIOPSN beeinflussen. Darauffolgend werden die intrazellulären Transportwege der Nanopartikel untersucht. Mit Hilfe eines neuartigen Massenspektrometrieansatzes wird der intrazelluläre Transport von nanopartikelhaltigen endozytotischen Vesikeln rekonstruiert. Intensive Untersuchungen identifizieren Marker von frühen Endosomen, späten Endosomen/ multivesikulären Körpern, Rab11+- Endosomen, Flotillin-Vesikeln, Lysosomen und COP-Vesikeln. Schließlich wird der Einfluss des lysosomalen Milieus auf die Proteinhülle der Nanopartikel untersucht. Hier wird gezeigt, dass die adsorbierte Proteinhülle auf den Nanopartikeln in die Zelle transportiert wird und anschließend im Lysosom abgebaut wird. rnInsgesamt verdeutlicht diese Arbeit, dass die klassische Strategie des nanopartikulären und invasiven Wirkstofftransportmechanismuses überdacht werden muss. Weiterhin lässt sich aus den Daten schlussfolgern, dass polymere Nanopartikel einem atypischen Makropinozytose-ähnlichen Aufnahmemechanismus unterliegen. Dies resultiert in einem intrazellulären Transport der Nanopartikel von Makropinosomen über multivesikuläre Körperchen zu Lysosomen.rn

Evaluation of polymeric nanocarriers for RNA delivery

Therapeutic RNAs, especially siRNAs, are a promising approach for treating diseases like cancer, neurodegenerative disorders and viral infections. Their application, however, is limited due to a lack of safe and efficient delivery systems. Nanosized carriers with the ability to either complex or entrap RNA species are a promising option. rn rn rnSuch a carrier has to meet a lot of requirements, some of which are even partly contradictive. Understanding and controlling the interplay between the different demands would advance a strategic design at an early stage of therapeutic development. rn rn This work is centered around a systematic evaluation of polyplexes, such carriers that are able to complex siRNA due to electrostatic interactions. Six structurally and chemically diverse candidates, poly-L-lysine brushes, block copolymers, cationic peptides, cationic lipids, nanohydrogels, and manganese oxide particles, were tested in a simultaneous fashion. The assays, mostly based on fluorescently labeled siRNA, ranged from the evaluation of polyplex formation and stability to in vitro parameters like cellular uptake and knockdown capability. The analysis from several perspectives offered insight into the interplay between the specifications of one polyplex. Assessing the different carriers under exactly the same experimental conditions also allowed conclusions about favourable traits and starting points for further optimization. This comparative approach also revealed weaknesses of some of the conventional protocols, which were therefore contrasted with alternative methods. In addition, in vitro knockdown assays were optimized and the impact of fluorescently labeled siRNA on knockdown efficiency was assessed. rn rn rn A second class of carriers, which share the ability to entrap siRNA inside their matrix, are briefly addressed. Nanocapsules, dextran particles and liposomes were assessed for basic features like siRNA encapsulation and knockdown capability. rn rn rn rn In an approach towards targeted delivery of RNA, liposomes were endowed with mitochondriotropic tags. Despite successful functionalization, no colocalization between the liposomal cargo and mitochondria was so far observed, which makes further optimization necessary.

Imiquimod based transcutaneous immunization – insights and novel concepts

This work aims at developing a transcutaneous immunization (TCI) approach in order to activate cytotoxic T-cells. A tumor specific immune response was therefore generated by the TLR7-Agonist imiquimod. Five commercially available creams including the innovators product Aldara® 5% creme were assessed to ascertain their capability to induce an immune response in C57BL/6 mice after dermal administration. Moreover, creams were investigated regarding their imiquimod permeation in a Franz-diffusion cell model. Results obtained from this study were used to develop novel formulation approaches based on dissolved state imiquimod in a submicron scale range. High pressure homogenization ensured emulsification as well as particle size reduction. A freeze dried spreadable solid nanoemulsion based on sucrose fatty acid esters and oil components represented a major formulation approach. Within the scope of this approach the influence of pharmaceutical oils i.e. middle chain triglycerides, avocado oil, jojoba wax, and squalen was assessed towards their TCI performance. Furthermore, an aqueous jojoba wax based emulsion gel was developed. Unlike the innovators product, all formulations demonstrated a distinctly reduced imiquimod permeation across murine skin, a fact particularly evident in case of jojoba wax. Squalen significantly augmented in vivo immune response (p≤0.05 Mann-Whitney-Test). The emulsion gel demonstrated a 10fold decrease of imiquimod permeation. In comparison with the innovators product, the emulsion gel induced an equal immune response with a simultaneously enhanced tumor rejection in a mouse model.

Imaging spin-filter efficiency of W(001) and Ir(001) single crystals

Während der letzten Jahre wurde für Spinfilter-Detektoren ein wesentlicher Schritt in Richtung stark erhöhter Effizienz vollzogen. Das ist eine wichtige Voraussetzung für spinaufgelöste Messungen mit Hilfe von modernen Elektronensp ektrometern und Impulsmikroskopen. In dieser Doktorarbeit wurden bisherige Arbeiten der parallel abbildenden Technik weiterentwickelt, die darauf beruht, dass ein elektronenoptisches Bild unter Ausnutzung der k-parallel Erhaltung in der Niedrigenergie-Elektronenbeugung auch nach einer Reflektion an einer kristallinen Oberfläche erhalten bleibt. Frühere Messungen basierend auf der spekularen Reflexion an einerrnW(001) Oberfläche [Kolbe et al., 2011; Tusche et al., 2011] wurden auf einenrnviel größeren Parameterbereich erweitert und mit Ir(001) wurde ein neues System untersucht, welches eine sehr viel längere Lebensdauer der gereinigten Kristalloberfläche im UHV aufweist. Die Streuenergie- und Einfallswinkel-“Landschaft” der Spinempfindlichkeit S und der Reflektivität I/I0 von gestreuten Elektronen wurde im Bereich von 13.7 - 36.7 eV Streuenergie und 30◦ - 60◦ Streuwinkel gemessen. Die dazu neu aufgebaute Messanordnung umfasst eine spinpolarisierte GaAs Elektronenquellernund einen drehbaren Elektronendetektor (Delayline Detektor) zur ortsauflösenden Detektion der gestreuten Elektronen. Die Ergebnisse zeigen mehrere Regionen mit hoher Asymmetrie und großem Gütefaktor (figure of merit FoM), definiert als S2 · I/I0. Diese Regionen eröffnen einen Weg für eine deutliche Verbesserung der Vielkanal-Spinfiltertechnik für die Elektronenspektroskopie und Impulsmikroskopie. Im praktischen Einsatz erwies sich die Ir(001)-Einkristalloberfläche in Bezug auf längere Lebensdauer im UHV (ca. 1 Messtag), verbunden mit hoher FOM als sehr vielversprechend. Der Ir(001)-Detektor wurde in Verbindung mit einem Halbkugelanalysator bei einem zeitaufgelösten Experiment im Femtosekunden-Bereich am Freie-Elektronen-Laser FLASH bei DESY eingesetzt. Als gute Arbeitspunkte erwiesen sich 45◦ Streuwinkel und 39 eV Streuenergie, mit einer nutzbaren Energiebreite von 5 eV, sowie 10 eV Streuenergie mit einem schmaleren Profil von < 1 eV aber etwa 10× größerer Gütefunktion. Die Spinasymmetrie erreicht Werte bis 70 %, was den Einfluss von apparativen Asymmetrien deutlich reduziert. Die resultierende Messungen und Energie-Winkel-Landschaft zeigt recht gute Übereinstimmung mit der Theorie (relativistic layer-KKR SPLEED code [Braun et al., 2013; Feder et al.,rn2012])

Preparation and functional characterisation of recombinant silicatein-alpha from the sponge Suberites domuncula

The marine world is an immense source of biodiversity that provides substances with striking potentials in medicinal chemistry and biotechnology. Sponges (Porifera) are marine animals that represent the most impressive example of organisms possessing the ability to metabolise silica through a family of enzymes known as silicateins. Complex skeletal structures (spicules) made of pure biogenic silica (biosilica) are produced under physiological conditions. Biosilica is a natural material comprising inorganic and organic components with unique mechanical, optical, and physico-chemical properties, including promising potential to be used for development of therapeutic agents in regenerative medicine. Unravelling the intimate physiological mechanisms occurring in sponges during the construction of their siliceous spicules is an on-going project, and several questions have been addressed by the studies proposed by our working group. In this doctoral work, the recombinant DNA technology is exploited for functional and structural characterisation of silicatein. Its precursors are produced as fusion proteins with a chaperone tag (named TF-Ps), and a robust method for the overexpression of native soluble proteins in high concentrations has been developed. In addition, it is observed and proven experimentally that the maturation of silicatein is an autocatalytic event that: (i) can be modulated by rational use of protease inhibitors; (ii) is influenced by the temperature of the environment; (iii) only slightly depends on the pH. In the same experimental framework, observations on the dynamics in the maturation of silicateins allow a better understanding of how the axial filaments form during the early stages of spicule construction. In addition, the definition of new distinct properties of silicatein (termed “structure-guiding” and “structure-forming”) is introduced. By homology models and through comparisons with similar proteins (the cathepsins), domains with significant surface hydrophobicity are identified as potential self-assembly mediators. Moreover, a high-throughput screening showed that TF-Ps could generate crystals under certain conditions, becoming promising for further structural studies. With the goal of optimise the properties of the recombinant silicatein, implementation of new production systems are tried for the first time. Success in the expression of silicatein-type proteins in insect and yeast cells, constitute a promising basis for further development, towards the establishment of an efficient method for the production of a high-value pure and soluble protein.

Untersuchungen zur Esca-Erkrankung von Weinpflanzen : Pilz-Pflanze und antagonistische Interaktionen

Ziel dieser Arbeit war es, ein besseres Verständnis für die molekularen und biochemischen Grundlagen der Esca-Krankheit an Reben zu erarbeiten. Hierzu wurden sechs Teilprojekte durchgeführt. Die beiden Pilze Pm. chlamydospora und Pa. aleophilum wurden submers kultiviert um die gewonnenen Extrakte auf phytotoxische Substanzen zu untersuchten. Dabei wurden Metabolite isoliert, die zum ersten mal mit der Esca-Krankheit assoziiert werden konnten, wie Siderophoren und Kaempferol-3-O-Glukosid. Diese können das Verständnis der Pilz-Pflanze-Interaktion um neue Aspekte ergänzen. Die Glykosylierung von Kaempferol durch Pm wurde erstmals nachgewiesen und die hier dargelegten Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Pilz in der Lage ist, die von der Pflanze als Abwehrantwort produzierte Substanz, seinerseits zu nutzen. Dies bedeutet, dass Pm einen pflanzlichen Abwehrstoff durch Glykosylierung umwandelt und für die Wirtspflanze toxifiziert. Die durchgeführten Injektionstests in vivo in Weinpflanzen zeigten zudem, dass Esca-ähnliche Symptome durch K3G hervorgerufen werden können. Abseits dieser neuen Erkenntnisse konnten auch literaturbekannte Phytotoxine in den Extrakten identifiziert werden.rnIm zweiten Teilprojekt dieser Arbeit wurden Polyketidsynthase-Gene der beiden Pilze Pm und Pa inaktiviert. Zusätzlich wurde der veränderte Sekundärstoffwechsel bzw. die Reaktion der Insertionsmutanten auf abiotischen Stress und Infektionsfähigkeit von Vitis-Pflanzen untersucht. Damit ist es in dieser Arbeit erstmals gelungen selektiv Gene der Esca-assoziierten Pathogene zu inaktivieren. Es zeigte sich, dass die Mutanten sensitiver als die Wildtyp-Stämme bezüglich Salz-, Trocken- und oxidativen Stress reagieren. Die Infektionsfähigkeit bleibt jedoch unverändert.rnDie Analyse der Infektionsmechanismen sollte auch bei der Transformation der Pilze mit Fluoreszenzgenen im Fokus stehen. Im Rahmen dieser Arbeit gelang es GFP-Mutanten der Pilze Pm, Pa und El zu generieren um das Wachstum nach Infektion von Weinpflanzen zu erfassen. Mit Hilfe der Fluoreszenzmutanten war es möglich ein neues Verfahren zur Suche nach potentiellen Antagonisten zu erstellen. Mit dem Vitis Shoot Assay konnten die Esca-assoziierten Pilze und Fungizide, endophytische Pilze, Trichoderma spp. und Bakterien-Stämme in einem Testverfahren auf Schnittwunden untersucht werden. Dabei konnten erste biologische Wundschutzmittel auf Basis ganzer Organismen identifiziert werden. Es zeigte sich, dass der durchgeführte Antagonistentest und das hier beschriebene innovative Vitis Shoot Assay nicht immer äquivalente Ergebnisse generierten und dass sich die beiden Verfahren ergänzen.rnDes Weiteren wurde eine Interaktionsstudie der vier Esca-assoziierten Pilze unter Stressbedingungen und verschiedenen Temperaturen durchgeführt um den Einfluss äußere biotischer und abiotischer Faktoren auf das Zusammenwirken dieser Erreger zu untersuchen. Die Pilze reagieren sehr unterschiedlich in den durchgeführten Stresstests und die Dominanz einzelner Erreger hängt stark von der Temperatur und den osmotischen Verhältnissen ab. Es konnte gezeigt werden, dass veränderte klimatische Bedingungen zur veränderten Zusammensetzung des Erregerspektrums führen kann.rnDie in dieser Arbeit generierten Ergebnisse geben neue Einblicke in die Esca Erkrankung von Weinreben und ermöglichen die weitere Forschung einiger weiterer Aspekte.

Die Synthese von Mucin-Glycopeptid-Vakzinkonjugaten und Adjuvanzien für eine potentielle Krebsimmuntherapie

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Synthese von unterschiedlichen tumorassoziierten Antigenen, die in Form von glycosylierten Aminosäurebausteinen durch Festphasensynthese in den tandem repeat des epithelialen Mucin MUC1 eingebaut wurden. Zur Erzeugung von selektiven Immunantworten wurden synthetische MUC1-Glycopeptide über einen nicht immunogenen Spacer mit einer Reihe von Immunstimulanzien umgesetzt. Es wurden hierbei zwei Ziele verfolgt. Zum einen sollten mit Hilfe von synthetischen MUC1-Glycopeptiden und Immunstimulanzien cytotoxische T-Zellen ausgebildet werden, die Tumorzellen mit überexprimiertem MUC1 am Wachstum hindern und sie in den programmierten Zelltod treiben. Zum anderen sollte mit Hilfe von TH2-Epitopen eine adaptive humorale B-Zell-vermittelte Immunantwort in Form von Antikörpern ausgelöst werden. Zur Ausbildung von cytotoxischen T-Zellen kamen Vakzinkonjugate zum Einsatz, die aus dem IL-1β(163 – 169), dem TLR2-Agonisten (Pam3Cys-Ser-Lys4) oder dem TLR4-Agonisten (spacergebundenes MPL A) bestehen und jeweils an MUC1-Glycopeptide konjugiert wurden. Darüber hinaus wurde eine neue moderne Syntheseroute für das MPL-A entwickelt, welches als Adjuvans in den verschiedenen Vakzinen, wie Cervarix®, Fendrix® und Stimuvax®, Verwendung findet und die Immunantwort der Vakzinkonstrukte nochmals verstärken sollte. Zur Induktion von Antikörpern kamen die OVA(323 – 339)-, die Tetanus-Toxoid- und die BSA-Konjugate zur Anwendung, an denen MUC1-Glycopeptide angeknüpft wurden.

Expanding the scope of poly(ethylene glycol)s for bioconjugation to squaric acid-mediated PEGylation and pH-sensitivity

Poly(ethylene glycol) (PEG) is used in a broad range of applications due to its unique combination of properties and is approved use in formulations for body-care products, edibles and medicine. This thesis aims at the synthesis and characterization of novel heterofunctional PEG structures and the establishment of diethyl squarate as a suitable linker for the covalent attachment to proteins. Chapter 1 is an introduction on the properties and applications of PEG as well as the fascinating chemistry of squaric acid derivatives. In Chapter 1.1, the synthesis and properties of PEG are described, and the versatile applications of PEG derivatives in everyday products are emphasized with a focus on PEG-based pharmaceuticals and nonionic surfactants. This chapter is written in German, as it was published in the German Journal Chemie in unserer Zeit. Chapter 1.2 deals with PEGs major drawbacks, its non-biodegradability, which impedes parenteral administration of PEG conjugates with polyethers exceeding the renal excretion limit, although these would improve blood circulation times and passive tumor targeting. This section gives a comprehensive overview of the cleavable groups that have been implemented in the polyether backbone to tackle this issue as well as the synthetic strategies employed to accomplish this task. Chapter 1.3 briefly summarizes the chemical properties of alkyl squarates and the advantages in protein conjugation chemistry that can be taken from its use as a coupling agent. In Chapter 2, the application of diethyl squarate as a coupling agent in the PEGylation of proteins is illustrated. Chapter 2.1 describes the straightforward synthesis and characterization of squaric acid ethyl ester amido PEGs with terminal hydroxyl functions or methoxy groups. The reactivity and selectivity of theses activated PEGs are explored in kinetic studies on the reactions with different lysine and other amino acid derivatives, followed by 1H NMR spectroscopy. Further, the efficient attachment of the novel PEGs to a model protein, i.e., bovine serum albumin (BSA), demonstrates the usefulness of the new linker for the PEGylation with heterofunctional PEGs. In Chapter 2.3 initial studies on the biocompatibility of polyether/BSA conjugates synthesized by the squaric acid mediated PEGylation are presented. No cytotoxic effects on human umbilical vein endothelial cells exposed to various concentrations of the conjugates were observed in a WST-1 assay. A cell adhesion molecule - enzyme immunosorbent assay did not reveal the expression of E-selectin or ICAM-1, cell adhesion molecules involved in inflammation processes. The focus of Chapter 3 lies on the syntheses of novel heterofunctional PEG structures which are suitable candidates for the squaric acid mediated PEGylation and exhibit superior features compared to established PEGs applied in bioconjugation. Chapter 3.1 describes the synthetic route to well-defined, linear heterobifunctional PEGs carrying a single acid-sensitive moiety either at the initiation site or at a tunable position in the polyether backbone. A universal concept for the implementation of acetal moieties into initiators for the anionic ring-opening polymerization (AROP) of epoxides is presented and proven to grant access to the degradable PEG structures aimed at. The hydrolysis of the heterofunctional PEG with the acetal moiety at the initiating site is followed by 1H NMR spectroscopy in deuterium oxide at different pH. In an exploratory study, the same polymer is attached to BSA via the squarate acid coupling and subsequently cleaved from the conjugate under acidic conditions. Furthermore, the concept for the generation of acetal-modified AROP initiators is demonstrated to be suitable for cholesterol, and the respective amphiphilic cholesteryl-PEG is cleaved at lowered pH. In Chapter 3.2, the straightforward synthesis of α-amino ω2-dihydroxyl star-shaped three-arm PEGs is described. To assure a symmetric length of the hydroxyl-terminated PEG arms, a novel AROP initiator is presented, who’s primary and secondary hydroxyl groups are separated by an acetal moiety. Upon polymerization of ethylene oxide for these functionalities and subsequent cleavage of the acid-labile unit no difference in the degree of polymerization is seen for both polyether fragments.

Interactions of gold nanoparticles with polymeric membranes

This thesis focuses on the interactions of nanoparticles with artificial membranes. The synthesis of the block copolymer poly(dimethylsiloxane)-block-poly(2-methyloxazoline) (PDMS-b-PMOXA) is described, as well as the formation of polymersomes in water. These polymersomes act as minimal cell models, consisting of an artificial bilayer membrane only, allowing the study of the interactions between nanoparticles and polymeric membranes. Both spherical and rod-shaped gold nanoparticles (AuNPs) were used in this study and they were characterized using light scattering (PCS), transmission electron microscopy (TEM), UV/Vis spectroscopy, and polarization anisotropy measurements. The polymer grafting on the spherical cores is asymmetric (shell asphericity) but is parallel to the inherent, due to polycrystallinity, core anisotropy, resulting in a characteristic scattering of the AuNPs in PCS.rnInteractions of polymersomes and AuNPs were investigated by PCS, cryo-TEM and UV/Vis. Three possible scenarios upon mixing of polymersomes and AuNPs can be distinguished by using only PCS: (i) no interactions between particles and vesicles, (ii) attachment of the particles to the outer side of the vesicles (decoration), and (iii) uptake of particles into the vesicles. It is shown that all three scenarios are possible, solely depending on the particle’s surface functionalization. In addition, it was revealed that the AuNPs need to be attached to the inner side of the membrane instead of diffusing freely within the vesicle. The present experimental findings essentially help with the understanding of the interactions of nanoparticles with membranes and show that the process of endocytosis can be attributed to physical processes only. rn

Entwicklung eines biologischen Verfahrens zur Reduktion des Methanschlupfes von Gasaufbereitungsanlagen mittels Einsatz methanotropher Mikroorganismen

Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein biologisches Verfahren zur Reduzierung des Methanschlupfes in Gasaufbereitungsanlagen entwickelt. Der Methanschlupf entsteht, wenn das in Biogasanlagen produzierte Biogas auf normierte Erdgasqualität aufgereinigt wird, welches notwendig ist, um es in das bestehende Erdgasnetz einleiten zu können. Bei dieser Aufreinigung wird aus dem Biogas auch ein Teil des Methans mit ausgewaschen und gelangt mit dem Abgas der Gasaufbereitungsanlage in die Umwelt. Bisher wird dieses methanhaltige Abgas verbrannt, da eine Freisetzung des starken Treibhausgases Methan durch das Erneuerbare-Energien-Gesetz untersagt ist. Dies reduziert die ökologische Bilanz und setzt die Wirtschaftlichkeit der gesamten Biogasanlage herab. rnUm das Methan mit Hilfe eines biologischen Verfahrens zu entfernen, wurden zunächst methanoxidierende Bakterien (MOB) aus verschiedenen Habitaten isoliert, darunter auch erstmalig aus Termiten. Der Nachweis erfolgte durch (quantitative) Polymerase-Kettenreaktion und Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung anhand spezifischer Primer bzw. Sonden für das Gen der partikulären Methanmonoxygenase, ein MOB kennzeichnendes Enzym. Ihr Titer wurde durch qPCR auf 10^2 - 10^3 MOB pro Termitendarm durch qPCR bestimmt. Mit Hilfe einer 16S rDNA Sequenzierung, der (n)SAPD-PCR, der Bestimmung der zellulären Fettsäurezusammensetzung sowie MALDI-TOF-MS-Analysen konnten die Termitenisolate der Gattung Methylocystis zugeordnet werden. Die fehlende Artzuweisung spricht jedoch für die Isolierung einer neuen Art. rnFür den Einsatz der Isolate in Gasaufbereitungsanlagen wurde in Zusammenarbeit mit dem Prüf- und Forschungsinstitut in Pirmasens ein Reaktor im Technikumsmaßstab entwickelt und konstruiert. Der Reaktor wurde mit synthetischen Aufwuchskörper befüllt, diese mit einem neu gewonnenen potenten Termitenisolat besiedelt und der methanhaltige Abgasstrom der Gasaufbereitungsanlage darüber geleitet. Es wurde eine Reduktion des Methans um 68 % innerhalb von 30 Stunden erzielt. Medienoptimierungen wiesen das Potential auf, diesen Verbrauch um das bis zu 4-fache weiter zu steigern. Da durch die Oxidation des Methans im Abgasstrom der Gasaufbereitungsanlage Zellmasse und Polyhydroxybuttersäure (PHB) aufgebaut wurde, können diese als Substrat zurück in die Biogasanlagen geleitet werden und die Wirtschaftlichkeit weiter verbessern. Die Wirksamkeit des in diesem Projekt entwickelten Verfahrens wurde somit eindeutig demonstriert.

Structural characterization of intermediate and metastable phases by electron microscopy

Structure characterization of nanocrystalline intermediates and metastable phases is of primary importance for a deep understanding of synthetic processes undergoing solid-to-solid state phase transitions. Understanding the evolution from the first nucleation stage to the final synthetic product supports not only the optimization of existing processes, but might assist in tailoring new synthetic paths. A systematic investigation of intermediates and metastable phases is hampered because it is impossible to produce large crystals and only in few cases a pure synthetic product can be obtained. Structure investigation by X-ray powder diffraction methods is still challenging on nanoscale, especially when the sample is polyphasic. Electron diffraction has the advantage to collect data from single nanoscopic crystals, but is limited by data incompleteness, dynamical effects and fast deterioration of the sample under the electron beam. Automated diffraction tomography (ADT), a recently developed technique, making possible to collect more complete three-dimensional electron diffraction data and to reduce at the same time dynamical scattering and beam damage, thus allowing to investigate even beam sensitive materials (f.e. hydrated phases and organics). At present, ADT is the only technique able to deliver complete three-dimensional structural information from single nanoscopic grains, independently from other surrounding phases. Thus, ADT is an ideal technique for the study of on-going processes where different phases exist at the same time and undergo several structural transitions. In this study ADT was used as the main technique for structural characterization for three different systems and combined subsequently with other techniques, among which high-resolution transmission electron microscopy (HRTEM), cryo-TEM imaging, X-ray powder diffraction (XRPD) and energy disperse X-ray spectroscopy (EDX).rnAs possible laser host materials, i.e. materials with a broad band emission in the near-infrared region, two unknown phases were investigated in the ternary oxide system M2O-Al2O3-WO3 (M = K, Na). Both phases exhibit low purity as well as non-homogeneous size distribution and particle morphology. The structures solved by ADT are also affected by pseudo-symmetry. rnSodium titanate nanotubes and nanowires are both intermediate products in the synthesis of TiO2 nanorods which are used as additives to colloidal TiO2 film for improving efficiency of dye-sensitized solar cells (DSSC). The structural transition from nantubes to nanowires was investigated in a step by step time-resolved study. Nanowires were discovered to consist of a hitherto unknown phase of sodium titanate. This new phase, typically affected by pervasive defects like mutual layer shift, was structurally determined ab-initio on the basis of ADT data. rnThe third system is related with calcium carbonate nucleation and early crystallization. The first part of this study is dedicated to the extensive investigations of calcium carbonate formation in a step by step analysis, up to the appearance of crystalline individua. The second part is dedicated to the structure determination by ADT of the first-to-form anhydrated phase of CaCO3: vaterite. An exhaustive structure analysis of vaterite had previously been hampered by diffuse scattering, extra periodicities and fast deterioration of the material under electron irradiation. rn