Drug delivery, entry and intracellular trafficking of polymeric nanoparticles

Polymere Nanopartikel sind kleine Teilchen, die vielseitige Einsatzmöglichkeiten für den Transport von Wirkstoffen bieten. Da Nanomaterialien in diesen biomedizinischen Anwendungen oft mit biologischen Systemen in Berührung kommen, erfordert das eine genaue Untersuchung ihrer gegenseitigen Wechselwirkungen. In diesem speziellen Forschungsgebiet, welches sich auf die Interaktionen von Nanomaterialien mit biologischen Komponenten konzentriert, wurde bereits eine Vielzahl verschiedener Nanopartikel-Zell-Interaktionen (z. B. Nanotoxizität, Wirkstofftransport-mechanismen) analysiert. Bezüglich der Untersuchungen zu nanopartikulären Wirkstofftransport-mechanismen ist es im Allgemeinen akzeptiert, dass ein erfolgreicher zellulärer Transport hauptsächlich von der Aufnahme des Nanotransporters abhängt. Deshalb analysieren wir in dieser Arbeit (1) den Wirkstofftransportmechanismus für biologisch-abbaubare eisenhaltige Poly-L-Milchsäure Nanopartikel (PLLA-Fe-PMI) sowie (2) die Aufnahmemechanismen und die intrazellulären Transportwege von nicht-abbaubaren superparamagnetischen Polystyrolnanopartikeln (SPIOPSN). rnIn dieser Arbeit identifizieren wir einen bisher unbekannten und nicht-invasiven Wirkstoff-transportmechanismus. Dabei zeigt diese Studie, dass der subzelluläre Transport der nanopartikulärer Fracht nicht unbedingt von einer Aufnahme der Nanotransporter abhängt. Der identifizierte Arzneimitteltransportmechanismus basiert auf einem einfachen physikochemischen Kontakt des hydrophoben Poly-L-Milchsäure-Nanopartikels mit einer hydrophoben Oberfläche, wodurch die Freisetzung der nanopartikulären Fracht ausgelöst wird. In Zellexperimenten führt die membranvermittelte Freisetzung der nanopartikulären Fracht zu ihrem sofortigen Transport in TIP47+- und ADRP+- Lipidtröpfchen. Der Freisetzungsmechanismus („kiss-and-run") kann durch die kovalente Einbindung des Frachtmoleküls in das Polymer des Nanopartikels blockiert werden.rnWeiterhin wird in Langzeitversuchen gezeigt, dass die Aufnahme der untersuchten polymeren Nanopartikel von einem Makropinozytose-ähnlichen Mechanismus gesteuert wird. Im Laufe dieser Arbeit werden mehrere Faktoren identifiziert, die in diesem Aufnahmemechanismus eine Rolle spielen. Darunter fallen unter anderem die kleinen GTPasen Rac1 und ARF1, die die Aufnahme von SPIOPSN beeinflussen. Darauffolgend werden die intrazellulären Transportwege der Nanopartikel untersucht. Mit Hilfe eines neuartigen Massenspektrometrieansatzes wird der intrazelluläre Transport von nanopartikelhaltigen endozytotischen Vesikeln rekonstruiert. Intensive Untersuchungen identifizieren Marker von frühen Endosomen, späten Endosomen/ multivesikulären Körpern, Rab11+- Endosomen, Flotillin-Vesikeln, Lysosomen und COP-Vesikeln. Schließlich wird der Einfluss des lysosomalen Milieus auf die Proteinhülle der Nanopartikel untersucht. Hier wird gezeigt, dass die adsorbierte Proteinhülle auf den Nanopartikeln in die Zelle transportiert wird und anschließend im Lysosom abgebaut wird. rnInsgesamt verdeutlicht diese Arbeit, dass die klassische Strategie des nanopartikulären und invasiven Wirkstofftransportmechanismuses überdacht werden muss. Weiterhin lässt sich aus den Daten schlussfolgern, dass polymere Nanopartikel einem atypischen Makropinozytose-ähnlichen Aufnahmemechanismus unterliegen. Dies resultiert in einem intrazellulären Transport der Nanopartikel von Makropinosomen über multivesikuläre Körperchen zu Lysosomen.rn

Polymeric nanoparticles are small objects that are promising candidates for the delivery of drugs to subcellular compartments. Since nanomaterials contact biological systems in these biomedical applications, it is absolutely necessary to study their interplay with cellular components. The previous research on the nano-bio-interface already revealed a large number of diverse interactions (e. g. nanotoxicity, drug delivery mechanisms). In terms of drug delivery applications it is so far well accepted that a successful cellular delivery of drugs mainly depends on the nanoparticle uptake and a subsequent endosomal release of the cargo. Therefore, we examine (1) the drug delivery mechanism of biodegradable iron-containing poly-L-lactide nanoparticles (PLLA-Fe-PMI) and study (2) the uptake mechanisms and the intracellular trafficking pathways of nondegradable superparamagnetic iron oxide polystyrene nanoparticles (SPIOPSN). rnIn this study, we identify an unknown and non-invasive drug delivery mechanism. We show that the successful subcellular delivery of nanoparticulate cargo does not necessarily depend on the internalization of nanomedicines. Our findings indicate that the release of nanoparticulate cargo is simply triggered by the physicochemical interaction of hydrophobic poly-L-lactide nanoparticles with a hydrophobic surface. In vitro, the membrane-mediated release of nanoparticulate cargo results in its subsequent transport into TIP47+ and ADRP+ lipid droplets. The release mechanism (“kiss-and-run”) can be blocked by the covalent attachment of the nanoparticulate cargo molecule to the polymer, highlighting the importance of material properties in drug delivery applications. rnFurther on, long-term studies reveal that an atypical macropinocytic mechanism mediates the uptake of PLLA-Fe-PMI and SPIOPSN. We characterize this pathway and identify several factors that influence the uptake of SPIOPSN. These include the small GTPases Rac1 and ARF1. Based on the gained knowledge about the portal of entry, we investigate the intracellular trafficking of the nanoparticles in more detail. Therefore, we dissect the intravesicular endolysosomal milieu of magnetically isolated SPIOPSN-containing vesicles by mass spectrometry. Intensive research on this project identifies markers of early endosomes, late endosomes/multivesicular bodies, Rab11+ endosomes, flotillin vesicles, lysosomes and COP vesicles. Finally, we analyze the effect of the lysosomal milieu on the nanoparticulate protein corona. Here, it is shown that the nanoparticulate protein corona is cointernalized with the nanoparticle and subsequently degraded after reaching Lamp1+/Lamp2+ lysosomes. rnThese findings indicate that one has to reconsider the classical strategy of the invasive nanoparticulate drug delivery. Further on, the data show that polymeric nanoparticles underlie a macropinocytic-like uptake mechanism. This results in an intracellular trafficking of the investigated nanoparticles from macropinosomes via multivesicular bodies to lysosomes.