Charakterisierung und Expression zweier multimerer Hämolympheproteine der Schnecke Biomphalaria glabrata

Die tropische Süsswasserschnecke Biomphalaria glabrata gehört zu der Familie der Planorbidae, welche als einziges Taxon der Gastropoden Hämoglobin als Sauerstofftransportprotein verwenden. Als Zwischenwirt des Bilharzioseerregers Schistosoma mansoni ist B. glabrata von tropenmedizinischer Interesse. Das extrazelluläre BgHb zeigt sich mit einem Anteil von 95% als Hauptprotein in der Hämolymphe. Dieses setzt sich aus Polypeptidketten mit je 240kDa zusammen. Diese wiederrum lassen sich in 13-Häm-Domänen und eine deutlich kleinere N-terminalen nicht Häm-Domäne untergliedern. Die Sequenzierung von zwei der drei Untereinheiten des BgHb (BgHb1, BgHb2) ermöglichte die rekombinante Expression ganzer Untereinheiten in Insektenzellen, und die Expression einiger BgHb2-Konstrukte in E. coli Zellen. Im Rahmen meiner Arbeit gelang es, BgHb1 in biologisch aktiver Form in Insektenzellen zu exprimieren. Das aus dem Überstand der Insektenzellen aufgereinigte rekombinante BgHb1 zeigte eine immunologische Identität mit nativen BgHb. Strukturelle Analysen belegten zudem die Assemblierung des rekombinanten BgHb1 zu einer dem nativen Protein gleichenden Quartärstruktur. Demnach konnte in meiner Arbeit der Nachweis erbracht werden, dass eine einzelne Isoform in der Lage ist, zur Quartärstruktur zu assemblieren. Zusätzlich ergaben Sauerstoffbindungsanalysen, dass das rekombinante BgHb1 reversibel Sauerstoff binden kann.rnIn den restlichen 5% der B. glabrata Hämolymphe zeigt sich ein rudimentäres Hämocyanin, welches für den Sauerstofftransport keine Rolle zu spielen scheint, und ein rosettenförmiges Protein, das es aufzuklären galt. Durch massenspektrometrische Analysen erhaltene Peptidfragmente zeigten eine hohe Sequenzähnlichkeit zu den löslichen Acetylcholin -Bindeproteinen anderer Mollusken. Diese AChBP zeigen eine hohe Sequenzähnlichkeit zur Ligandenbindedomäne von Rezeptoren der Cys-Loop-Proteinfamilie.rnDatenbankrecherchen deckten die Existenz zweier Isoformen auf

Detektion von Nickel- und Cobaltspezies in einzelnen lebenden Zellen mit hoher lateraler Auflösung

Übergangsmetallen wie Nickel und Cobalt kommt meist eine große Bedeutung als Cofaktor in Enzymen oder Metallkomplexen im Metabolismus von Lebewesen zu. Da eine sehr geringe Konzentration dieser Übergangsmetalle in einer Zelle für deren Funktionalität ausreicht, ist eine konstante Konzentration der Spurenelemente in einer Zelle angestrebt. Durch meist anthropogene Einflüsse sind Pflanzen und Menschen zunehmend hohen Konzentrationen von Übergangsmetallen ausgesetzt, die in Abhängigkeit von ihrer Spezies, der Konzentration und der Lokalisation unterschiedliche Toxizitäten aufweisen können. Die Speziation von Metallen wurde bisher mittels gängiger Analyseverfahren, wie der ICP-MS und ähnlicher Verfahren, anhand von bulk-Material durchgeführt. Durch die Entwicklung von optischen Sensoren für Metallionen war es möglich, diese Metalle auch in lebenden Zellen mittels Fluoreszenzmikroskopie zu lokalisieren. Ke und Kollegen (2006, 2007) nutzten einen solchen optischen Sensor - Newport Green DCF, um die Aufnahme von Nickel in humane A543 Lungenbronchialepithelzellen nach Inkubation mit dem wasserlöslichen NiCl2 (0,5 mM und 1 mM) sowie den wasserunlöslichen Verbindungen Ni3S2 (0,5 µg/cm2 und 1 µg/cm2) und NiS (2,5 µg/cm2) nachzuweisen und zu lokalisieren und konnten damit eine Akkumulation von Nickel im Zytoplasma und im Zellkern aufzeigen. Dabei war bei wasserlöslichen und wasserunlöslichen Nickelverbindungen Nickel nach 24 h im Zytoplasma und erst nach 48 h im Zellkern zu beobachten.rnrnDa Nickel und Cobalt keine detektierbare Eigenfluoreszenz unter den gegebenen Bedingungen zeigten, wurde für den optischen Nachweis von Nickel und Cobalt mit dem konfokalen Laser-Raster Mikroskop (CLSM) nach der Zugabe der verschiedenen wasserlöslichen und wasserunlöslichen Metallverbindungen NiCl2, NiSO4, Ni3S2 und CoCl2 in einzelnen lebenden humanen Gingiva-Fibroblasten, sowie in Pflanzenzellen in dieser Arbeit ebenfalls der optische Sensor Newport Green DCF genutzt. Korrespondierend zu den Ergebnissen früherer Arbeiten von Ke et al. (2006, 2007), in denen die Nickelaufnahme bei Konzentrationen von >0,5 mM NiCl2 bzw. >0,5 µg/cm2 Ni3S2 gezeigt wurde, wurde Nickel in Fibroblasten in Abhängigkeit von der Spezies mit steigender Metallkonzentration von 100 µM bis 500 µM nach 16 h im Zytoplasma und zunehmend nach 24 h bis 48 h im Zellkern detektiert. Bei der wasserunlöslichen Verbindung Ni3S2 war der Nachweis von Nickel im Zellkern bereits nach 16 h bis 24 h erfolgreich. Zusätzlich wurden weitere Strukturen wie das Endoplasmatische Retikulum, die Mitochondrien und die Nukleoli durch eine starke Fluoreszenz des optischen Sensors bei Colokalisationsexperimenten mit Organell-spezifischen Fluoreszenzfarbstoffen als target für die Nickelbindung vermutet. Die Lokalisation von Cobalt in den Fibroblasten entsprach weitgehend der Lokalisation von Nickel. Im Zellkern war die Cobaltlokalisation jedoch auf die Nukleoli beschränkt. Weiterführende Versuche an humanen Gingiva-Fibroblasten zeigten, dass die Aufnahme der Metalle in die Fibroblasten pH-Wert abhängig war. Niedrige pH-Werte im sauren pH-Bereich verringerten die Aufnahme der Metalle in die Zellen, wobei ein pH-Wert im basischen Bereich keinen bedeutenden Unterschied zum neutralen pH-Bereich aufwies. Im Vergleich zu den Fibroblasten war in Pflanzenzellen zu jedem Zeitpunkt, auch bei geringen Konzentrationen der Metallverbindungen sowie des optischen Sensors, Nickel und Cobalt in den Zellkernen detektierbar. Durch die Eigenschaft der Pflanzenzellen eine Vakuole zu besitzen, war Nickel und Cobalt hauptsächlich in den Vakuolen lokalisiert. Weitere Strukturen wie das Endoplasmatische Retikulum, die Mitochondrien oder auch die Zellwand kamen bei Pflanzenzellen als target in Frage.rnrnDie Fluoreszenz und Lokalisation der Metalle in den Fibroblasten waren unabhängig von der Spezies sehr ähnlich, sodass in den Zellen die Spezies anhand der fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen kaum unterschieden werden konnten. Lambda-Scans in verschiedenen regions of interest (ROI) wurden durchgeführt, um durch die Fluoreszenzspektren Hinweise auf eine charakteristische Beeinflussung der Bindungspartner von Nickel und Cobalt oder dieser Metalle selbst in den Zellen auf den optischen Sensor zu bekommen und diese dadurch identifizieren zu können. Das Ziel der parallelen Detektion bzw. Lokalisation und gleichzeitigen Speziation bestimmter Nickel- und Cobaltpezies in einzelnen lebenden Zellen konnte in dieser Arbeit durch den optischen Sensor Newport Green DCF nicht erreicht werden.

Poly(lactide): from hyperbranched copolyesters to new block copolymers with functional methacrylates

The prologue of this thesis (Chapter 1.0) gives a general overview on lactone based poly(ester) chemistry with a focus on advanced synthetic strategies for ring-opening polymerization, including the emerging field of organo catalysis. This section is followed by a presentation of the state-of the art regarding the two central fields of the thesis: (i) polyfunctional and branched poly(ester)s in Chapter 1.1 as well as (ii) the development of new poly(ester) based block copolymers with functional methacrylates (Chapter 1.2). Chapter 2 deals with the synthesis of new, non-linear poly(ester) structures. In Chapter 2.1, the synthesis of poly(lactide)-based multiarm stars, prepared via a grafting-from method, is described. The hyperbranched poly(ether)-poly(ol) poly(glycerol) is employed as a hydrophilic core molecule. The resulting star block copolymers exhibit potential as phase transfer agents and can stabilize hydrophilic dyes in a hydrophobic environment. In Chapter 2.2, this approach is expanded to poly(glycolide) multiarm star polymers. The problem of the poor solubility of linear poly(glycolide)s in common organic solvents combined with an improvement of the thermal properties has been approached by the reduction of the total chain length. In Chapter 2.3, the first successful synthesis of hyperbranched poly(lactide)s is presented. The ring-opening, multibranching copolymerization of lactide with the “inimer” 5HDON (a hydroxyl-functional lactone monomer) was carefully examined. Besides a precise molecular characterization involving the determination of the degree of branching, we were able to put forward a reaction model for the formation of branching during polymerization. Several innovative approaches to amphiphilic poly(ester)/poly(methacrylate)-based block copolymers are presented in the third part of the thesis (Chapter 3). Block copolymer build-up especially relies on the combination of ring-opening and living radical polymerization. Atom transfer radical polymerization has been successfully combined with lactide ring-opening, using a “double headed” initiator. This strategy allowed for the realization of poly(lactide)-block-poly(2-hydroxyethyl methacrylate) copolymers, which represent promising materials for tissue engineering scaffolds with anti-fouling properties (Chapter 3.1). The two-step/one-pot approach forgoes the use of protecting groups for HEMA by a careful selection of the reaction conditions. A series of potentially biocompatible and partially biodegradable homo- and block copolymers is described in Chapter 3.2. In order to create a block copolymer with a comparably strong hydrophilic character, a new acetal-protected glycerol monomethacrylate monomer (cis-1,3- benzylidene glycerol methacrylate/BGMA) was designed. The hydrophobic poly(BGMA) could be readily transformed into the hydrophilic and water-soluble poly(iso-glycerol methacrylate) (PIGMA) by mild acidic hydrolysis. Block copolymers of PIGMA and poly(lactide) exhibited interesting spherical aggregates in aqueous environment which could be significantly influenced by variation of the poly(lactide)s stereo-structure. In Chapter 3.3, pH-sensitive poly(ethylene glycol)-b-PBGMA copolymers are described. At slightly acidic pH values (pH 4/37°C), they decompose due to a polarity change of the BGMA block caused by progressing acetal cleavage. This stimuli-responsive behavior renders the system highly attractive for the targeted delivery of anti-cancer drugs. In Chapter 3.4, which was realized in cooperation, the concept of biocompatible, amphiphilic poly(lactide) based polymer drug conjugates, was pursued. This was accomplished in the form of fluorescently labeled poly(HPMA)-b-poly(lactide) copolymers. Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) of partially biodegradable block copolymer aggregates exhibited fast cellular uptake by human cervix adenocarcinoma cells without showing toxic effects in the examined concentration range (Chapter 4.1). The current state of further projects which will be pursued in future studies is addressed in Chapter 4. This covers the synthesis of biocompatible star block copolymers (Chapter 4.2) and the development of new methacrylate monomers for biomedical applications (Chapters 4.3 and 4.4). Finally, the further investigation of hydroxyl-functional lactones and carbonates which are promising candidates for the synthesis of new hydrophilic linear or hyperbranched biopolymers, is addressed in Chapter 4.5.

Synthese und Charakterisierung von polymerbasierten Trägersystemen für biomedizinische Anwendungen

Polymer-Therapeutika spielen im Bereich der Arzneimittelforschung eine immerrngrößere Rolle. Benötigt werden dafür Trägersysteme für die gewünschten Wirkstoffe.rnDurch den Einsatz von wasserlöslichen biokompatiblen Polymeren werden mehrerernentscheidende Vorteile erhalten. Beispielsweise verlängert sich durch die höherernMolmasse die Zirkulationszeit im Blutkreislauf. Zudem ermöglicht die Anbindung vonrnTargetmolekülen den gezielten Wirkstofftransport zum Zielort.rnDie vorliegende Arbeit behandelt die Synthese und Charakterisierung von polymerbasiertenrnTrägersystemen für biomedizinische Anwendungen.rnAls erstes Teilprojekt wurde die Synthese einer Polymerbürste gewählt, derenrnSeitenketten aus Polymer-Oligonucleotid (ODN)-Konjugaten bestehen. Als Polymerrnwurde Poly(N-Isopropylacrylamid) gewählt, welches per RAFT-Polymerisationrnsynthetisiert wurde. Die Bürste sollte mittels „Grafting Through“-Technik hergestelltrnwerden. Dafür wurden zuerst das Polymer-Oligonucleotid-Konjugat und darausrnanschließend das entsprechende Makromonomer gebildet. Die Synthese undrnCharakterisierung des Konjugats sowie des Makromonomers wurden erfolgreichrndurchgeführt, jedoch war die Aufreinigung des Makromonomers nicht möglich.rnIm zweiten Teilprojekt war das Ziel Polyion-Komplex-Mizellen als Trägersystemernherzustellen. Benötigt wurden dazu ein Polymer bestehend aus einem kationischenrnund einem biokompatiblen Block sowie eine ODN-Sequenz zur Komplexierung desrnkationischen Blocks. Im ersten Ansatz wurde als Polymerisationsmethode die RAFTPolymerisationrnund Mono-N-boc-1,3-diaminopropanmethylmethacrylat als kationischesrnMonomer sowie α- bzw. ε-Lysinmethylmethacrylat als zwitterionischesrnMonomer verwendet. Jedoch war die Herstellung der Blockcopolymere nicht möglich.rnIm zweiten Ansatz wurde deshalb Poly-2-oxazolin als biokompatibler Block gewählt.rnMit Poly-L-lysin als kationischen Block und CpG war eine Bildung und Charakterisierungrnvon Polyion-Komplex-Mizellen in 15mM PBS-Puffer möglich.rnIm dritten Teilprojekt wurden biomedizinisch relevante Verbindungen mittelsrnkupferfreier Clickchemie an eine ELP-Bürste gebunden und charakterisiert.

First contact imaging of nanoparticular siRNA – From synthesis to application of a prodye concept

Delivery of therapeutic nucleic acid based drugs is still very demanding and difficult to manage and monitor. For this reason, a precise method for the monitoring of RNAi pathways is necessary. This thesis explores a new approach for sensing of potentially therapeutic nucleic acids, using the interaction of so called prodyes with intracellular enzymes in a prodrug manner. To realize this concept, some non-fluorescent, fluorescein based asymmetric dyes were synthesized and their spectroscopic characteristics were studied. Azide-alkyne Click chemistry was applied for conjugation purposes, using a new protocol at weak acidic pH to get intact prodye constructs. Both, an electrophoretic mobility shift assay with polyacrylamide gels and in-cuvette experiments showed remarkable OFF-to-ON behavior of these new siRNA constructs under physiological conditions. After salt-free purification, subsequent hybridization to double-stranded ribonucleic acids and nanoformulation to lipoplexes, the prodye conjugated siRNA was examined in cellular uptake studies for First Contact Imaging. The investigated siRNA-prodye conjugates showed strong sensitivity to esterases, being hydrolyzed at the biolabile function and developing a strong fluorescence which was verified in bulk. As an optimization, a new profluorescent molecule system was designed and synthesized, which has a carbonate as biolabile 6’ protecting group and a highly water soluble 3’ clickable linker. This new non-fluorescent but colored prodye showed 12 - 320 times increased fluorescence intensities between OFF- and ON- states, depending to the deprotection method. This is the first reported molecule model of an asymmetric profluorescent fluorescein, having the very favorable 3’ & 6’ functions.

Three-dimensional electron microscopy of myriapod hemocyanin, planorbid snail acetylcholine-binding protein and cyanobacterial Vipp1

Three-dimensional electron microscopy (3-D EM) provides a framework for the analysis of large protein quaternary structures. The advantage over the generally higher resolving meth- od of X-ray crystallography is the embedding of the proteins in their physiological environ- ment. However, results of the two methods can be combined to obtain superior structural information. In this work, three different protein types – (i) Myriapod hemocyanin, (ii) vesi- cle-inducing protein in plastids 1 (Vipp1) and (iii) acetylcholine-binding protein (AChBP) – were structurally analyzed by 2-D and 3-D EM and, where possible, functionally interpreted.rnMyriapod hemocyanins have been previously shown to be 6x6-meric assemblies that, in case of Scutigera coleoptrata hemocyanin (ScoHc), show two 3x6-mer planes whith a stag- gering angle of approximately 60°. Here, previously observed structural differences between oxy- and deoxy-ScoHc could be substantiated. A 4° rotation between hexamers of two dif- ferent 3x6-mer planes was measured, which originates at the most central inter-hexamer in- terface. Further information about allosteric behaviour in myriapod hemocyanin was gained by analyzing Polydesmus angustus hemocyanin (PanHc), which shows a stable 3x6-mer and divergent histidine patterns in the inter-hexamer interfaces when compared to ScoHc. Both findings would conclusively explain the very different oxygen binding properties of chilopod and diplopod hemocyanin.rnVipp1 is a protein found in cyanobacteria and higher plants which is essential for thyla- koid membrane function and forms highly variable ring-shaped structures. In the course of this study, the first 3-D analysis of Vipp1 was conducted and yielded reconstructions of six differently sized Vipp1 rings from negatively stained images at resolutions between 20 to 30 Å. Furthermore, mutational analyses identified specific N-terminal amino acids that are essential for ring formation. On the basis of these analyses and previously published results, a hypothetical model of the Vipp1 tertiary and quaternary structure was generated.rnAChBP is a water-soluble protein in the hemolymph of mollusks. It is a structural and functional homologue of the ligand-binding domain of nicotinic acetylcholine receptors. For the freshwater snail Biomphalaria glabrata, we previously described two types of AChBP (BgAChBP1 and BgAChBP2). In this work, a 6 Å 3-D reconstruction of native BgAChBP is presented, which shows a dodecahedral assembly that is unprecedented for an AChBP. Single particle analysis of recombinantely expressed BgAChBP types led to preliminary results show- ing a dodecahedral assembly of BgAChBP1 and a dipentameric assembly of BgAChBP2. This indicates divergent biological functions of the two types.

Synthesis and application of stimuli responsive tunable systems based on physical interactions

Novel single step synthetic procedure for hydrophobically modified alkali soluble latexes (HASE) via a miniemulsion-analogous method is presented. This facile method simplifies the copolymerization of the monomers with basically “opposite” character in terms of their hydrophilic/hydrophobic nature, which represent one of the main challenges in water based systems. Considered systems do not represent classical miniemulsions due to a high content of water soluble monomers. However, the polymerization mechanism was found to be rather similar to miniemulsion polymerization process.rnThe influence of the different factors on the system stability has been investigated. The copolymerization behavior studies typically showed strong composition drifts during copolymerization. It was found that the copolymer composition drift can be suppressed via changing the initial monomer ratio.rnThe neutralization behavior of the obtained HASE systems was investigated via potentiometric titration. The rheological behavior of the obtained systems as a function of the different parameters, such as pH, composition (ultrahydrophobe content) and additive type and content has also been investigated.rnDetailed investigation of the storage and loss moduli, damping factor and the crossover frequencies of the samples showed that at the initial stages of the neutralization the systems show microgel-like behavior.rnThe dependence of the rheological properties on the content and the type of the ultrahydrophobe showed that the tuning of the mechanical properties can be easily achieved via minor (few percent) but significant changes in the content of the latter. Besides, changing the hydrophobicity of the ultrahydrophobe via increasing the carbon chain length represents another simple method for achieving the same results.rnThe influence of amphiphilic additives (especially alcohols) on the rheological behavior of the obtained systems has been studied. An analogy was made between micellation of surfactants and the formation of hydrophobic domains between hydrophobic groups of the polymer side chain.rnDilution induced viscosity reduction was investigated in different systems, without or with different amounts or types of the amphiphilic additive. Possibility of the controlled response to dilution was explored. It was concluded that the sensitivity towards dilution can be reduced, and in extreme cases even the increase of the dynamic modulus can be observed, which is of high importance for the setting behavior of the adhesive material.rnIn the last part of this work, the adhesive behavior of the obtained HASE systems was investigated on different substrates (polypropylene and glass) for the standard labeling paper. Wet tack and setting behavior was studied and the trends for possible applications have been evaluated.rnThe novel synthetic procedure, investigation of rheological properties and the possibility of the tuning via additives, investigated in this work create a firm background for the development of the HASE based adhesives as well as rheology modifiers with vast variety of possible applications due to ease of tuning the mechanical and rheological properties of the systems.

Sequence-controlled synthesis of soluble oligo(p-benzamide)s

This work focused on the synthesis of novel monomers for the design of a series of oligo(p-benzamide)s following two approaches: iterative solution synthesis and automated solid phase protocols. These approaches present a useful method to the sequence-controlled synthesis of side-chain and main-chain functionalized oligomers for the preparation of an immense variety of nanoscaffolds. The challenge in the synthesis of such materials was their modification, while maintaining the characteristic properties (physical-chemical properties, shape persistence and anisotropy). The strategy for the preparation of predictable superstructures was devote to the selective control of noncovalent interactions, monodispersity and monomer sequence. In addition to this, the structure-properties correlation of the prepared rod-like soluble materials was pointed. The first approach involved the solution-based aramide synthesis via introduction of 2,4-dimethoxybenzyl N-amide protective group via an iterative synthetic strategy The second approach focused on the implementation of the salicylic acid scaffold to introduce substituents on the aromatic backbone for the stabilization of the OPBA-rotamers. The prepared oligomers were analyzed regarding their solubility and aggregation properties by systematically changing the degree of rotational freedom of the amide bonds, side chain polarity, monomer sequence and degree of oligomerization. The syntheses were performed on a modified commercial peptide synthesizer using a combination of fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) and aramide chemistry. The automated synthesis allowed the preparation of aramides with potential applications as nanoscaffolds in supramolecular chemistry, e.g. comb-like-