RNA-basierte Impfstoffe zur Induktion optimaler Immunantworten

Antigen-kodierende RNA wird als eine sichere und effiziente Alternative zu traditionellen Impfstoff-Formulierungen, wie Peptid-, Protein-, rekombinanten viralen oder DNA basierten Impfstoffen betrachtet. Der endgültige klinische Nutzen RNA-basierter Impfstoffe wird von der Optimierung verschiedener Parameter abhängig sein, die zur Induktion und effizienten Expansion der humoralen und zellvermittelten Immunantwort beitragen. Vor diesem Hintergrund war die Zielsetzung der vorliegenden Arbeit, die Etablierung pharmakologischer und immunologischer Parameter für die Generierung effektiver Immunantworten durch RNA-Impfstoffe sowie deren Wirksamkeit in vitro und im Mausmodell unter Nutzung von Modellantigenen zu testen. Zur Untersuchung und Optimierung der RNA-Pharmakokinetik, als einem Schlüsselaspekt der klinischen Medikamentenentwicklung, wurde der Einfluss von strukturellen Modifikationen auf die Transkriptstabilität und Translationseffizienz von Reporter-Proteinen in einer zeitabhängigen Kinetik evaluiert. Es wurde gezeigt, dass ein poly(A) Schwanz von 120 Adenosinen, verglichen mit einem kürzeren, ein freies 3´ poly(A) Ende, verglichen mit einem verdeckten und eine doppelte β-globin 3´ UTR, unabhängig voneinander zu einer Erhöhung der IVT-RNA Stabilität und zu einer Verbesserung der Translationseffizienz beitrugen und dadurch insgesamt zu einer erhöhten Proteinexpression führten. Antigen-kodierende IVT-RNA mit diesen molekularen Merkmalen in Kombination führte, im Vergleich zur Standard IVT-RNA, zu einer erhöhten Dichte und Stabilität von Peptid/MHC-Komplexen auf der Zelloberfläche transfizierter DCs und dadurch zu einer verbesserten Stimulation von CD4+ und CD8+ T-Zellen im murinen und humanen System. Mit dem Ziel, die RNA kodierte Antigenform für die Induktion einer verstärkten Antikörperantwort zu modifizieren, wurde im zweiten Teil der Arbeit ein Antigen-IgM Fusionskonstrukt hergestellt und hinsichtlich seiner Eignung als neues Impfstoff-Format untersucht. Die Ausgangshypothese, dass die RNA kodierten Antigen-IgM Fusionsproteine polymerisieren, von transfizierten Zellen sezerniert werden und aufgrund der repetitiven Antigenstruktur im Vergleich mit dem monomeren Antigen zu einer Verstärkung der Antikörperantwort führen, wurde in vitro und in vivo im Mausmodell bestätigt. Die Entwicklung und Evaluierung von Zytokinfusionsproteinen zur selektiven Verstärkung der antigenspezifischen Immunantworten bildeten den dritten Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit. Zur weiteren Verstärkung der Antikörperantwort wurde basierend auf den Resultaten aus dem zweiten Teil ein IL2-IgM Fusionskonstrukt hergestellt. Die Ko-Transfektion von Antigen-IgM und IL2-IgM kodierender IVT-RNA führte zu einer signifikant stärkeren Antikörperantwort als die Ko-Transfektion von Antigen-IgM und IL2. Für die Initiierung einer erfolgreichen anti-Tumor-Immunantwort ist das Priming antigenspezifischer T-Zellen essentiell. Um die Effizienz dieses Prozesses zu steigern, wurde ein bifunktionelles IL2-mCD40L Fusionskonstrukt hergestellt und sein Einfluss auf die Effektorfunktion von DCs in vitro und in vivo untersucht. Es wurde gezeigt, dass ein RNA kodiertes IL2-mCD40L Fusionsprotein als genetisches Adjuvanz zu einer Effizienzsteigerung des Priming zytotoxischer T-Zellen führt. Somit wurden in dieser Arbeit durch die Optimierung der Pharmakokinetik, die Modifikation der Antigenform und die Herstellung und Evaluierung von Zytokinfusionskonstrukten als genetische Adjuvantien, RNA-basierte Impfstoffe für eine optimierte Induktion von antigenspezifischen Immunantworten weiter verbessert.

Synthese und Charakterisierung einer Hydrogelmatrix für die Multianalyt-Sensorik

Gegenstand und Ziel der vorliegenden Arbeit war die Synthese und Charakterisierung einer Hydrogelmatrix, welche für die Herstellung eines vielseitig verwendbaren Sensors, der mehrere Analyten (Proteine, DNA etc.) in hoher Verdünnung (c0 < 50 fM) aus kleinsten Probenmengen (Volumina <20 nl) schnell (t < 1 min) und parallel nachweisen kann, Verwendung finden soll. Der Fokus der Arbeit lag dabei in der Synthese und Charakterisierung von Copolymeren als Hydrogelmatrix, welche geeignetes temperaturabhängiges Verhalten zeigen. Die Copolymere wurden in eine dreidimensionale Netzwerkstruktur überführt und auf einer Goldoberfläche kovalent angebunden, um Delamination zu vermeiden und die Untersuchung mittels Oberflächenplasmonenresonanz-Spektroskopie (SPR) und Optischer Wellenleiter-Spektroskopie (OWS) zu erlauben. Weiterhin wurde das temperaturabhängige Verhalten der Polymernetzwerke in Wasser mittels optischen Messungen (SPR/OWS) untersucht, um Erkenntnisse über die Quell- und Kollabiereigenschaften des Hydrogels zu gewinnen. Um temperaturschaltbare Hydrogele herzustellen, wurden auf N-Isopropylacrylamid (NIPAAm) basierende Polymere synthetisiert. Es wurde sowohl die für Hydrogele übliche Methode der freien radikalischen Vernetzungspolymerisation in Wasser, wie eine neue, auf Benzophenoneinheiten basierende Syntheseroute, welche die freie radikalische Polymerisation in organischem Medium nutzt, verwendet. Die synthetisierten Polymere sind Copolymere aus N‑Isopropylacrylamid (NIPAAm) und 4-Methacryloyloxybenzophenon (MABP). NIPAAm ist dabei für das temperaturschaltbare Verhalten der Gele verantwortlich und MABP dient als Photovernetzer. Weitere Copolymere, die neben den genannten Monomeren noch andere Funktionen, wie z.B. ionische Gruppen oder Aktivesterfunktionen enthalten, wurden ebenfalls synthetisiert. Das temperaturabhängige Quellverhalten in Bezug auf die chemische Zusammensetzung wurde mit der Oberflächenplasmonenresonanz-Spektroskopie (SPR) und Optischen Wellenleiter-Spektroskopie (OWS) untersucht. Es zeigte sich, dass die Anwesenheit von Salz im Hydrogel (Natriumacrylat als Monomer, P4S) Inhomogenität, in Form eines Brechungsindexgradienten senkrecht zur Substratoberfläche, hervorruft. Dies ist nicht der Fall, wenn statt des Salzes die Säure (Methacrylsäure als Monomer, P4A) verwendet wird. Durch die Inhomogenität lassen sich die Filme mit dem Natriummethacrylat nicht mehr mit dem, üblicherweise zur Auswertung genutzten, Kastenmodell beschreiben. Die Anwendung der Wentzel-Kramers-Brillouin-Näherung (WKB) auf die Messdaten führt hingegen zu dem gewünschten Ergebnis. Man findet ein kastenähnliches Brechungsindexprofil für das Hydrogel mit der Säure (P4A) und ein Gradientenprofil für das Gel mit dem Salz (P4S). Letzteres ist nicht nur hydrophiler und insgesamt stärker gequollen, sondern ragt auch weiter in die überstehende Wasserphase hinein. Anhand eines säurehaltigen Hydrogels (P8A) konnte der quellungshemmende Einfluss von hohen Salzkonzentrationen gezeigt werden. Weiterhin wurde während des Quellvorgangs eine gewisse Anisotropie gefunden, die aber im vollständig gequollenen und vollständig kollabierten Zustand nicht mehr vorliegt. Anhand eines Hydrogels ohne ionisierbare Gruppen (P9) wurde die Reversibilität des Quell- und Kollabiervorgangs gezeigt. Bei einem Vergleich zwischen einem säurehaltigen Hydrogel (P8A, Quellgrad von 7,3) und einem ohne ionisierbare Gruppen (P9, Quellgrad von 6,1), hat die Anwesenheit der 8 mol% Säuregruppen eine leichte Verstärkung der Quellung um den Faktor 1,2 bewirkt. Rasterkraftmikroskopische Untersuchungen (AFM) an diesen beiden Hydrogelen im getrockneten Zustand, haben gezeigt, dass nach dem Quellen, Kollabieren und Trocknen bei beiden Gelen Porenstrukturen sehr unterschiedlicher Ausmaße vorliegen.

Oxidierte Kohlenwasserstoffe in der oberen Troposphäre: Kinetische Untersuchungen zum Abbau und Einfluss auf HO x und Ozon-Chemie

Der erste Teil dieser Arbeit befasst sich mit der Kinetik der Reaktion des OH-Radikals mit Glykolaldehyd (HOCH2CHO). Die Geschwindigkeitskonstante k1 wurde für diese Reaktion temperaturabhängig bestimmt. Durch gepulste Photolyse wurden OH-Radikale erzeugt. Anschließend wurde die laserinduzierte Fluoreszenz der OH-Radikale bei 309 nm detektiert. Die ermittelte Geschwindigkeitskonstante k1 für die Reaktion von OH mit HOCH2CHO von (8,0 ± 0,8) x 10-12 cm3 Teilchen-1 s-1 erweist sich für den Temperaturbereich von 240 K < T < 362 K als temperaturunabhängig. Zwischen 60 und 250 Torr kann zudem keine Druckabhängigkeit für k1 beobachtet werden. Die unerwartet niedrigere Geschwindigkeitskonstante für die betrachtete Reaktion im Vergleich zur Reaktion von OH mit CH3CHO konnte anhand von Überlegungen zur Korrelation zwischen der C-H-Bindungsstärke und dem H-Abstraktionskanal erklärt werden. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Photochemie von Aceton (CH3C(O)CH3), Methylethylketon (C2H5C(O)CH3, MEK) und Acetylbromid (CH3C(O)Br) betrachtet. Für die Photolyse von Aceton (bei 248 nm und 266 nm), MEK (bei 248 nm) und Acetylbromid (bei 248 nm) wurden bei 298 ± 3 K druckabhängig zwischen 5 und 1600 Torr N2 Quantenausbeuten für die Methylbildung (Phi(CH3)) bestimmt. Nach gepulster Photolyse der betrachteten Moleküle wurden die transienten Absorptionssignale der Methylradikale bei 216,4 nm verfolgt. Die Quantenausbeuten wurden relativ zur Photolyse von Methyliodid (CH3I) unter gleichen Reaktionsbedingungen ermittelt. Die erhaltenen Quantenausbeuten für CH3-Radikale nehmen für die beiden Systeme Aceton / 248 nm (Phi(CH3, Aceton) = 1,42 – 0,99) und MEK / 248 nm (Phi(CH3, MEK) = 0,45 – 0,19) druckabhängig zu hohen Drücken ab. Die Druckabhängigkeit von Phi(CH3) wird auf die Konkurrenz zwischen Stoßrelaxation und Dissoziation der schwingungsangeregten Acetylradikale (CH3CO#) zurückgeführt. Für das System Aceton / 266 nm wird keine Druckabhängigkeit von Phi(CH3) = 0,93 ± 0,1 beobachtet. Dies wird damit erklärt, dass CH3CO# nicht genügend Energie besitzt, um die Barriere zur Dissoziation zu überschreiten. Bei der Photolyse von Acetylbromid bei 248 nm wird druckunabhängig Phi(CH3) = 0,92 ± 0,10 bestimmt. In diesem System dissoziieren die schwingungsangeregten Acetylradikale bei allen Drücken vollständig. Bei 266 nm wurde die Gesamtquantenausbeute für die Photodissoziation von Aceton (Phi(diss, 266nm)) bestimmt. Die nach Photolyse erhaltenen Methyl - und Acetylradikale wurden nach Titration mit Br2 durch die Resonanzfluoreszenz der Bromatome detektiert. Phi(diss, 266nm) wurde mit 0,92 ± 0,07 bestimmt.

Untersuchung der lateralen Organisation und Phasenumwandlung von festkörperunterstützten Lipidmembranen

Im ersten Teil der Arbeit wurde das Bindungsverhalten von Annexin A1 und Annexin A2t an festkörperunterstützte Lipidmembranen aus POPC und POPS untersucht. Für beide Proteine konnte mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie gezeigt werden, dass irreversible Bindung nur in Anwesenheit von POPS auftritt. Durch rasterkraftmikroskopische Aufnahmen konnte die laterale Organisation der Annexine auf der Lipidmembran dargestellt werden. Beide Proteine lagern sich in Form lateraler Aggregate (zweidimensionale Domänen) auf der Oberfläche an, außerdem ist der Belegungsgrad und die Größe der Domänen von der Membranzusammensetzung und der Calciumkonzentration abhängig. Mit zunehmendem POPS-Gehalt und Calciumkonzentration steigt der Belegungsgrad an und der mittlere Domänenradius wird kleiner. Diese Ergebnisse konnten in Verbindung mit detaillierten Bindungsstudien des Annexins A1 mit der Quarzmikrowaage verwendet werden, um ein Bindungsmodell auf Basis einer heterogenen Oberfläche zu entwickeln. Auf einer POPC-reichen Matrix findet reversible Adsorption statt und auf POPS-reichen Domänen irreversible Adsorption. Durch die Anpassung von dynamischen Monte Carlo-Simulationen basierend auf einer zweidimensionalen zufälligen sequentiellen Adsorption konnten Erkenntnisse über die Membranstruktur und die kinetischen Ratenkonstanten in Abhängigkeit von der Calciumkonzentration und der Inkubationszeit des Proteins gewonnen werden. Die irreversible Bindung ist in allen Calciumkonzentrationsbereichen schneller als die reversible. Außerdem zeigt die irreversible Adsorption eine deutlich stärkere Abhängigkeit von der Calciumkonzentration. Ein kleinerer Belegungsgrad bei niedrigen Ca2+-Gehalten ist hauptsächlich durch die Abnahme der verfügbaren Bindungsplätze auf der Oberfläche zu erklären. Die gute Übereinstimmung der aus den Monte Carlo-Simulationen erhaltenen Domänenstrukturen mit den rasterkraftmikroskopischen Aufnahmen und die Tatsache, dass sich die simulierten Resonanzfrequenzverläufe problemlos an die experimentellen Kurven aus den QCM-Messungen anpassen ließen, zeigt die gute Anwendbarkeit des entwickelten Simulationsprogramms auf die Adsorption von Annexin A1. Die Extraktion der kinetischen Parameter aus dem zweidimensionalen RSA-Modell ist mit Sicherheit einem einfachen Langmuir-Ansatz überlegen. Bei einem Langmuir-Modell erfolgt eine integrale Erfassung einer einzelnen makroskopischen Geschwindigkeitskonstante, während durch das RSA-Modell eine differenzierte Betrachtung des reversiblen und irreversiblen Bindungsprozesses möglich ist. Zusätzlich lassen sich mikroskopische Informationen über die Oberflächenbeschaffenheit gewinnen. Im zweiten Teil der Arbeit wurde das thermotrope Phasenverhalten von festkörperunterstützten Phospholipidbilayern untersucht. Dazu wurden mikrostrukturierte, frei stehende Membranstreifen präpariert und mit Hilfe der bildgebenden Ellipsometrie untersucht. Dadurch konnten die temperaturabhängigen Verläufe der Schichtdicke und der lateralen Membranausdehnung parallel beobachtet werden. Die ermittelten Phasenübergangstemperaturen von DMPC, diC15PC und DPPC lagen 2 - 3 °C oberhalb der Literaturwerte für vesikuläre Systeme. Außerdem wurde eine deutliche Verringerung der Kooperativität der Phasenumwandlung gefunden, was auf einen großen Einfluss des Substrats bei den festkörperunterstützten Lipidmembranen schließen lässt. Zusätzlich wurde ein nicht systematischer Zusammenhang der Ergebnisse von der Oberflächenpräparation gefunden, der es unabdingbar macht, bei Untersuchungen von festkörperunterstützten Substraten einen internen Standard einzuführen. Bei der Analyse des thermotropen Phasenübergangsverhaltens von DMPC/Cholesterol - Gemischen wurde daher die individuelle Adressierbarkeit der strukturierten Lipidmembranen ausgenutzt und ein Lipidstreifen aus reinem DMPC als Standard verwendet. Auf diese Weise konnte gezeigt werden, dass das für Phospholipide typische Phasenübergangsverhalten ab 30 mol% Cholesterol in der Membran nicht mehr vorhanden ist. Dies ist auf die Bildung einer nur durch höhere Sterole induzierten fluiden Phase mit hoch geordneten Acylketten zurückzuführen. Abschließend konnte durch die Zugabe von Ethanol zu einer mikrostrukturierten DMPC-Membran die Bildung eines interdigitierten Bilayers nachgewiesen werden. Die bildgebende Ellipsometrie ist eine sehr gute Methode zur Untersuchung festkörperunterstützter Lipidmembranen, da sie über ein sehr gutes vertikales und ein ausreichendes laterales Auflösungsvermögen besitzt. Sie ist darin zwar einem Rasterkraftmikroskop noch unterlegen, besitzt dafür aber eine einfachere Handhabung beim Umgang mit Flüssigkeiten und in der Temperierung, eine schnellere Bildgebung und ist als optische Methode nicht-invasiv.

Untersuchung der DNA-bindenden Eigenschaften neuer Nukleobasen-gekoppelter Pyrrolcarboxamide, Combilexine und Hetaren[a]carbazol-Derivate: Validierung und Etablierung von in-vitro- und in-silico-Methoden

Da maligne Neoplasien durch Mutationen in Proto-Onko- und/oder Tumorsuppressorgenen ausgelöst werden, stellt die DNA eines der wichtigsten Targets für die Entwicklung neuer Zytostatika dar. Auch bei den im Arbeitskreis Pindur designten und synthetisier-ten Verbindungen der Nukleobasen-gekoppelten Pyrrolcarboxamid-, der Hetaren[a]carbazol- und der Combilexin-Reihe handelt es sich um DNA-Liganden mit potentiell antitumoraktiven Eigenschaf-ten. Die einen dualen Bindemodus aufweisenden Combilexine bestehen aus einem Interkalator (u. a. Naphthalimid, Acridon), der über einen Linker variabler Kettenlänge mit einer rinnenbin-denden, von Netropsin abgeleiteten Bispyrrol-, oder einer bioisosteren Imidazol-, Thiazol- oder Thiophen-pyrrolcarboxamid-struktur verknüpft ist. Das N-terminale Ende der Combilexine wird von einer N,N-Dimethylaminopropyl- oder -ethyl-Seitenkette gebildet. Die DNA-Affinitäten der Liganden wurden mittels Tm-Wert-Messung-en bestimmt. Diese Denaturierungsexperimente wurden sowohl mit poly(dAdT)2- als auch mit Thymus-DNA (~42% GC-Anteil) durchge-führt, um Aussagen zur Stärke und zur Sequenzselektivität der DNA-Bindung machen zu können. Des Weiteren wurden die Bindekon-stanten einiger ausgewählter Vertreter mit Hilfe des Ethidium-bromid-Verdrängungsassays ermittelt; einige Testverbindungen wurden zudem auf potentiell vorhandene, TOPO I-inhibierende Eigenschaften untersucht. Diese biochemischen und biophysika-lischen Tests wurden durch Molecular Modelling-Studien ergänzt, die die Berechnung von molekularen Eigenschaften, die Durch-führung von Konformerenanalysen und die Simulation von DNA-Ligand-Komplexen (Docking) umfassten. Durch Korrelation der in vitro-Befunde mit den in silico-Daten gelang es, vor allem für die Substanzklasse der Combilexine einige richtungweisende Struktur-Wirkungsbeziehungen aufzustellen. So konnte gezeigt werden, dass die Einführung eines Imidazol-Rings in die rinnen-bindende Hetaren-pyrrolcarboxamid-Struktur der Combilexine aufgrund der H-Brücken-Akzeptor-Funktion des sp2-hybridisierten N-Atoms eine Verschiebung der Sequenzselektivität der DNA-Bindung von AT- zu GC-reichen Arealen der DNA bedingt. Zudem erwies sich ein C3-Linker für die Verknüpfung des Naphthalimids mit dem rinnenbindenden Strukturelement als am besten geeignet, während bei den Acridon-Derivaten die Verbindungen mit einem N-terminalen Buttersäure-Linker die höchste DNA-Affinität aufwiesen. Dies ist sehr wahrscheinlich auf die im Vergleich zum Naphthalimid-Molekül geringere y-Achsen-Ausdehnung (bzgl. eines x/y-Koordinatensystems) des Acridons zurückzuführen. Die ermittelten Struktur-Wirkungsbeziehungen können dazu herangezogen werden, das rationale Design neuer DNA-Liganden mit potentiell stärkerer DNA-Bindung zu optimieren.

Einfluss der Habitatfragmentierung durch Überflutung auf Laufkäferpopulationen (Coleoptera; Carabidae)

Innerhalb dieser Dissertation wurde zwischen den Jahren 2002 und 2005 mit Hilfe von Barberfallen die Laufkäferfauna der Auwälder am nördlichen Oberrhein zwischen Mainz und Bingen erfasst. Dabei dienten verschiedene Rheininseln und ufernahe Festlandgebiete als Probeflächen. Fünf der typischen Bewohner dieser Flächen (Agonum afrum, Nebria brevicollis, Oxypselaphus obscurus, Platynus assimilis, Pterostichus anthracinus) dienten weiterhin als Modellarten für die Untersuchung der genetischen Diversität zwischen den einzelnen Populationen mittels RAPD-Analysen. Alles in allem konnten im Untersuchungsgebiet über 20.000 Individuen aus 101 Carabidenarten gefangen werden. Die häufigsten Vertreter waren Platynus assimilis, Pterostichus melanarius und Agonum afrum. Hohe Diversitäts- und Dominanzindices auf allen Flächen sprechen für die Dynamik des Lebensraumes und somit die Intaktheit der untersuchten Auwälder. Einen weiteren Hinweis auf die ständig wechselnden Lebensbedingungen durch immer wiederkehrende Überflutungen zeigt das Auftreten verschiedener ökologischer Gruppen. Überall dominierten deutlich die Arten, die mit gewissen Störungen des Habitates auskommen oder durch ihr hohes Ausbreitungspotential davor fliehen können. Das sind die Imaginalüberwinterer, makropteren, hygrophilen und kleinen Spezies. Auch das Geschlechterverhältnis weist auf deutliche Anzeichen für regelmäßige Beeinträchtigungen der Flächen hin. Knapp die Hälfte der beobachteten Arten im Untersuchungsgebiet steht auf einer der Roten Listen von Deutschland, Rheinland-Pfalz oder Hessen. Somit besteht für das gesamte Gebiet ein hoher Schutzbedarf. Das Hauptaugenmerk dieser Arbeit lag bei den Einflüssen der Hochwasserstände auf die Artenzusammensetzungen und die genetischen Diversitäten der Laufkäferpopulationen. Deshalb untersuchte man auch die Wirkung derjenigen Faktoren, die ihrerseits unmittelbar von den Extremwasserständen beeinflusst werden. Hier sind vor allem der Auentyp (Weichholz/Hartholz) und die Lage der Flächen auf Insel oder Festland zu nennen, die die deutlichsten Unterschiede in Artendiversität und Genetik der einzelnen Populationen zeigten. Aber auch weitere Faktoren, wie Wasserstandsdynamik, Auwaldbreite, Entfernung vom Fluss und Lage zum Damm weisen Zusammenhänge mit bestimmten ökologischen Gruppen auf. Lediglich die Habitatgröße scheint keinen Einfluss auf die Diversitäten zu nehmen. Abschließend konnten auch für das Jahr 2003, in dem extrem heiße und trockene Bedingungen herrschten, negative Effekte auf die Laufkäfergemeinschaften gezeigt werden.

Einfluss von oxidativem Stress auf die DNA-Reparatur in Säugerzellen

Gegenstand dieser Arbeit war es, das Zusammenspiel zwischen DNA-Reparatur und zellulärem anitoxidativen Abwehrsystem in Melanomzellen und gesunden Hautfibroblasten näher zu untersuchen. Dabei konnte gezeigt werden, dass die dominierenden DNA-Läsionen im Falle einer Bestrahlung mit sichtbarem Licht (400 – 800 nm) Fpg-sensitive Läsionen, zu denen die Basenmodifikation 7,8-Dihydro-8-oxoguanin (8-oxoG) gehört, und im Falle der UVA-Bestrahlung Cyclobutan-Pyrimidindimere (CPDs) sind. Sowohl Melanomzellen als auch Hautfibroblasten waren problemlos in der Lage, die durch sichtbares Licht und UVA-Strahlung induzierten oxidativen DNA-Modifikationen zu reparieren. Jedoch reagierten Melanomzellen in einer adaptiven Antwort mit einer Erhöhung ihres Glutathion-Gehalts auf ein Maximum (nach circa 10 - 14 h) nach Bestrahlung mit sichtbarem Licht, wohingegen die Hautfibroblasten einen massiven Einbruch direkt nach Bestrahlung und eine extrem lange Erholungsphase über 48 h aufzuweisen hatten. Die darauffolgende Untersuchung der DNA-Reparaturkapazität der Zellen unter Bedingungen von oxidativem Stress mit vorangegangener Depletion intrazellulären Glutathions zeigten eine dramatische, nahezu vollständige Hemmung der Reparatur durch UVA- bzw. Sonnenlicht-induzierter Fpg-sensitiver DNA-Modifikationen (8-oxoG) - sowohl in Melanomzellen als auch in Hautfibroblasten. Dieser Effekt ließ sich durch den Zusatz von Dithiothreitol (DTT), nach erfolgter Bestrahlung der Glutathion-depletierten Zellen, wieder komplett revertieren. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass an der Reparatur ein redoxempfindliches Protein oder zellulärer Cofaktor beteiligt sein muß. Zudem konnte durch Untersuchungen der Nukleotidexzisionsreparatur (NER) und der Einzelstrangbruchreparatur nach dem gleichen Versuchsdesign gezeigt werden, dass es sich hierbei sehr wahrscheinlich um einen für die Basenexzisionsreparatur (BER) von 7,8-dihydro-8-oxo-guanine (8-oxoG) exklusiven Effekt handelte. Zwei der wichtigsten Reparaturproteine der BER, nämlich hOGG1 und APE1, wurden anschließend auf ihre Funktionsfähigkeit hin untersucht, da es naheliegend war, dass der Reparaturhemmung ein Funktionsverlust eines dieser beiden Enzyme zugrunde liegen könnte. Im Falle des APE1-Proteins konnte dies ausgeschlossen werden, da mit Hilfe der Alkalischen Elution die volle Funktionsfähigkeit für die Reparatur von AP-Läsionen nachgewiesen werden konnte. Interessanterweise zeigte aber das hOGG1-Protein eine zwischen der dritten und vierten Stunde nach Bestrahlung Glutathion-depletierter Zellen stark abfallende Aktivität der 8-oxoG-Glykosylasefunktion. Die Western-Blot-Analyse ergab allerdings keinen Hinweis auf eine Proteinoxidation von hOGG1. Möglicherweise wird nicht hOGG1 selbst, wohl aber ein anderes, für eine konzertierte Abfolge der einzelnen Reparaturschritte entscheidend notwendiges Protein innerhalb der Zelle durch ROS leicht oxidiert. In jedem Fall bleibt festzustellen, dass Glutathion eine wichtige Aufgabe hinsichtlich einer voll funktionsfähigen Basenexzisionreparatur zuzukommen scheint. Die Ergebnisse unterstreichen die mögliche Bedeutung von oxidativem Stress für die Entstehung von Krebs durch Sonnenlicht, insbesondere durch UVA, da die durch die Strahlung (und eventuell auftretende Entzündung) gebildeten ROS nicht nur DNA-Schäden induzieren, sondern auch ihre Reparatur verhindern können.

Nanoscale effects and applications of self-organized nanostructured thin films

A nanostructured thin film is a thin material layer, usually supported by a (solid) substrate, which possesses subdomains with characteristic nanoscale dimensions (10 ~ 100 nm) that are differentiated by their material properties. Such films have captured vast research interest because the dimensions and the morphology of the nanostructure introduce new possibilities to manipulating chemical and physical properties not found in bulk materials. Block copolymer (BCP) self-assembly, and anodization to form nanoporous anodic aluminium oxide (AAO), are two different methods for generating nanostructures by self-organization. Using poly(styrene-block-methyl methacrylate) (PS-b-PMMA) nanopatterned thin films, it is demonstrated that these polymer nanopatterns can be used to study the influence of nanoscale features on protein-surface interactions. Moreover, a method for the directed assembly of adsorbed protein nanoarrays, based on the nanoscale juxtaposition of the BCP surface domains, is also demonstrated. Studies on protein-nanopattern interactions may inform the design of biomaterials, biosensors, and relevant cell-surface experiments that make use of nanoscale structures. In addition, PS-b-PMMA and AAO thin films are also demonstrated for use as optical waveguides at visible wavelengths. Due to the sub-wavelength nature of the nanostructures, scattering losses are minimized, and the optical response is amenable to analysis with effective medium theory (EMT). Optical waveguide measurements and EMT analysis of the films’ optical anisotropy enabled the in situ characterization of the PS-b-PMMA nanostructure, and a variety of surface processes within the nanoporous AAO involving (bio)macromolecules at high sensitivity.

Nanodiamanten in primitiven Meteoriten: Strukturuntersuchungen und Einfluss des Rückstoßes bei beta-Zerfällen

Im Rahmen dieser Arbeit wurden Untersuchungen zur Rückstoßeffekten, sowie Ausheizversuche zur Erforschung struktureller Veränderungen und Änderung der Edelgaskonzentrationen und Ausgasungsmuster in meteoritischen Nanodiamanten durchgeführt. In der ersten Versuchsserie wurden die durch prompte "?"-Strahlung bei Neutronenaktivierung von Brom in terrestrische Detonationsdiamanten und durch den "?"-Zerfall von 22Na in synthetischen und meteoritischen Diamanten verursachten Rückstoßverluste bestimmt. Diese wurden mit theoretischen Verlustwerten, berechnet mit Hilfe der SRIM-Software und der Korngrößenverteilung, verglichen. Im Fall der prompten "?"-Strahlung war der Unterschied signifikant. Hierzu können allerdings systematische Unsicherheiten in den gemessenen Verlusten, wie z.B. unbekannte Br-Verteilung innerhalb der Diamanten beigetragen haben. Die Ergebnisse des zweiten Versuchs bei kleineren Rückstoß-Energien, wie sie auch in der Natur vorkommen würden, zeigten dagegen keinen signifikanten Unterschied. Dies führt zu der Schlussfolgerung, dass weder das „Fehlen“ einiger in Supernovae Typ II gebildeter Radionuklide, wie 26Al, 44Ti, in den Diamanten noch die in einem für die Erklärung des Xe-H vorgeschlagenen Modell benötigte frühzeitige Trennung der Vorläuferkerne stabiler Xe-Isotope von den stabilen Xe-Isotopen durch Rückstoßverluste erklärt werden kann. In der zweiten Versuchsreihe wurden meteoritische Nanodiamantproben bei unterschiedlichen Temperaturen im Vakuum vorgeheizt und danach, um die Heizprodukte zu entfernen, chemisch behandelt. Bei allen Vorheiztemperaturen wurden zwiebelähnliche Strukturen registriert und auch in den nachbehandelten Proben wurden, bedingt durch die wegen Verklumpung der Proben eingeschränkte chemische Behandlung, neben Diamanten unveränderte, oder teilweise zerstörte Umwandlungsprodukte gefunden. Weiterhin wurden Edelgaskonzentrationen und Ausgasungsmuster gemessen, um die durch Vorheizen und chemische Behandlung bedingten Veränderungen im Vergleich zu den Original-Diamanten zu untersuchen. Ein unerwartetes Ergebnis dieser Untersuchungen war, dass die vorgeheizten und chemisch nachbehandelten Proben deutlich niedrigere Ausbeuten im Vergleich zu den nur vorgeheizten zeigten, was darauf hindeutete, dass die während des Vorheizens entstandenen Umwandlungsprodukte, wie z.B. zwiebelähnliche Strukturen, Edelgase zurückhalten konnten, die später (teilweise) durch chemische Behandlung entfernt wurden.

Räumliche Verbreitung geogener Schwermetallgehalte in Böden des Taunus: Einfluss von periglazialer Deckschichtengenese

Während der Glazialphasen kam es in den europäischen Mittelgebirgen bedingt durch extensive solifluidale Massenbewegungen zur Bildung von Deckschichten. Diese Deckschichten repräsentieren eine Mischung verschiedener Substrate, wie anstehendes Ausgangsgestein, äolische Depositionen und lokale Erzgänge. Die räumliche Ausdehnung der Metallkontaminationen verursacht durch kleinräumige Erzgänge wird durch die periglaziale Solifluktion verstärkt. Das Ziel der vorliegenden Untersuchung war a) den Zusammenhang zwischen den Reliefeigenschaften und den Ausprägungen der solifluidalen Deckschichten und Böden aufzuklären, sowie b) mittels Spurenelementgehalte und Blei-Isotopen-Verhältnisse als Eingangsdaten für Mischungsmodelle die Beitrage der einzelnen Substrate zum Ausgangsmaterial der Bodenbildung zu identifizieren und quantifizieren und c) die räumliche Verteilung von Blei (Pb) in Deckschichten, die über Bleierzgänge gewandert sind, untersucht, die Transportweite des erzbürtigen Bleis berechnet und die kontrollierenden Faktoren der Transportweite bestimmt werden. Sechs Transekte im südöstlichen Rheinischen Schiefergebirge, einschließlich der durch periglaziale Solifluktion entwickelten Böden, wurden untersucht. Die bodenkundliche Geländeaufnahme erfolgte nach AG Boden (2005). O, A, B und C-Horizontproben wurden auf ihre Spurenelementgehalte und teilweise auf ihre 206Pb/207Pb-Isotopenverhältnisse analysiert. Die steuernden Faktoren der Verteilung und Eigenschaften periglazialer Deckschichten sind neben der Petrographie, Reliefeigenschaften wie Exposition, Hangneigung, Hangposition und Krümmung. Die Reliefanalyse zeigt geringmächtige Deckschichten in divergenten, konvexen Hangbereichen bei gleichzeitig hohem Skelettgehalt. In konvergent, konkaven Hangbereichen nimmt die Deckschichtenmächtigkeit deutlich zu, bei gleichzeitig zunehmendem Lösslehm- und abnehmendem Skelettgehalt. Abhängig von den Reliefeigenschaften und -positionen reichen die ausgeprägten Bodentypen von sauren Braunerden bis hin zu Pseudogley-Parabraunerden. Des Weiteren kommen holozäne Kolluvien in eher untypischen Reliefpositionen wie langgestreckten, kaum geneigten Hangbereichen oder Mittelhangbereichen vor. Außer für Pb bewegen sich die Spurenelementgehalte im Rahmen niedriger Hintergrundgehalte. Die Pb-Gehalte liegen zwischen 20-135 mg kg-1. Abnehmende Spurenelementgehalte und Isotopensignaturen (206Pb/207Pb-Isotopenverhältnisse) von Pb zeigen, dass nahezu kein Pb aus atmosphärischen Depositionen in die B-Horizonte verlagert wurde. Eine Hauptkomponentenanalyse (PCA) der Spurenelementgehalte hat vier Hauptsubstratquellen der untersuchten B-Horizonte identifiziert (Tonschiefer, Löss, Laacher-See-Tephra [LST] und lokale Pb-Erzgänge). Mittels 3-Komponenten-Mischungsmodell, das Tonschiefer, Löss und LST einschloss, konnten, bis auf 10 Ausreißer, die Spurenelementgehalte aller 120 B-Horizontproben erklärt werden. Der Massenbeitrag des Pb-Erzes zur Substratmischung liegt bei <0,1%. Die räumliche Pb-Verteilung zeigt Bereiche lokaler Pb-Gehaltsmaxima hangaufwärtiger Pb-Erzgänge. Mittels eines 206Pb/207Pb-Isotopenverhältnis-Mischungsmodells konnten 14 Bereiche erhöhter lokaler Pb-Gehaltsmaxima ausgewiesen werden, die 76-100% erzbürtigen Bleis enthalten. Mit Hilfe eines Geographischen Informationssystems wurden die Transportweiten des erzbürtigen Bleis mit 30 bis 110 m bestimmt. Die steuerenden Faktoren der Transportweite sind dabei die Schluffkonzentration und die Vertikalkrümmung. Diese Untersuchung zeigt, dass Reliefeigenschaften und Reliefposition einen entscheidenden Einfluss auf die Ausprägung der Deckschichten und Böden im europäischen Mittelgebirgsbereich haben. Mischungsmodelle in Kombination mit Spurenelementanalysen und Isotopenverhältnissen stellen ein wichtiges Werkzeug zur Bestimmung der Beiträge der einzelnen Glieder in Bodensubstratmischungen dar. Außerdem können lokale Bleierzgänge die natürlichen Pb-Gehalte in Böden, entwickelt in periglazialen Deckschichten der letzten Vereisungsphase (Würm), bis über 100 m Entfernung erhöhen.

Untersuchungen zum Mechanismus der Zytotoxizität von alkylierenden Agenzien in malignen Melanomzellen

Maligne Melanome sind gegenüber Chemotherapeutika relativ resistent. Das methylierende Alkylanz Temozolomid sowie das chlorethylierende und DNA-Interstrand Crosslink (ICL) bildende Alkylanz Fotemustin kommen bei der Behandlung des malignen Melanoms als Mittel erster Wahl zum Einsatz. In der vorliegenden Arbeit konnte das erste Mal nachgewiesen werden, dass die zytotoxische Wirkung von Temozolomid und Fotemustin in Melanomzellen durch Apoptose vermittelt wird. Unter Verwendung klinisch relevanter Dosen der beiden Alkylantien konnte die Induktion von Apoptose durch vier unabhängige Methoden (Bestimmung der SubG1-Fraktion und der Apoptose- / Nekrose-Frequenz, Aktivierung der Effektorcaspasen-3 und -7 sowie Spaltung von PARP-1) nachgewiesen werden. Die Alkylierungen an der O6-Position des Guanins, welche durch beide Agenzien induziert werden, sind auch in Melanomzellen die wichtigsten Zytotoxizität-bewirkenden Läsionen in der DNA, und die O6-Methylguanin-DNA-Methyltransferase (MGMT) ist folglich ein herausragender Resistenzmarker. Eine der verwendeten Zelllinien (D05) exprimierte p53-Wildtypprotein. Diese Zelllinie war resistenter als alle anderen Zelllinien gegenüber Temozolomid und Fotemustin. Dies weist darauf hin, dass p53 nicht die Apoptoseinduktion in Melanomzellen verstärkt. Die Prozessierung des O6MeG erfolgt über die Mismatch-Reparatur (MMR) unter Generierung von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSBs). Die Untersuchung der durch Temozolomid induzierten DSBs, nachgewiesen durch gammaH2AX-Induktion, korrelierte direkt mit der apoptotischen Antwort von Melanomzelllinien und DSBs können somit als eine entscheidende apoptoseauslösende Größe angesehen werden. Eine Resistenz gegenüber dem methylierenden Temozolomid in der Zelllinie MZ7 konnte auf einen Defekt in der MMR-Schadenserkennung auf der Ebene des MutSalpha-Komplexes zurückgeführt werden. Dieser Defekt hatte keinen Einfluss auf die Fotemustin-vermittelte Apoptoseinduktion. Neben MGMT konnte somit die MMR als Resistenzfaktor gegenüber methylierenden Agenzien in Melanomen identifiziert werden. Die Fotemustin-induzierte Apoptose wurde in Melanomzelllinien im Detail untersucht. Es konnte erstmals gezeigt werden, dass Fotemustin-bedingte ICLs in Zellen einen G2/M-Arrest im Behandlungszyklus induzieren. Wie anhand G1-arretierter Zellen nachgewiesen werden konnte, war das Durchlaufen der DNA-Replikation vor Erreichen des Arrests für die Induktion der Apoptose notwendig. Die Prozessierung von ICLs ist im Vergleich zu Methylierungen der DNA deutlich komplexer. Dies könnte erklären, warum in Melanomzellen die durch gammaH2AX-Induktion repräsentierten DSBs nicht mit der Sensitivität der einzelnen Zelllinien korreliert. Die Untersuchung unterschiedlich sensitiver Zelllinien zeigte ein vergleichbares Schadensniveau an ICLs und eine ebenso vergleichbare initiale Prozessierung derselben unter Generierung von DSBs. Die Prozessierung dieser sekundären Läsionen, welche anhand der Abnahme von gammaH2AX-Foci untersucht wurde, war hingegen in der sensitiveren Melanomzelllinie deutlich weniger effektiv. Es konnte weiterhin nachgewiesen werden, dass eine uneffektive Prozessierung der sekundären Läsionen einhergeht mit einer verstärkten und länger anhaltenden Aktivierung der in der DSB-Detektion beteiligten Kinase ATM und der Checkpoint Kinase 1. Es wäre daher denkbar, dass eine verstärkte Aktivität dieser Kinasen proapoptotische Signale vermittelt. Unterschiede in der Prozessierung der sekundären Läsionen könnten somit ein wichtiger Marker der ICL-induzierten Apoptose darstellen. Des weitern konnte nachgewiesen werden, dass nach Fotemustingabe die mitochondrial-vermittelte Apoptose einen effektiven Exekutionsweg in Melanomen darstellt. Während Cytochrom C-Freigabe, Bcl-2-Abnahme an den Mitochondrien, Bax-Rekrutierung und Caspase-9 Aktivität nachgewiesen werden konnten, wurden keine Hinweise auf eine Fas-Rezeptor-vermittelte Apoptose gefunden. Die Unfähigkeit, Rezeptor-vermittelte Apoptose zu unterlaufen, könnte die Bedeutungslosigkeit des p53-Gens in Melanomen begründen, da gerade dieser Weg in der Alkylantien-induzierten Apoptose in anderen Zellsystemen eine große Relevanz besitzt. Bei der Suche nach einem alternativen proapoptotischen Signalweg konnten Hinweise für die Beteiligung des Rb/E2F-1-Wegs, welcher über p73 agiert, in einer p53-mutierten Melanomzelllinie gefunden werden. Einen Einfluss der Proteine Survivin und XIAP als Resistenzfaktoren auf die Fotemustin-induzierte Apoptose wurde hingegen nicht nachgewiesen.

Funktionelle Magnetresonanztomographie mittels simultaner EEG-Registrierung interiktaler Spikes bei fokaler Epilepsie: Vergleich der on-, off- mit der häufigkeitskorrelierten Datenanalyse

Obwohl die funktionelle Magnetresonanztomographie (fMRI) interiktaler Spikes mit simultaner EEG-Ableitung bei Patienten mit fokalen Anfallsleiden seit einigen Jahren zur Lokalisation beteiligter Hirnstrukturen untersucht wird, ist sie nach wie vor eine experimentelle Methode. Um zuverlässig Ergebnisse zu erhalten, ist insbesondere die Verbesserung des Signal-zu-Rausch-Verhältnisses in der statistischen Bilddatenauswertung von Bedeutung. Frühere Untersuchungen zur sog. event-related fMRI weisen auf einen Zusammenhang zwischen Häufigkeit von Einzelreizen und nachfolgender hämodynamischer Signalantwort in der fMRI hin. Um einen möglichen Einfluss der Häufigkeit interiktaler Spikes auf die Signalantwort nachzuweisen, wurden 20 Kinder mit fokaler Epilepsie mit der EEG-fMRI untersucht. Von 11 dieser Patienten konnten die Daten ausgewertet werden. In einer zweifachen Analyse mit dem Softwarepaket SPM99 wurden die Bilddaten zuerst ausschließlich je nach Auftreten interiktaler Spikes der „Reiz“- oder „Ruhe“-Bedingung zugeordnet, unabhängig von der jeweiligen Anzahl der Spikes je Messzeitpunkt (on/off-Analyse). In einem zweiten Schritt wurden die „Reiz“- Bedingungen auch differenziert nach jeweiliger Anzahl einzelner Spikes ausgewertet (häufigkeitskorrelierte Analyse). Die Ergebnisse dieser Analysen zeigten bei 5 der 11 Patienten eine Zunahme von Sensitivität und Signifikanzen der in der fMRI nachgewiesenen Aktivierungen. Eine höhere Spezifität konnte hingegen nicht gezeigt werden. Diese Ergebnisse weisen auf eine positive Korrelation von Reizhäufigkeit und nachfolgender hämodynamischer Antwort auch bei interiktalen Spikes hin, welche für die EEG-fMRI nutzbar ist. Bei 6 Patienten konnte keine fMRI-Aktivierung nachgewiesen werden. Mögliche technische und physiologische Ursachen hierfür werden diskutiert.

Comparative DNA sequence and methylation analyses of orthologous genes in humans and non-human primates: Genetic and epigenetic footprints of evolution

Welche genetische Unterschiede machen uns verschieden von unseren nächsten Verwandten, den Schimpansen, und andererseits so ähnlich zu den Schimpansen? Was wir untersuchen und auch verstehen wollen, ist die komplexe Beziehung zwischen den multiplen genetischen und epigenetischen Unterschieden, deren Interaktion mit diversen Umwelt- und Kulturfaktoren in den beobachteten phänotypischen Unterschieden resultieren. Um aufzuklären, ob chromosomale Rearrangements zur Divergenz zwischen Mensch und Schimpanse beigetragen haben und welche selektiven Kräfte ihre Evolution geprägt haben, habe ich die kodierenden Sequenzen von 2 Mb umfassenden, die perizentrischen Inversionsbruchpunkte flankierenden Regionen auf den Chromosomen 1, 4, 5, 9, 12, 17 und 18 untersucht. Als Kontrolle dienten dabei 4 Mb umfassende kollineare Regionen auf den rearrangierten Chromosomen, welche mindestens 10 Mb von den Bruchpunktregionen entfernt lagen. Dabei konnte ich in den Bruchpunkten flankierenden Regionen im Vergleich zu den Kontrollregionen keine höhere Proteinevolutionsrate feststellen. Meine Ergebnisse unterstützen nicht die chromosomale Speziationshypothese für Mensch und Schimpanse, da der Anteil der positiv selektierten Gene (5,1% in den Bruchpunkten flankierenden Regionen und 7% in den Kontrollregionen) in beiden Regionen ähnlich war. Durch den Vergleich der Anzahl der positiv und negativ selektierten Gene per Chromosom konnte ich feststellen, dass Chromosom 9 die meisten und Chromosom 5 die wenigsten positiv selektierten Gene in den Bruchpunkt flankierenden Regionen und Kontrollregionen enthalten. Die Anzahl der negativ selektierten Gene (68) war dabei viel höher als die Anzahl der positiv selektierten Gene (17). Eine bioinformatische Analyse von publizierten Microarray-Expressionsdaten (Affymetrix Chip U95 und U133v2) ergab 31 Gene, die zwischen Mensch und Schimpanse differentiell exprimiert sind. Durch Untersuchung des dN/dS-Verhältnisses dieser 31 Gene konnte ich 7 Gene als negativ selektiert und nur 1 Gen als positiv selektiert identifizieren. Dieser Befund steht im Einklang mit dem Konzept, dass Genexpressionslevel unter stabilisierender Selektion evolvieren. Die meisten positiv selektierten Gene spielen überdies eine Rolle bei der Fortpflanzung. Viele dieser Speziesunterschiede resultieren eher aus Änderungen in der Genregulation als aus strukturellen Änderungen der Genprodukte. Man nimmt an, dass die meisten Unterschiede in der Genregulation sich auf transkriptioneller Ebene manifestieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Unterschiede in der DNA-Methylierung zwischen Mensch und Schimpanse untersucht. Dazu wurden die Methylierungsmuster der Promotor-CpG-Inseln von 12 Genen im Cortex von Menschen und Schimpansen mittels klassischer Bisulfit-Sequenzierung und Bisulfit-Pyrosequenzierung analysiert. Die Kandidatengene wurden wegen ihrer differentiellen Expressionsmuster zwischen Mensch und Schimpanse sowie wegen Ihrer Assoziation mit menschlichen Krankheiten oder dem genomischen Imprinting ausgewählt. Mit Ausnahme einiger individueller Positionen zeigte die Mehrzahl der analysierten Gene keine hohe intra- oder interspezifische Variation der DNA-Methylierung zwischen den beiden Spezies. Nur bei einem Gen, CCRK, waren deutliche intraspezifische und interspezifische Unterschiede im Grad der DNA-Methylierung festzustellen. Die differentiell methylierten CpG-Positionen lagen innerhalb eines repetitiven Alu-Sg1-Elements. Die Untersuchung des CCRK-Gens liefert eine umfassende Analyse der intra- und interspezifischen Variabilität der DNA-Methylierung einer Alu-Insertion in eine regulatorische Region. Die beobachteten Speziesunterschiede deuten darauf hin, dass die Methylierungsmuster des CCRK-Gens wahrscheinlich in Adaption an spezifische Anforderungen zur Feinabstimmung der CCRK-Regulation unter positiver Selektion evolvieren. Der Promotor des CCRK-Gens ist anfällig für epigenetische Modifikationen durch DNA-Methylierung, welche zu komplexen Transkriptionsmustern führen können. Durch ihre genomische Mobilität, ihren hohen CpG-Anteil und ihren Einfluss auf die Genexpression sind Alu-Insertionen exzellente Kandidaten für die Förderung von Veränderungen während der Entwicklungsregulation von Primatengenen. Der Vergleich der intra- und interspezifischen Methylierung von spezifischen Alu-Insertionen in anderen Genen und Geweben stellt eine erfolgversprechende Strategie dar.

Realisierung der IceCube MonteCarlo-Produktion im WLCG und Untersuchung von Auswirkungen meteorologischer Parameter auf die Erzeugung atmosphärischer Myonen

Das am Südpol gelegene Neutrinoteleskop IceCube detektiert hochenergetische Neutrinos über die schwache Wechselwirkung geladener und neutraler Ströme. Die Analyse basiert auf einem Vergleich mit Monte-Carlo-Simulationen, deren Produktion global koordiniert wird. In Mainz ist es erstmalig gelungen, Simulationen innerhalb der Architektur des Worldwide LHC Computing Grid (WLCG) zu realisieren, was die Möglichkeit eröffnet, Monte-Carlo-Berechnungen auch auf andere deutsche Rechnerfarmen (CEs) mit IceCube-Berechtigung zu verteilen. Atmosphärische Myonen werden mit einer Rate von über 1000 Ereignissen pro Sekunde aufgezeichnet. Eine korrekte Interpretation dieses dominanten Signals, welches um einen Faktor von 10^6 reduziert werden muss um das eigentliche Neutrinosignal zu extrahieren, ist deswegen von großer Bedeutung. Eigene Simulationen mit der Software-Umgebung CORSIKA wurden durchgeführt um die von Energie und Einfallswinkel abhängige Entstehungshöhe atmosphärischer Myonen zu bestimmen. IceCube Myonraten wurden mit Wetterdaten des European Centre for Medium-Range Weather Forcasts (ECMWF) verglichen und Korrelationen zwischen jahreszeitlichen sowie kurzzeitigen Schwankungen der Atmosphärentemperatur und Myonraten konnten nachgewiesen werden. Zudem wurde eine Suche nach periodischen Effekten in der Atmosphäre, verursacht durch z.B. meteorologische Schwerewellen, mit Hilfe einer Fourieranalyse anhand der IceCube-Daten durchgeführt. Bislang konnte kein signifikanter Nachweis zur Existenz von Schwerewellen am Südpol erbracht werden.

Elastizität porenüberspannender Membranen: eine kraftmikroskopische Studie

Membranen spielen eine essentielle Rolle bei vielen wichtigen zellulären Prozessen. Sie ermöglichen die Erzeugung von chemischen Gradienten zwischen dem Zellinneren und der Umgebung. Die Zellmembran übernimmt wesentliche Aufgaben bei der intra- und extrazellulären Signalweiterleitung und der Adhäsion an Oberflächen. Durch Prozesse wie Endozytose und Exozytose werden Stoffe in oder aus der Zelle transportiert, eingehüllt in Vesikel, welche aus der Zellmembran geformt werden. Zusätzlich bietet sie auch Schutz für das Zellinnere. Der Hauptbestandteil einer Zellmembran ist die Lipiddoppelschicht, eine zweidimensionale fluide Matrix mit einer heterogenen Zusammensetzung aus unterschiedlichen Lipiden. In dieser Matrix befinden sich weitere Bausteine, wie z.B. Proteine. An der Innenseite der Zelle ist die Membran über Ankerproteine an das Zytoskelett gekoppelt. Dieses Polymernetzwerk erhöht unter anderem die Stabilität, beeinflusst die Form der Zelle und übernimmt Funktionenrnbei der Zellbewegung. Zellmembranen sind keine homogenen Strukturen, je nach Funktion sind unterschiedliche Lipide und Proteine in mikrsokopischen Domänen angereichert.Um die grundlegenden mechanischen Eigenschaften der Zellmembran zu verstehen wurde im Rahmen dieser Arbeit das Modellsystem der porenüberspannenden Membranen verwendet.Die Entwicklung der porenüberspannenden Membranen ermöglicht die Untersuchung von mechanischen Eigenschaften von Membranen im mikro- bis nanoskopischen Bereich mit rasterkraftmikroskopischen Methoden. Hierbei bestimmen Porosität und Porengröße des Substrates die räumliche Auflösung, mit welcher die mechanischen Parameter untersucht werdenrnkönnen. Porenüberspannende Lipiddoppelschichten und Zellmembranen auf neuartigen porösen Siliziumsubstraten mit Porenradien von 225 nm bis 600 nm und Porositäten bis zu 30% wurden untersucht. Es wird ein Weg zu einer umfassenden theoretischen Modellierung der lokalen Indentationsexperimente und der Bestimmung der dominierenden energetischen Beiträge in der Mechanik von porenüberspannenden Membranen aufgezeigt. Porenüberspannende Membranen zeigen eine linear ansteigende Kraft mit zunehmender Indentationstiefe. Durch Untersuchung verschiedener Oberflächen, Porengrößen und Membranen unterschiedlicher Zusammensetzung war es für freistehende Lipiddoppelschichten möglich, den Einfluss der Oberflächeneigenschaften und Geometrie des Substrates, sowie der Membranphase und des Lösungsmittels auf die mechanischen Eigenschaften zu bestimmen. Es ist möglich, die experimentellen Daten mit einem theoretischen Modell zu beschreiben. Hierbei werden Parameter wie die laterale Spannung und das Biegemodul der Membran bestimmt. In Abhängigkeit der Substrateigenschaften wurden für freitragende Lipiddoppelschichten laterale Spannungen von 150 μN/m bis zu 31 mN/m gefunden für Biegemodulde zwischen 10^(−19) J bis 10^(−18) J. Durch Kraft-Indentations-Experimente an porenüberspannenden Zellmembranen wurde ein Vergleich zwischen dem Modell der freistehenden Lipiddoppelschichten und nativen Membranen herbeigeführt. Die lateralen Spannungen für native freitragende Membranen wurden zu 50 μN/m bestimmt. Weiterhin konnte der Einfluss des Zytoskeletts und der extrazellulä-rnren Matrix auf die mechanischen Eigenschaften bestimmt und innerhalb eines basolateralen Zellmembranfragments kartiert werden, wobei die Periodizität und der Porendurchmesser des Substrates das räumliche Auflösungsvermögen bestimmen. Durch Fixierung der freistehenden Zellmembran wurde das Biegemodul der Membran um bis zu einem Faktor 10 erhöht. Diese Arbeit zeigt wie lokal aufgelöste, mechanische Eigenschaften mittels des Modellsystems der porenüberspannenden Membranen gemessen und quantifiziert werden können. Weiterhin werden die dominierenden energetischen Einflüsse diskutiert, und eine Vergleichbarkeit zurnnatürlichen Membranen hergestellt.rn