Funktionelle Analyse von intrazellulären Signalwegen bei der Migration der embryonalen peripheren Gliazellen von Drosophila melanogaster

Im Rahmen dieser Arbeit wurden Signalwege untersucht, die an der Migration der embryona-len peripheren Gliazellen (ePG) beteiligt sind. Der Fokus lag dabei auf Myoblast city (Mbc). Zunächst wurden dazu unterschiedliche mbc Mutanten analysiert, bei denen es zu starken glialen Migrationsdefekten kommt. Um die auftretenden Phänotypen quantitativ zu analysieren, wurde eine Methode entwickelt um die Position der Pionierglia ePG9 zu bestimmen. Dies ermöglicht es, auch sehr subtile gliale Migrationsphänotypen zu detektieren. Durch knock-down Experimente konnte gezeigt werden, dass Mbc eine zellautonome Rolle bei der glialen Migration spielt. Besonders interessant ist die Tatsache, dass während der Migration der ePG eine alternativ gespleißte Isoform benötigt wird, die bisher kaum untersucht wurde. Durch Strukturvorhersagen konnte gezeigt werden, dass sich der Bereich in dem sich die beiden Isoformen unterscheiden, in einer Region liegt, die sich zu HEAT-repeats faltet. Mbc-PB scheint somit über einen Bereich zu verfügen, der im Vergleich zu Mbc-PA, zusätzliche Interaktionen erlaubt. Zudem scheint es mehrere Phosphorylierungsstellen zu geben, die für die Inaktivierung von Mbc-PB notwendig sind. Die Kinase Wallenda konnte als Kandidat identifiziert werden, der für die Phosphorylierung von Mbc-PB verantwortlich ist. Weitere Experimente zeigten eine einen zellautonomen Einfluss von Mbc-PB auf ePG7, die indirekt die Migration der Pionierglia ePG9 beeinflusst.

Analysen zur molekularen Charakterisierung von Proteinen des humanen Usher-Syndroms und Evaluation genbasierter Therapiestrategien

Analysen zur molekularen Charakterisierung von Proteinen des humanen Usher-Syndroms und Evaluation genbasierter Therapiestrategien rnDas humane Usher Syndrom (USH) ist die häufigste Form vererbter Taub-Blindheit. In der vorliegenden Dissertation wurde diese komplexe Erkrankung auf verschiedenen Ebenen analysiert: in Arbeiten zur Expression und Lokalisation von USH-Proteinen, der Analyse der USH-Proteinnetzwerke und deren Funktionen sowie darauf aufbauend die Entwicklung von Therapiestrategien für USH.rnIm Rahmen der Arbeit wurde die Expression und (sub)-zelluläre Lokalisation des USH1D-Genproduktes CDH23 in der Retina und Cochlea analysiert. CDH23-Isoformen werden in der Maus zeitlich und räumlich differentiell exprimiert. In den Retinae von Mäusen, nicht humanen Primaten und Menschen zeigten Analysen eine unterschiedliche Expression und Lokalisation des Zell-Zelladhäsionsmoleküls CDH23, was auf Funktions-unterschiede der einzelnen Isoformen in den analysierten Spezies hindeutet.rnAnalysen zur Aufklärung der USH-Proteinnetzwerke ergaben eine potentielle Interaktion des USH1G-Gerüstproteins SANS mit dem Golgi- und Centrosom-assoziierten Protein Myomegalin. Die direkte Interaktion der Proteine konnte durch unabhängige Experimente verifiziert werden. Beide Interaktionspartner sind in den Retinae verschiedener Spezies partiell ko-lokalisiert und partizipieren im periciliären USH-Proteinnetzwerk. Die Assoziation von SANS und Myomegalin mit dem Mikrotubuli-Cytoskelett weist auf eine Funktion des Proteinkomplexes in gerichteten Transportprozessen innerhalb der Photorezeptoren hin und bekräftigt die Hypothese einer Rolle von SANS und assoziierten Netzwerken mit Transportprozessen.rnDas hier gewonnene erweiterte Verständnis der molekularen Grundlagen sowie die Aufklärung der zellulären Funktion der Proteinnetzwerke ermöglichen die Entwicklung therapeutischer Strategien für USH. Ein Fokus der vorliegenden Arbeit lag auf der Entwicklung genbasierter Therapiestrategien und deren Evaluation, wobei der Schwerpunkt auf der Therapiestrategie der Genreparatur lag. Die mit Hilfe von Zinkfinger-Nukleasen (ZFN) induzierte Homologe Rekombination für die Genkorrektur wurde exemplarisch an der 91C>T/p.R31X-Mutation im USH1C-Gen gezeigt. Effiziente ZFN wurden identifiziert, generiert und erfolgreich im Zellkulturmodellsystem eingesetzt. Die Analysen demonstrierten eine Reparatur der Mutation durch Homologe Rekombination auf genomischer Ebene und die Expression des wiederhergestellten Proteins. Durch die Genkorrektur im endogenen Lokus sind Größe des Gens, Isoformen oder die Art der Mutation keine limitierenden Faktoren für die Therapie. Die in der vorliegenden Arbeit durchgeführten Experimente unterstreichen das enorme Potential ZFN-basierter Therapiestrategien hin zu personalisierten Therapieformen nicht nur für USH sondern auch für andere erbliche Erkrankungen, deren genetische Grundlagen bekannt sind.rn

Bedeutung von allelen Varianten des Hexose-Transporters Hxt3p und der Hexokinasen Hxk1p und Hxk2p für Aufnahme und Verwertung von Glucose und Fructose durch Weinhefen

In Hinsicht darauf, dass sich S. cerevisiae-Stämme im Laufe der Domestizierung und Anpassung an verschiedene Habitate genetisch verändert haben, wurde in dieser Arbeit eine repräsentative Auswahl von Labor-, kommerziellen und in der Natur vorkommenden Saccharomyces-Stämmen und ihren Interspezies-Hybriden auf die Verbreitung alleler Varianten der Hexokinase-Gene HXK1 und HXK2 getestet. Von den Hexose-Transportern stand Hxt3p im Mittelpunkt, da seine essentielle Rolle bei der Vergärung von Glucose und Fructose bereits belegt wurde.rnIn dieser Arbeit wurde gezeigt, dass es bedeutende Unterschiede in der Vergärung von Glucose und Fructose zwischen Weinhefen der Gattung Saccharomyces gibt, die z.T. mit Struktur-Varianten des Hexose-Transporter Hxt3p korrelieren. rnInsgesamt 51 Hefestämme wurden auf ihre allele Variante des HXT3-Gens untersucht. Dabei haben sich drei Hauptgruppen (die Fermichamp®-Typ Gruppe, Bierhefen und Hybrid-Stämme) mit unterschiedlichem HXT3-Allel ergeben. Im Zusammenhang mit der Weinherstellung wurden signifikante Nukleotid-Substitutionen innerhalb des HXT3-Gens der robusten S. cerevisiae-Stämme (wie z.B. Sekthefen, kommerzielle Starterkulturen) und Hybrid-Stämmen festgestellt. Diese Hefen zeichneten sich durch die Fähigkeit aus, den Most trotz stressigen Umwelt-Bedingungen (wie hohe Ethanol-Konzentration, reduzierter Ammonium-Gehalt, ungünstiges Glucose:Fructose-Verhältnis) zu vergären. rnDie Experimente deuten darauf hin, dass die HXT3-Allel-Variante des als Starterkultur verwendbaren Stammes Fermichamp®, für den verstärkten Fructose-Abbau verantwortlich ist. Ein gleiches Verhalten der Stämme mit dieser Allel-Variante wurde ebenfalls beobachtet. Getestet wurden die S. cerevisiae-Stämme Fermichamp® und 54.41, die bezüglich Hxt3p-Aminosäuresequenz gleich sind, gegenüber zwei S. cerevisiae-Stämmen mit dem HXT3-Standard-Alleltyp Fermivin® und 33. Der Unterschied in der Hexose-Verwertung zwischen Stämmen mit Fermichamp®- und Standard-Alleltyp war in der Mitte des Gärverlaufs am deutlichsten zu beobachten. Beide Gruppen, sowohl mit HXT3 Fermichamp®- als auch Fermivin®-Alleltyp vergoren die Glucose schneller als die Fructose. Der Unterschied aber zwischen diesen HXT3-Alleltypen bei der Zucker-Verwertung lag darin, dass der Fermichamp®-Typ eine kleinere Differenz in der Abbau-Geschwindigkeit der beiden Hexosen zeigte als der Fermivin®-Typ. Die Zuckeraufnahme-Messungen haben die relativ gute Fructose-Aufnahme dieser Stämme bestätigt.rnEbenfalls korrelierte der fructophile Charakter des Triple-Hybrides S. cerevisiae x S. kudriavzevii x S. bayanus-Stamm HL78 in Transportexperimenten mit verstärkter Aufnahme von Fructose im Vergleich zu Glucose. Insgesamt zeigte dieser Stamm ähnliches Verhalten wie die S. cerevisiae-Stämme Fermichamp® und 54.41. rnIn dieser Arbeit wurde ein Struktur-Modell des Hexose-Transporters Hxt3p erstellt. Als Basis diente die zu 30 % homologe Struktur des Proton/Xylose-Symporters XylE aus Escherichia coli. Anhand des Hxt3p-Modells konnten Sequenzbereiche mit hoher Variabilität (Hotspots) in drei Hxt3p-Isoformen der Hauptgruppen (die Fermichamp®-Typ Gruppe, Bierhefen und Hybrid-Stämme) detektiert werden. Diese signifikanten Aminosäure-Substitutionen, die eine mögliche Veränderung der physikalischen und chemischen Eigenschaften des Carriers mit sich bringen, konzentrieren sich auf drei Bereiche. Dazu gehören die Region zwischen den N- und C-terminalen Domänen, die cytosolische Domäne und der Outside-Loop zwischen Transmembranregion 9 und Transmembranregion 10. rnObwohl die Transportmessungen keinen Zusammenhang zwischen Stämmen mit unterschiedlichen HXT3-Allelen und ihrer Toleranz gegenüber Ethanol ergaben, wurde ein signifikanter Anstieg in der Zuckeraufnahme nach vorheriger 24-stündiger Inkubation mit 4 Vol% Ethanol bei den Teststämmen beobachtet. rnInsgesamt könnten allele Varianten von HXT3-Gen ein nützliches Kriterium bei der Suche nach robusten Hefen für die Weinherstellung oder für andere industrielle Anwendungen sein. Die Auswirkung dieser Modifikationen auf die Struktur und Effizienz des Hexose-Transporters, sowie der mögliche Zusammenhang mit Ethanol-Resistenz müssen weiter ausführlich untersucht werden. rnEin Zusammenhang zwischen den niedrig variablen Allel-Varianten der Hexokinase-Gene HXK1 und HXK2 und dem Zucker-Metabolismus wurde nicht gefunden. Die Hexokinasen der untersuchten Stämme wiesen allerdings generell eine signifikante geringere Affinität zu Fructose im Vergleich zu Glucose auf. Hier liegt sicherlich eine Hauptursache für den Anstieg des Fructose:Glucose-Verhältnisses im Laufe der Vergärung von Traubenmosten.rn