Dynamics of small interfering RNA - FRET based integrity measurements of siRNA in the cuvette & inside cells

RNAi ist ein bedeutendes Werkzeug zur Funktionsanalyse von Genen und hat gro��es Potential f��r den Einsatz in der Therapie. Obwohl ef���ziente Knockdowns in der Zellkultur erzielt werden, erweist sich eine in vivo Anwendung als schwierig. Die gro��en H��rden sind dabei der Transport der siRNA ins Zielgewebe und deren voranschreitende Degradierung.rnMarkierte siRNA kann sowohl zur eigenen Integrit��tsmessung als auch zur Lokalisierung verwendet werden. Zwei Farbstoffe an den jeweiligen 3���- bzw. -5���-Enden des Sense- bzw. Antisense-Stranges erzeugen ein robustes FRET-System (Hirsch et al. 2012). Das Verh��ltnis von FRET- zu Donor-Signal, das R/G-Ratio, dient zur sensitiven Klassi���zierung des Integrit��tslevels einer siRNA Probe (J��rve et al. 2007; Hirsch et al. 2011; Kim et al. 2010). Mit diesem System kann eine Degradierung von weniger als 5 % in der K��vette und in Zellen nachgewiesen werden.rnDie vorliegende Arbeit besch��ftigt sich mit der Evaluierung von potentiellen FRET Farbstoffpaaren hinsichtlich deren Eignung f��r in vitro und in vivo Anwendung. Verschiedenste FRET-Paare, die das gesamte sichtbare Spektrum abdecken, wurden evaluiert und erm��glichen nun die Auswahl eines geeigneten Paares f��r die jeweilige Anwendung oder Kombination mit anderen Farbstoffen.rnMit Hilfe von Alexa555/Atto647N siRNA wurde ein erfolgreicher Einschluss von siRNA in Liposomen beobachtet. Eine anschlie��ende Evaluierung der RNase-Protektion ergab f��r Liposomen, Nanohydrogele und kationische Peptide hervorragende protektive Eigenschaften. Basierend auf den Ergebnisse k��nnen diese und andere Transportsysteme nun f��r eine zellul��re Aufnahme optimiert werden.rnAtto488/Atto590 zeigte die besten Eigenschaften f��r Echtzeit-Integrit��tsmessungen in der Lebendzellmikroskopie. Verringerte Bleicheigenschaften und minimaler spektraler ���Cross-Talk��� erm��glichten es, trans���zierte Zellen ��ber einen Zeitraum von bis zu 8 Stunden zu beobachten. Mittels Atto488/Atto590 siRNA wurde die Einschleusung und Freisetzung in Zellen in Echtzeit untersucht. Dabei konnten Freisetzung und Verteilung in einzelnen Zellen beobachtet und analysiert werden. rnAuf eine anf��ngliche Phase mit hoher Freisetzungsrate folgte eine Phase mit geringerer Rate f��r den restlichen Beobachtungszeitraum. Die durchschnittliche Verweildauer im Zytosol betrug 24 und 58 Minuten, wobei zwischen lang- und kurzanhaltenden Ereignissen unterschieden werden konnte. Obwohl ein Import von siRNA in den Zellkern beobachtet wurde, konnte kein Schema bzw. genauer Zeitpunkt, in Bezug auf den Transfektionszeitraum f��r diese Ereignisse bestimmt werden. Die beobachteten Freisetzungsprozesse fanden sporadisch statt und ��nderungen in der zellul��ren Verteilung geschahen innerhalb von wenigen Minuten. Einmal freigesetzte siRNA verschwand mit der Zeit wieder aus dem Zytosol und es blieben nur kleine Aggregate von siRNA mit immer noch geringer Integrit��t zur��ck.rn

Optimization of RNA-based transgene expression by targeting Protein Kinase R

The aim of this thesis was to establish a method for repeated transfection of in vitro transcribed RNA (IVT-RNA) leading to a sustained protein expression lasting for days or even weeks. Once transfected cells recognize IVT-RNA as "non-self" and initiate defense pathways leading to an upregulated interferon (IFN) response and stalled translation. In this work Protein Kinase R (PKR) was identified as the main effector molecule mediating this cellular response. We assessed four strategies to inhibit PKR and the IFN response: A small molecule PKR inhibitor enhanced protein expression and hampered the induction of IFN-transcripts, but had to be excluded due to cytotoxicity. A siRNA mediated PKR knockdown and the overexpression of a kinase inactive PKR mutant elevated the protein expression, but the down-regulation of the IFN response was insufficient. The co-transfer of the viral inhibitors of PKR and the IFN response was most successful. The use of E3, K3 and B18R co-transfection enabled repeated IVT-RNA-based transfection of human fibroblasts. Thus, the developed protocol allows a continuous IVT-RNA encoded protein expression of proteins, which could be the basis for the generation of induced pluripotent stem cells (iPS) for several therapeutic applications in regenerative medicine or drug research.

Erkennung der alpha-Kette des GM-CSF-Rezeptors (CSF2RA) durch einen HLA-unabh��ngigen alpha:beta-T-Zellrezeptor

Aus dem tumorreaktiven T-Zellrepertoire der Melanompatientin Ma-Mel-86/INTH, bei der im Verlauf Lymphknotenmetastasen HLA-Klasse I-negativer Tumorzellen auftraten, wurden durch Stimulation mit autologen Tumorzellen CD8+ T-Zellklone isoliert und expandiert, die auf Melanomzellen der Patientin CSF2RA (engl. GM-CSF receptor alpha chain) in HLA-unabh��ngiger Weise erkannten. Aus einem der T-Zellklone wurde ein CSF2RA-reaktiver ��:��-T-Zellrezeptor (TCR, engl. T-cell receptor) kloniert (Bezeichnung: TCR-1A.3/46). Die ��-Kette des TCR enthielt die Dom��nen TRAV14/DV4*01, TRAJ48*01 und TRAC*01, die ��-Kette die Dom��nen TRBV10-3*01, TRBD2*01, TRBJ2-7*01 und TRBC2*01. Durch Austausch der humanen konstanten gegen die homologen murinen Dom��nen wurde der TCR optimiert (Bezeichnung: cTCR-1A.3/46) und hinsichtlich seiner Expression und Funktionalit��t nach retroviralem Transfer in humane PBMC (engl. peripheral blood mononuclear cells) im 51Chromfreisetzungstest, im IFN-��-ELISpot-Assay und in einem Degranulations-Assay validiert. TCR-transgene T-Zellen lysierten nicht nur spezifisch die HLA-defizienten, CSF2RA+ Melanomlinien des Modells Ma-Mel-86, sondern erkannten auch Zelllinien verschiedener Spezies nach Transfektion von CSF2RA sowie Monozyten, Granulozyten, dendritische Zellen und ein breites Spektrum h��matologischer Malignome myeloiden Ursprungs ungeachtet deren HLA-Ph��notypen. Lymphatische Zellen sowie CD34+ Blutstammzellen wurden in In vitro-Untersuchungen nicht erkannt. Der Zusatz von GM-CSF zu Zellen, die CSF2RA und CSF2RB exprimierten, inhibierte die Erkennung durch TCR-transgene PBMC, w��hrend die Koexpression der ��- und der ��-Kette des GM-CSF-Rezeptors alleine keinen negativen Effekt auf die Erkennung hatte. Daraus war zu schlie��en, dass CSF2RA pr��ferentiell freistehend und weniger nach Integration in den heteromultimerischen GM-CSF-Rezeptor-Komplex erkannt wurde. In der zweidimensionalen Collier-de-Perles-Visualisierung der IMGT-Datenbank (engl. International immunogenetics information system) wies der CSF2RA-reaktive TCR-1A.3/46 im Vergleich zu TCR von konventionellen, HLA-restringierten T-Zellen keine Besonderheiten auf. Dar��ber hinaus waren auch die von den HLA-unabh��ngigen T-Zellen exprimierten CD8-Molek��le identisch zu den CD8-Molek��len HLA-abh��ngiger CTL (engl. cytotoxic T lymphocytes). Die Pr��senz von CD8-Molek��len f��rderte die HLA-unabh��ngige Erkennung von CSF2RA, schien aber daf��r nicht zwingend erforderlich zu sein, da Antik��rper gegen CD8 die Erkennung zu ca. 65 % blockierten und TCR-transgene CD4+ T-Zellen im Vergleich zu TCR-transduzierten CD8+ T-Zellen eine deutlich verringerte, aber noch erhaltene Funktionalit��t aufwiesen. Es ist derzeit nicht klar, ob HLA-unabh��ngige T-Zellen gegen CSF2RA im peripheren Blut der Patientin vorkamen, weil sie der im Tiermodell postulierten Thymusselektion MHC-unabh��ngiger TCR (Tikhonova et al., Immunity 36:79, 2012) entkommen waren, oder weil ein urspr��nglich gegen einen HLA-Peptid-Komplex gerichteter TCR eine HLA-unabh��ngige Kreuzreaktivit��t aufwies. CSF2RA verbessert die Glucoseutilisation in malignen Zellen, und es wurden ihm embryotrophe Eigenschaften zugeschrieben (Spielholz et al., Blood 85:973, 1995; Sj��blom et al., Biol. Reprod. 67:1817, 2002). Damit kann CSF2RA malignes Wachstum f��rdern und ist somit ein potentielles Zielmolek��l f��r die Immuntherapie. Seine HLA-unabh��ngige Erkennung w��rde sowohl die HLA-Vielfalt als auch den HLA-Verlust als typische Limitationen der T-Zellimmuntherapie umgehen. Zur ��berpr��fung der In vivo-Spezifit��t des HLA-unabh��ngigen TCR gegen CSF2RA und damit zum Ausschluss relevanter off-tumor-/on-target- bzw. off-tumor-/off-target-Effekte ist jedoch eine Testung in einem pr��klinischen Tiermodell erforderlich.

Einfluss von Uracil in der DNA auf die Genexpression : die Rolle der Basen-Exzisions-Reparatur

Uracil ist eine der am h��ufigsten vorkommenden DNA-Basenmodifikationen, die ��ber den Mechanismus der Basen-Exzisions-Reparatur (BER) aus dem Genom entfernt wird. Im Verlauf der Reparatur dieser L��sion durch monofunktionelle Uracil-DNA-Glykosylasen (UNG1/2, SMUG1, TDG und MBD4) entstehen AP-L��sionen und Einzelstrangbr��che. Da von beiden bekannt ist, eine Blockade der Transkription verursachen zu k��nnen, wurde in dieser Arbeit der Einfluss von Uracil und dessen Exzision auf die Expression eines Gens untersucht. Daf��r wurde eine effiziente Methode entwickelt, die DNA-Basenmodifikation spezifisch in den transkribierten oder nicht-transkribierten DNA-Strang eines Reporter-Vektors einzuf��gen. rnIn Host cell reactivation Assays konnte gezeigt werden, dass Uracil unabh��ngig davon, ob es mit Adenin gepaart (U:A) oder mit Guanin (U:G) eine Fehlpaarung bildet, keine direkte Blockade der Transkriptions-Maschinerie in menschlichen Zellen auszul��sen vermag. Dies kann daraus geschlossen werden, dass die Expression des Reportergens der Uracil-enthaltenen Vektoren im Vergleich zu unmodifizierten Referenz-Vektoren kurze Zeit nach der Transfektion unver��ndert ist. Die erst mit zunehmender Inkubationszeit in den Wirtszellen progressiv abnehmende Transkription lie�� vermuten, dass die intrazellul��re Prozessierung der L��sion ��ber die BER f��r die verringerte Genexpression verantwortlich ist. In der Tat bewirkte der Knockdown der BER-initiierenden UNG1/2, die Uracil aus der DNA herausschneidet und damit eine AP-L��sion generiert, eine Verringerung des negativen Effektes eines U:A-Basenpaares auf die Genexpression. Dass der Knockdown der SMUG1- oder TDG-Glykosylase hingegen keine Auswirkungen zeigte, beweist, dass UNG1/2 die Hauptglykosylase f��r die Exzision dieser L��sion und der Ausl��ser der inhibierten Transkription in HeLa-Zellen darstellt. Der Zusammenhang zwischen dem Ma�� des Ausschnitts einer DNA-Basenmodifikation im Verlauf der BER und einer verringerten Expression des Reportergens konnte zudem am Beispiel von 5-Hydroxymethyluracil und der f��r diese L��sion spezifischen SMUG1-Glykosylase nachgewiesen werden. Im Falle einer U:G-Fehlpaarung besa�� weder UNG1/2 noch SMUG1 oder TDG einen Einfluss auf die Rate oder das Ausma�� der mit der Zeit abnehmenden Genexpression, was die Beteiligung einer anderen Glykosylase oder eines anderen Reparatur-Mechanismus vermuten l��sst. rnDie Tatsache, dass die St��rke der Gen-Suppression unabh��ngig davon war, ob Uracil im transkribierten oder nicht-transkribierten DNA-Strang positioniert wurde, l��sst die Mutma��ung zu, dass keine Blockade der elongierenden RNA-Polymerase, sondern vielmehr ein indirekter Mechanismus der Ausl��ser f��r die verringerte Transkription ist. Dieser Mechanismus muss unabh��ngig von der gut untersuchten transkriptionsgekoppelten Nukleotid-Exzisions-Reparatur erfolgen, da der Knockdown des hierf��r ben��tigten CSB-Gens keine Auswirkungen auf die Inhibition der Genexpression der Uracil-enthaltenen Vektoren hatte. Insgesamt liefert diese Arbeit neue Erkenntnisse ��ber den Beitrag der einzelnen Uracil-DNA-Glykosylasen zur Reparatur der DNA-Basenmodifikation Uracil in humanen Zellen und zeigt, dass die BER ��ber einen indirekten Mechanismus die Hemmung der Genexpression verursacht.

Analysen zur molekularen Charakterisierung von Proteinen des humanen Usher-Syndroms und Evaluation genbasierter Therapiestrategien

Analysen zur molekularen Charakterisierung von Proteinen des humanen Usher-Syndroms und Evaluation genbasierter Therapiestrategien rnDas humane Usher Syndrom (USH) ist die h��ufigste Form vererbter Taub-Blindheit. In der vorliegenden Dissertation wurde diese komplexe Erkrankung auf verschiedenen Ebenen analysiert: in Arbeiten zur Expression und Lokalisation von USH-Proteinen, der Analyse der USH-Proteinnetzwerke und deren Funktionen sowie darauf aufbauend die Entwicklung von Therapiestrategien f��r USH.rnIm Rahmen der Arbeit wurde die Expression und (sub)-zellul��re Lokalisation des USH1D-Genproduktes CDH23 in der Retina und Cochlea analysiert. CDH23-Isoformen werden in der Maus zeitlich und r��umlich differentiell exprimiert. In den Retinae von M��usen, nicht humanen Primaten und Menschen zeigten Analysen eine unterschiedliche Expression und Lokalisation des Zell-Zelladh��sionsmolek��ls CDH23, was auf Funktions-unterschiede der einzelnen Isoformen in den analysierten Spezies hindeutet.rnAnalysen zur Aufkl��rung der USH-Proteinnetzwerke ergaben eine potentielle Interaktion des USH1G-Ger��stproteins SANS mit dem Golgi- und Centrosom-assoziierten Protein Myomegalin. Die direkte Interaktion der Proteine konnte durch unabh��ngige Experimente verifiziert werden. Beide Interaktionspartner sind in den Retinae verschiedener Spezies partiell ko-lokalisiert und partizipieren im pericili��ren USH-Proteinnetzwerk. Die Assoziation von SANS und Myomegalin mit dem Mikrotubuli-Cytoskelett weist auf eine Funktion des Proteinkomplexes in gerichteten Transportprozessen innerhalb der Photorezeptoren hin und bekr��ftigt die Hypothese einer Rolle von SANS und assoziierten Netzwerken mit Transportprozessen.rnDas hier gewonnene erweiterte Verst��ndnis der molekularen Grundlagen sowie die Aufkl��rung der zellul��ren Funktion der Proteinnetzwerke erm��glichen die Entwicklung therapeutischer Strategien f��r USH. Ein Fokus der vorliegenden Arbeit lag auf der Entwicklung genbasierter Therapiestrategien und deren Evaluation, wobei der Schwerpunkt auf der Therapiestrategie der Genreparatur lag. Die mit Hilfe von Zinkfinger-Nukleasen (ZFN) induzierte Homologe Rekombination f��r die Genkorrektur wurde exemplarisch an der 91C>T/p.R31X-Mutation im USH1C-Gen gezeigt. Effiziente ZFN wurden identifiziert, generiert und erfolgreich im Zellkulturmodellsystem eingesetzt. Die Analysen demonstrierten eine Reparatur der Mutation durch Homologe Rekombination auf genomischer Ebene und die Expression des wiederhergestellten Proteins. Durch die Genkorrektur im endogenen Lokus sind Gr����e des Gens, Isoformen oder die Art der Mutation keine limitierenden Faktoren f��r die Therapie. Die in der vorliegenden Arbeit durchgef��hrten Experimente unterstreichen das enorme Potential ZFN-basierter Therapiestrategien hin zu personalisierten Therapieformen nicht nur f��r USH sondern auch f��r andere erbliche Erkrankungen, deren genetische Grundlagen bekannt sind.rn