Differenzierung von Reviergesängen und mitochondrialem Cytochrom-b in drei ausgewählten Singvogelgattungen (Aves, Passeriformes: Genus Regulus, Genus Seicercus und Parus major)

ZusammenfassungLautäußerungen von Singvögeln (Passeriformes) werden gemeinhin als Träger phylogenetischer Information betrachtet, obwohl direkte Nachweise in vergleichend bioakustischen Studien rar sind. Dieser Thematik widmet sich meine Dissertation am Beispiel dreier Singvogelgruppen: Goldhähnchen (Regulus), Goldbrillenlaubsänger (Seicercus) sowie verwandter Laubsänger (Phylloscopus) und Kohlmeisen (Parus major). Neben der Erhebung bioakustischer Daten wurde für jede Gruppe eine molekulare Phylogenie basierend auf Cytochrom-b-Sequenzen erstellt und für verschiedene akustische Merkmale Homoplasie-indizes berechnet (CI, RI und RC). Die phylogenetisch informativen Gesangsstrukturen innerhalb der Gattungen Regulus und Seicercus/ Phylloscopus sind sämtlich Syntaxmerkmale, zumeist der Gesamtstrophe, seltener von Strophenabschnitten. Bei den Goldhähnchen (Regulus) sind solche Syntaxmerkmale angeboren, Elementmerkmale hingegen sind erlernt und phylogenetisch nicht informativ. Die innerhalb der Kohlmeisen homogene Gesangssyntax ist erst auf höherer taxonomischer Ebene (Gattung Parus) ein informatives Merkmal. Der mittels einer Merkmalsmatrix berechnete akustische Divergenzindex zwischen Taxonpaaren steigt signifikant proportional zur genetischen Distanz. Damit ist erstmalig der Zusammenhang zwischen genetischer und akustischer Differenzierung quantifiziert. Die molekulare Phylogenie erhellt zudem bislang ungeklärte phylogenetische Beziehungen innerhalb aller drei Taxa. Diese werden im Hinblick auf das phylogenetische und das biologische Artkonzept diskutiert. Der Artstatus des Teneriffa-Goldhähnchens (Regulus teneriffae) sowie der bokharensis-Kohlmeisen ist fragwürdig aufgrund ihrer engen Verwandtschaft zu zu einzelnen Subspezies der Wintergoldhähnchen bzw. der Kohlmeisen.

Immune escape durch Überexpression von HER-2/neu

In Tumoren und Onkogen-transformierten Zellen finden sich häufig Defizienzen in der Expression von Komponenten der MHC Klasse I-Antigenprozessierung, die mit einer verminderten MHC Klasse I-Oberflächenexpression und einer reduzierten Sensitivität der Zellen gegenüber einer ZTL-vermittelten Lyse gekoppelt sein können. Da in den meisten Fällen die reduzierten Expressionsmuster über Zytokine revertiert werden können, werden verschiedene Regulationsmechanismen als Ursache für die Defizienzen postuliert. Auch in Zellen, die den „human epidermal growth factor receptor 2“ (HER-2/neu) überexprimieren, wurden derartige „Immune escape“-Mechanismen identifiziert. Aufgrund der Amplifikation und/oder Überexpression dieses Onkogens in Tumoren, die mit einer schnellen Progression der Erkrankung und einer schlechten Heilungsprognose assoziiert ist, wurden zahlreiche Therapien entwickelt, die auf einer Mobilisierung des Immunsystems gegenüber HER-2/neu oder dessen Blockade durch spezifische Antikörper abzielen. Die bisher jedoch nur unzureichenden Erfolge dieser Therapien könnten ihre Ursache in einer verminderten Immunogenität der HER-2/neu+-Zellen aufgrund von Defizienzen in der MHC Klasse I-Antigenprozessierung haben, weshalb die Untersuchung der molekularen Ursachen dieser Suppression für die Therapie von HER-2/neu+-Tumoren von besonderer Bedeutung ist. In dieser Arbeit wurde anhand eines in vitro-Systems ein HER-2/neu-vermittelter „Immune escape“-Phänotyp charakterisiert und die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen untersucht. Hierzu wurden murine, HER-2/neu--NIH3T3-Zellen mit HER-2/neu-transfizierten NIH3T3-Zellen verglichen. Die Untersuchung zeigte, dass die Oberflächenexpression von MHC Klasse I-Antigenen bei einer HER-2/neu-Überexpression vermindert ist. Dies ist assoziiert mit reduzierten Expressionen von LMP2, LMP10, PA28a, PA28b, ERAAP, TAP1, TAP2, und Tapasin, einem blockiertem TAP-Transport und einer fehlenden Sensitivität gegenüber einer ZTL-vermittelten Lyse. Da die analysierten Defekte durch eine Stimulation mit IFN‑g wieder revertiert werden können, wird eine transkriptionelle oder translationelle Regulation der betroffenen Gene durch HER-2/neu postuliert. Aufgrund dieser Ergebnisse ist eine T-Zell-vermittelte Therapie von HER-2/neu+-Tumoren als kritisch anzusehen. Die Untersuchung der Promotoren von TAP1/LMP2, TAP2 und Tapasin ergab geringere und durch IFN‑g-induzierbare Promotoraktivitäten in den HER-2/neu+-Zellen im Vergleich zu den HER-2/neu—-Zellen. Mittels Mutagenese-PCR und Gelretardationsanalysen konnte die Bindung eines Komplexes an zwei E2F- und einer P300-Bindungsstelle im Tapasin-Promotor identifiziert werden, die für die HER-2/neu-vermittelte Hemmung der Tapasin-Promotor­aktivität essentiell ist. Eine Inaktivierung der E2F- und P300-Motve in den TAP1/LMP2- und TAP2-Promotoren hatte dagegen keinen Einfluss auf die HER-2/neu-vermittelte Blockade der Promotoraktivität. Ein Vergleich der Promotoraktivitäten der HER-2/neu+- mit Ras-transformierten Zellen ergab, dass die TAP1/LMP2- und TAP2-Promotoren in beiden Zellen supprimiert werden, während der Tapasin-Promotor bei Ras-Transformation nicht beein­trächtigt ist. Der Einsatz von Inhibitoren zeigte, dass die Suppression des Tapasin-Promotors vermutlich über die PLC-g-PKC-Kaskade erfolgt. Dagegen konnte mit Inhibitoren gegen MAPK und PI3Kinase kein vergleichbarer Effekt erzielt werden. Aufgrund dieser Daten wird postuliert, dass HER-2/neu über die Signalkaskade PLC-g–PKC–E2F/P300 die Tapasin-Promotoraktivität supprimiert, wohingegen noch bisher unbekannte Signalkaskaden von HER-2/neu und Ras zu einer Hemmung der TAP1/LMP2- und TAP2-Promotoraktivität führen. Da die Komplexbildung von E2F und P300 auch im Zellzyklus eine Rolle spielt, wird eine negative Korrelation zwischen Zell-Proliferation und MHC Klasse I-Antigenpräsentation postuliert, die Gegenstand künftiger Studien sein wird.

Synthese, 11 C- und 18 F-Markierung und Evaluierung von Repaglinid-Derivaten zur Quantifizierung der pankreatischen beta-Zell-Masse in vivo mittels PET

Diabetes mellitus umfasst eine heterogene Gruppe von Stoffwechselfunktionsstörungen, die durch hohe Blut-Glukose-Werte gekennzeichnet sind. Zwei Haupttypen von Diabetes mellitus wurden definiert: Typ 1- und Typ 2-Diabetes. Repaglinid ist ein neuer, schnell wirksamer, bei Typ 2-Diabetikern eingesetzter prandialer Glukose-Regulator mit einer kurzen Plasmahalbwertszeit (<1 Stunde) und der erste Vertreter der Carbamoylmethylbenzoesäure Familie, der in klinischen Studien getestet wurde. Die 18F- und 11C-markierten Repaglinid-Derivate (S)-2-(2-[18F]Fluorethoxy)-4-((3-methyl-1-(2-piperidin-1-yl-phenyl)-butylcarbamoyl)-methyl)-benzoesäure ([18F]Fluorethoxy-desethoxy-Repaglinid) und (S)-2-([11C]Methoxy)-4-([3-methyl-1-(2-piperidin-1-yl-phenyl)-butyl-carba-moyl]-benzoesäure ([11C]Methoxy-desethoxy-Repaglinid) wurden als potentielle Tracer für die nicht-invasive Quantifizierung des Sulfonylharnstoffrezeptor-Typ1-Status (SUR-1) der Insulin-sezernierenden -Zellen mittels Positronen-Emissions-Tomographie (PET) synthetisiert. [18F]Fluorethoxy-desethoxy-Repaglinide konnte in einer radiochemischen Ausbeute (RCA) von 20% nach 135 Minuten mit einer radiochemischen Reinheit >98% unter Verwendung des sekundären Markierungsvorläufers 2-[18F]Fluorethyltosylat erhalten werden. Die spezifische Aktivität lag im Bereich von 50-60 GBq/µmol. Für die radioaktive Synthese des [11C]Methoxy-desethoxy-Repaglinids wurde der sekundäre Markierungsvorläufer [11C]Methyliodid verwendet. Der 11C-Radiotracer wurde in einer RCA von 35% (bezogen auf [11C]CO2) mit einer spezifischen Aktivität von 40-70 GBq/µmol erhalten. Um die Eigenschaften des fluorierten sowie des methoxylierten Repaglinids zu charakterisieren, wurde die Affinität beider Verbindungen zum humanen SUR-1 evaluiert. [19F]Fluorethoxy-desethoxy-Repaglinid und Methoxy-desethoxy-Repaglinid induzierten Verdrängungskurven mit Hill-Koeffizienten nahe 1 und ergaben Dissotiationskonstanten (KD) von 142 nM beziehungsweise 83 nM - vergleichsweise geringe Verluste relativ zu Original-Repaglinid. Die biologische Aktivität wurde mittels Insulin-Sekretionstests an isolierten Ratten-Inselzellen gezeigt und war ebenfalls mit der des Repaglinids vergleichbar. Schließlich wurde die Biodistribution des [18F]Fluorethoxy-desethoxy-Repaglinids in gesunden Sprague-Dawley-Ratten durch Messung der Konzentration der Verbindung in verschiedenen Organen nach intravenöser Injektion untersucht. Das pankreatische Gewebe zeigte im Zeitintervall zwischen 10 und 30 Minuten nach Injektion eine stabile Akkumulation von etwa 0.12% der injizierten Dosis. 50% dieser Tracer-Akkulmulation konnten durch zusätzliche Injektion von nicht-radioaktiv-markiertem Repaglinid verdrängt werden, was auf eine mögliche Eignung des [18F]Fluorethoxy-desethoxy-Repaglinids für in vivo-Untersuchungen mittels PET schließen lässt. Eine erste humane PET-Studie zeigte zwar ebenfalls eine stabile, allerdings nur geringere Akkumulation von [18F]Fluorethoxy-desethoxy-Repaglinid im Pankreas und eine überproportional hohe Aktivitätsanreicherung in der Leber. Die Radioaktivitäts-akkumulation im Blut fiel nach wenigen Minuten unter die des Pankreas.

Untersuchung der Pigment- und Proteinzusammensetzung der peripheren Lichtsammelantenne des Photosystem I

Die Lichtsammelantenne des PSI (LHCI) ist hinsichtlich ihrer Protein- und Pigmentzusammensetzung weniger gut untersucht als die des PSII. Im Rahmen dieser Arbeit wurde deshalb zunächst die Isolation von nativen LHCI-Subkomplexen optimiert und deren Pigmentzusammensetzung untersucht. Zusätzlich wurde die Pigmentbindung analysiert sowie das Pigment/Protein-Verhältnis bestimmt. Die Analyse der Proteinzusammensetzung des LHCI erfolgte mittels einer Kombination aus ein- oder zweidimensionaler Gelelektrophorese mit Westernblotanalysen mit Lhca-Protein-spezifischen Antikörpern und massenspektrometrischen Untersuchungen. Dabei stellte sich heraus, dass der LHCI mehr Proteine bzw. Proteinisoformen enthält als bisher vermutet. So gelang durch die massenspektrometrischen Untersuchungen die Identifizierung zweier bisher noch nicht nachgewiesener Lhca-Proteine. Bei diesen handelt es sich um eine Isoform des Lhca4 und ein zusätzliches Lhca-Protein, das Tomaten-Homolog des Lhca5 von Arabidopsis thaliana. Außerdem wurden in 1D-Gelen Isoformen von Lhca-Proteinen mit unterschiedlichem elektrophoretischen Verhalten beobachtet. In 2D-Gelen trat zusätzlich eine große Anzahl an Isoformen mit unterschiedlichen isoelektrischen Punkten auf. Es ist zu vermuten, dass zumindest ein Teil dieser Isoformen physiologischen Ursprungs ist, und z.B. durch differentielle Prozessierung oder posttranslationale Modifikationen verursacht wird, wenn auch die Spotvielfalt in 2D-Gelen wohl eher auf die Probenaufbereitung zurückzuführen ist. Mittels in vitro-Rekonstitution mit anschließenden biochemischen Untersuchungen und Fluoreszenzmessungen wurde nachgewiesen, dass Lhca5 ein funktioneller LHC mit spezifischen Pigmentbindungseigenschaften ist. Außerdem zeigten in vitro-Dimerisierungsexperimente eine Interaktion zwischen Lhca1 und Lhca5, wodurch dessen Zugehörigkeit zur Antenne des PSI gestützt wird. In vitro-Dimerisierungsexperimente mit Lhca2 und Lhca3 führten dagegen nicht zur Bildung von Dimeren. Dies zeigt, dass die Interaktion in potentiellen Homo- oder Heterodimeren aus Lhca2 und/oder Lhca3 schwächer ist als die zwischen Lhca1 und Lhca4 oder Lhca5. Die beobachtete Proteinheterogenität deutet daraufhin, dass die Antenne des PSI eine komplexere Zusammensetzung hat als bisher angenommen. Für die Integration „neuer“ LHC in den PSI-LHCI-Holokomplex werden zwei Modelle vorgeschlagen: geht man von einer festen Anzahl von LHCI-Monomeren aus, so kann sie durch den Austausch einzelner LHC-Monomere erreicht werden. Als zweites Szenario ist die Bindung zusätzlicher LHC vorstellbar, die entweder indirekt über bereits vorhandene LHC oder direkt über PSI-Kernuntereinheiten mit dem PSI interagieren. In Hinblick auf die Pigmentbindung der nativen LHCI-Subfraktionen konnte gezeigt werden, dass sie Pigmente in einer spezifischen Stöchiometrie und Anzahl binden, und sich vom LHCIIb vor allem durch eine verstärkte Bindung von Chlorophyll a, eine geringere Anzahl von Carotinoiden und die Bindung von ß-Carotin an Stelle von Neoxanthin unterscheiden. Der Vergleich von nativem LHCI mit rekonstituierten Lhca-Proteinen ergab, dass Lhca-Proteine Pigmente in einer spezifischen Stöchiometrie binden, und dass sie Carotinoidbindungsstellen mit flexiblen Bindungseigenschaften besitzen. Auch über die Umwandlung des an die einzelnen Lhca-Proteine gebundenen Violaxanthins (Vio) im Xanthophyllzyklus war nur wenig bekannt. Deshalb wurden mit Hilfe eines in vitro-Deepoxidationssystems sowohl native als auch rekonstituierte LHCI hinsichtlich ihrer Deepoxidationseigenschaften untersucht und der Deepoxidationsgrad von in vivo deepoxidierten Pigment-Protein-Komplexen bestimmt. Aus den Deepoxidationsexperimenten konnte abgeleitet werden, dass in den verschiedenen Lhca-Proteinen unterschiedliche Carotinoidbindungsstellen besetzt sind. Außerdem bestätigten diese Experimente, dass der Xanthophyllzyklus auch im LHCI auftritt, wobei jedoch ein niedrigerer Deepoxidationsgrad erreicht wird als bei LHCII. Dies konnte durch in vitro-Deepoxidationsversuchen auf eine geringere Deepoxidierbarkeit des von Lhca1 und Lhca2 gebundenen Vio zurückgeführt werden. Damit scheint Vio in diesen Lhca-Proteinen eher eine strukturelle Rolle zu übernehmen. Eine photoprotektive Funktion von Zeaxanthin im PSI wäre folglich auf Lhca3 und Lhca4 beschränkt. Damit enthält jede LHCI-Subfraktion ein LHC-Monomer mit langwelliger Fluoreszenz, das möglicherweise am Lichtschutz beteiligt ist. Insgesamt zeigten die Untersuchungen der Pigmentbindung, der Deepoxidierung und der Fluoreszenzeigenschaften, dass sich die verschiedenen Lhca-Proteine in einem oder mehreren dieser Parameter unterscheiden. Dies lässt vermuten, dass schon durch leichte Veränderungen in der Proteinzusammensetzung des LHCI eine Anpassung an unterschiedliche Licht-verhältnisse erreicht werden kann.

Konditionale Expression von HER-2, H-Ras oder BXB-Raf1 in einem Maustumormodell

Es ist bekannt, dass die Überexpression eines einzigen Onkogens im Tumorgewebe einen maligneren Phänotyp zur Folge haben kann. Ein Beispiel hierfür ist die Rezeptortyrosinkinase HER-2. Besonders in Mamma- und Ovarialkarzinomen tritt häufig eine HER-2 Überexpression auf, die mit einer schlechteren Prognose für die Patientinnen einhergeht. Die HER-2 blockierende Therapie mit Trastuzumab (Herceptin®) konnte zu einer signifikanten Verbesserung der Überlebenszeit bei Patientinnen mit metastasierendem Mammakarzinom führen. Es ist deshalb von großem Interesse herauszufinden, ob ein Tumor durch gezielte Blockade eines bestimmten Onkogens sein tumorigenes Potential verlieren kann, und dadurch das Tumorwachstum zumindest zeitweise unterbunden wird. Die Frage ist also, ob ein Tumor reversibel sein kann, wenn die Expression seiner Onkogene blockiert wird. Frühere Arbeiten meiner Arbeitsgruppe haben gezeigt, dass Tumore, die konditional humanes HER-2 exprimierten, nach Ausschalten von HER-2 tatsächlich in Remission gingen, d.h. reversibel waren. Tumorgrößenabhängig konnte sogar eine vollständige Tumorremission beobachtet werden. Die vorliegende Arbeit soll nun helfen, die beobachtete Remission nach Ausschalten von HER-2 besser verstehen zu können. Von Interesse sind dabei vor allem die molekularen Mechanismen, die in dem Tumor nach Ausschalten der HER-2 Expression ablaufen. Die konditionale Expression von HER-2 wurde mit Hilfe des TET-OFF Systems in NIH3T3 Mausfibroblasten erreicht. Mit dieser Technik wurde ein Maustumormodell etabliert, das ermöglichte, die Veränderungen in den Tumoren nach Ausschalten von HER-2 zu untersuchen. Ein besonderes Augenmerk wurde dabei auf zwei der durch HER-2 vermittelten Signalwege gerichtet, den Ras-MAP Kinase Signalweg und die Aktivierung von Akt über die Phosphoinositol-3 Kinase. Beide wurden nach Ausschalten der HER-2 Expression deaktiviert. Um herausfinden zu können, welcher der beiden Wege eine wichtigere Rolle bei der Tumorremission spielt, wurden in der vorliegenden Arbeit zwei weitere Maustumormodelle zur konditionalen Expression von humanem H-Ras bzw. einer Form des humanen c-Raf-1 (BXB-Raf1) etabliert. Die Modelle funktionierten auf dieselbe Weise wie das HER-2 Maustumormodell und es wurden auch dieselben Faktoren untersucht. Ras und Raf sind Mitglieder des Ras-MAP Kinase Signalweges. Raf ist aber im Gegensatz zu HER-2 und Ras nicht in der Lage, Akt zu aktivieren. Durch Vergleich der Ergebnisse der drei Maustumormodelle war es deshalb möglich zu differenzieren, ob Einflüsse auf die Tumorentwicklung über denn Ras-MAP Kinase oder den PI3K/Akt Signalweg vermittelt wurden. Auch Ausschalten von H-Ras oder BXB-Raf1 führte zu einer raschen Tumorremission. Damit wurde erneut die Frage nach der Reversibilität eines Tumors beantwortet. Ob die Remission auf einer Induktion von Apoptose beruhte, konnte nicht endgültig geklärt werden, da es zwar nach Ausschalten von HER-2 zu einer Erhöhung der Apoptoserate kam, nicht jedoch nach Ausschalten von H-Ras oder BXB-Raf1. Aufgrund der vorhandenen Ergebnisse wird vermutet, dass es zu einer Störung des Gleichgewichtes zwischen proliferationsfördernden und apoptotischen Faktoren nach Ausschalten der Onkogene kam. Die in den Tumoren vorhandene Spontanapoptose könnte dann ausreichen, den Prozess der Tumorremission auszulösen. Die Untersuchungen haben gezeigt, dass ERK bzw. der Ras-MAP Kinase Signalweg die bedeutendere Rolle bei der Tumorremission spielte. Zum einen wurde dies belegt durch die Beobachtung, dass die Tumorverläufe von HER-2 und BXB-Raf1 nahezu identisch waren. Zum anderen kam es in allen drei Modellen zu einer Dephosphorylierung von ERK, die der Tumorremission vorausging. Akt schien dagegen keine Rolle zu spielen, da das Ausschalten der HER-2, H-Ras oder BXB-Raf1 Expression zu keiner einheitlichen Veränderung des Posphorylierungsgrades von Akt führte. Demnach ist die Blockade des Ras-MAP Kinase Signalweges, der hauptsächlich proliferationsfördernde Eigenschaften besitzt, wichtiger für die Tumorremission als die Blockade des PI3K/Akt Signalweges, der hauptsächlich anti-apoptotische Eigenschaften vermittelt.

Mikrosomale Biotransformation von Benzo[ghi]perylen, einem mutagenen polyaromatischen Kohlenwasserstoff ohne das Strukturelement der Bay-Region des kanzerogenen Benzo[a]pyrens

Kanzerogene polyaromatische Kohlenwasserstoffe (PAKs), wie Benzo[a]pyren, besitzen eine Bay-Region mit ortho-kondensiertem Benzoring. Dadurch ist die enzymatische Bildung von Bay-Region-Dihydrodiolepoxiden (Oxiranylring in der sterisch abgeschirmten Molekülbucht) möglich, die als ultimal kanzerogene Metaboliten der PAKs gelten. Diese lösen durch DNA-Modifikation Primärläsionen aus, die, sofern sie nicht enzymatisch repariert werden, bei der DNA-Replikation Fehler verursachen (Mu-tationen). Der Mehrstufenprozeß der Kanzerogenese (Promotion und Progression) führt schließlich zur neoplastischen Entartung der Zelle. Benzo[ghi]perylen (BghiP) repräsentiert eine Gruppe von PAKs, die keine „klassische“ Bay-Region besitzen und daher keine vicinalen Dihydrodiolepoxiden bilden können. Trotzdem ist BghiP mutagen, z. B. in den Stämmen TA98 und TA100 von Salmonella typhimurium (1,3- bzw. 4,3 his+-Revertanten/nmol) nach metabolischer Aktivierung mit der postmitochondrialen Fraktion von Ratten nach Behandlung mit 3-Methylcholanthren. Hemmung der mikrosomalen Epoxidhydrolase (mEH) mit 1,1,1-Trichlor-2-propenoxid (TCPO) steigert die bakterielle Mutagenität von BghiP im Stamm TA98 um das 4-fache, was Arenoxide als ultimale Mutagene wahrscheinlich macht. Dieses Ergebnis wird au-ßerdem durch Untersuchung der DNA-Bindung mit dem Verfahren des 32P-Postlabelings bestätigt (Dr. Fickler, Institut für Toxikologie, Universität Mainz). Danach bildete mikrosomal aktiviertes BghiP drei Addukte (ein Hauptaddukt, zwei Nebenaddukte), die durch Hemmung der mEH mit TCPO verstärkt wurden (das Hauptaddukt um 29%). Um den für die bakterielle Mutagenität von BghiP verantwortlichen Metaboliten zu identifizieren, wurde die mikrosomale Biotransformaton von BghiP aufgeklärt. Umsetzung von BghiP mit Lebermikrosomen von Ratten nach Behandlung mit Aroclor 1254 lieferte 17 mit Ethylacetat extrahierbare Metaboliten. Zwölf dieser Metaboliten konnten durch eine Kombination von chromatographischen, spektroskopi-schen und biochemischen Methoden identifiziert werden. Daraus ergeben sich zwei Biotransformati-onswege: Weg I beginnt mit einem Angriff von Cytochrom P450-abhängigen Monooxygenasen an Position 7 und der Bildung des 7-Phenols. Dieses wird dann in das 7,8- bzw. 7,10-Diphenol überführt, die schließlich zu den mehrkernigen Chinonen an der 7,8- bzw. 7,10-Position oxidiert werden. Im Bio-transformationsweg II werden die K-Regionen von BghiP durch Cytochrom P450 funktionalisiert. Zu-nächst entstehen das auf indirektem Weg identifizierte 3,4-Oxid und das 3,4,11,12-Bisoxid, die in mikrosomalen Umsetzungen von BghiP nur nach Hemmung der mEH gebildet werden. Enzymatische Hydrolyse des 3,4-Oxides ergibt das trans-3,4-Dihydrodiol, das zum 3,4-Chinon oxidiert wird. Ebenso entsteht aus dem 3,4,11,12-Bisoxid das trans-3,4-trans-11,12-Bisdihydrodiol, aus dem durch Oxidati-on das trans-3,4-Dihydrodiol-11,12-Chinon hervorgeht. Untersuchung der stereoselektiven enzymati-schen Bildung der K-Region-trans-Di¬hydrodiole ergaben eine präferentielle Entstehung der 3R,4R- bzw. 3R,4R,11R,12R-Enantiomere. Untersuchungen der bakteriellen Mutagenität der Hauptmetaboliten 3,4-Dihydrodiol und dem 7-Phenol machte deutlich, dass beide Biotransformationswege I und II von BghiP zur bakteriellen Mutagenität beitragen. Das 7-Phenol aus Weg I ist ein proximales Mutagen, was auch von Phenolen anderer PAKs bekannt ist. Das 3,4-Dihydrodiol aus Weg II wird so schwach zu Mutagenen aktiviert, dass dem vermutlich gebildete 3,4-Dihydrodiol-11,12-oxid keine große Bedeutung als ultimales Mutagen von BghiP zukommt. Die Bestimmung der direkten mutagenen Aktivität (ohne metabolische Aktivierung) der mutmaßlich ultimal mutagenen Arenoxide von BghiP ergab, dass die des 3,4,11,12-Bisarenoxides sehr gering war (1,3 his+-Revertanten/nmol im Stamm TA98). Das 3,4-Oxid hingegen bewirkte einen deutlichen gentoxischen Effekt in den Stämmen TA98 und TA100 (5,5 bzw. 10 his+-Revertanten/nmol). Dies wurde durch die Bestimmung der DNA-Bindung mit dem 32P-Postlabeling, in dem das 3,4-Oxid für das Hauptaddukt von BghiP verantwortlich gemacht werden konnte, bestätigt. Daher kommt dem 3,4-Oxid als ultimales Mutagen die größte Bedeutung für die Gentoxizität von BghiP zu. Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen bei PAKs ohne Bay-Region auf Arenoxide schließen, die eine notwendige Voraussetzung für DNA-Bindung und Mutagenität sind.

Funktionelle Analyse von Dystroglycan in der sich entwickelnden Hühnerretina durch in-ovo-Elektroporation

Alpha- und Beta-Dystroglycan, die zentralen Komponenten eines multimeren Dystrophin-assoziierten Proteinkomplexes wurden bislang im Wesentlichen in der Skelettmuskulatur charakterisiert. Dort stellt der DAG eine molekulare Verbindung zwischen dem Aktin-Zytoskelett der Muskelfaser und einer Basalmembran her, die die einzelne Muskelfaser umhüllt. Dystroglycan vermittelt auf diese Weise die mechanische Festigkeit der Muskelfasern während der Kontraktion. Außerdem dient der DAG als Gerüst für die Anlagerung von Proteinen. Mutationen in den strukturgebenden oder signaltransduzierenden Proteinen des DAG verursachen Muskeldystrophie. Besonders schwere Muskeldystrophien werden durch Mutationen hervorgerufen, die eine veränderte Glykosylierung von Dystroglycan und damit eine verminderte Bindung von alpha-Dystroglycan an Matrixproteine verursachen. Dies führt zu einer Beeinträchtigung der Basalmembranbiosynthese sowie sich daraus ergebende Störungen in der Migration, Schichtung und Differenzierung von Nervenzellen im ZNS. Welche Rolle Dystroglycan im sich entwickelnden ZNS spielt, sollte in dieser Arbeit an der Hühnerretina untersucht werden. Durch Anwendung der in ovo Elektroporation wurden zwei modifizierte Dystroglycankonstrukte in Neuroepithelzellen transfiziert. Die Überexpression eines verkürtzten Dystroglycanproteins, verursachte eine Abrundung der Neuroepithelzellen. Dies führte zur Hyperproliferation der Zellen deren Folge die Bildung von Verdickungen in der Retina war sowie eine verstärkte Bildung postmitotischer Neurone. Die Elektroporation eines nicht-spaltbaren Dystroglycans, führte im Gegensatz dazu zu einer Abnahme der Anzahl proliferierender und differenzierender Nervenzellen. Als Konsequenz veränderte sich die Orientierung der Axone von retinalen Ganglienzellen. Nach der Überexpression des verkürzten Dystroglycans verloren die Axone ihre zentripetale Orientierung auf den optischen Nerv, während die Elektroporation von Wt-Dystroglycan und nicht-spaltbarem Dystroglycan nur einen gelegentlichen Richtungswechsel der Axone verursachte. Die Daten zeigen, dass Dystroglycan einen entscheidenden Einfluss auf die Proliferation, Differenzierung und Polarität der Neuroepithelzellen ausübt. Dies geschieht vermutlich durch die Vermittlung der Adhäsion des Endfußes von Neuroepithelzellen an die Basalmembran. Die Veränderungen nach der Überexpression der modifizierten Dystroglycankonstrukte liefern möglicherweise eine Erklärung für den ZNS-Phänotyp der sich bei verschiedenen Formen von Muskeldystrophie zeigt.

Analyse von Middleware-Technologien bzgl. Performanz und ihrer Eignung für lose und eng gekoppelte verteilte Anwendungen

Die vorliegende Dissertation analysiert die Middleware- Technologien CORBA (Common Object Request Broker Architecture), COM/DCOM (Component Object Model/Distributed Component Object Model), J2EE (Java-2-Enterprise Edition) und Web Services (inklusive .NET) auf ihre Eignung bzgl. eng und lose gekoppelten verteilten Anwendungen. Zusätzlich werden primär für CORBA die dynamischen CORBA-Komponenten DII (Dynamic Invocation Interface), IFR (Interface Repository) und die generischen Datentypen Any und DynAny (dynamisches Any) im Detail untersucht. Ziel ist es, a. konkrete Aussagen über diese Komponenten zu erzielen, und festzustellen, in welchem Umfeld diese generischen Ansätze ihre Berechtigung finden. b. das zeitliche Verhalten der dynamischen Komponenten bzgl. der Informationsgewinnung über die unbekannten Objekte zu analysieren. c. das zeitliche Verhalten der dynamischen Komponenten bzgl. ihrer Kommunikation zu messen. d. das zeitliche Verhalten bzgl. der Erzeugung von generischen Datentypen und das Einstellen von Daten zu messen und zu analysieren. e. das zeitliche Verhalten bzgl. des Erstellens von unbekannten, d. h. nicht in IDL beschriebenen Datentypen zur Laufzeit zu messen und zu analysieren. f. die Vorzüge/Nachteile der dynamischen Komponenten aufzuzeigen, ihre Einsatzgebiete zu definieren und mit anderen Technologien wie COM/DCOM, J2EE und den Web Services bzgl. ihrer Möglichkeiten zu vergleichen. g. Aussagen bzgl. enger und loser Koppelung zu tätigen. CORBA wird als standardisierte und vollständige Verteilungsplattform ausgewählt, um die o. a. Problemstellungen zu untersuchen. Bzgl. seines dynamischen Verhaltens, das zum Zeitpunkt dieser Ausarbeitung noch nicht oder nur unzureichend untersucht wurde, sind CORBA und die Web Services richtungsweisend bzgl. a. Arbeiten mit unbekannten Objekten. Dies kann durchaus Implikationen bzgl. der Entwicklung intelligenter Softwareagenten haben. b. der Integration von Legacy-Applikationen. c. der Möglichkeiten im Zusammenhang mit B2B (Business-to-Business). Diese Problemstellungen beinhalten auch allgemeine Fragen zum Marshalling/Unmarshalling von Daten und welche Aufwände hierfür notwendig sind, ebenso wie allgemeine Aussagen bzgl. der Echtzeitfähigkeit von CORBA-basierten, verteilten Anwendungen. Die Ergebnisse werden anschließend auf andere Technologien wie COM/DCOM, J2EE und den Web Services, soweit es zulässig ist, übertragen. Die Vergleiche CORBA mit DCOM, CORBA mit J2EE und CORBA mit Web Services zeigen im Detail die Eignung dieser Technologien bzgl. loser und enger Koppelung. Desweiteren werden aus den erzielten Resultaten allgemeine Konzepte bzgl. der Architektur und der Optimierung der Kommunikation abgeleitet. Diese Empfehlungen gelten uneingeschränkt für alle untersuchten Technologien im Zusammenhang mit verteilter Verarbeitung.

Computer-Simulationen zur Strukturbildung von einzelnen Polymerketten

In dieser Arbeit wurden die Phasenübergänge einer einzelnen Polymerkette mit Hilfe der Monte Carlo Methode untersucht. Das Bondfluktuationsmodell wurde zur Simulation benutzt, wobei ein attraktives Kastenpotential zwischen allen Monomeren der Polymerkette gewirkt hat. Drei Arten von Bewegungen sind eingeführt worden, um die Polymerkette richtig zu relaxieren. Diese sind die Hüpfbewegung, die Reptationsbewegung und die Pivotbewegung. Um die Volumenausschlußwechselwirkung zu prüfen und um die Anzahl der Nachbarn jedes Monomers zu bestimmen ist ein hierarchischer Suchalgorithmus eingeführt worden. Die Zustandsdichte des Modells ist mittels des Wang-Landau Algorithmus bestimmt worden. Damit sind thermodynamische Größen berechnet worden, um die Phasenübergänge der einzelnen Polymerkette zu studieren. Wir haben zuerst eine freie Polymerkette untersucht. Der Knäuel-Kügelchen Übergang zeigt sich als ein kontinuierlicher Übergang, bei dem der Knäuel zum Kügelchen zusammenfällt. Der Kügelchen-Kügelchen Übergang bei niedrigeren Temperaturen ist ein Phasenübergang der ersten Ordnung, mit einer Koexistenz des flüssigen und festen Kügelchens, das eine kristalline Struktur hat. Im thermodynamischen Limes sind die Übergangstemperaturen identisch. Das entspricht einem Verschwinden der flüssigen Phase. In zwei Dimensionen zeigt das Modell einen kontinuierlichen Knäuel-Kügelchen Übergang mit einer lokal geordneten Struktur. Wir haben ferner einen Polymermushroom, das ist eine verankerte Polymerkette, zwischen zwei repulsiven Wänden im Abstand D untersucht. Das Phasenverhalten der Polymerkette zeigt einen dimensionalen crossover. Sowohl die Verankerung als auch die Beschränkung fördern den Knäuel-Kügelchen Übergang, wobei es eine Symmetriebrechung gibt, da die Ausdehnung der Polymerkette parallel zu den Wänden schneller schrumpft als die senkrecht zu den Wänden. Die Beschränkung hindert den Kügelchen-Kügelchen Übergang, wobei die Verankerung keinen Einfluss zu haben scheint. Die Übergangstemperaturen im thermodynamischen Limes sind wiederum identisch im Rahmen des Fehlers. Die spezifische Wärme des gleichen Modells aber mit einem abstoßendem Kastenpotential zeigt eine Schottky Anomalie, typisch für ein Zwei-Niveau System.

Substratversorgung von NO-Synthasen

Resultate dieser Arbeit zeigen, dass endotheliale und neuronale NO-Synthasen (eNOS und nNOS) ihr Substrat Arginin nicht ausschließlich aus extrazellulären, sondern auch aus intrazellulären Quellen beziehen. Das Substrat aus den intrazellulären Quellen scheint nicht über Membrantransporter in den Extrazellulärraum gelangen zu können. Dies deutet darauf hin, dass eine enge Assoziation der Arginin-bereitstellenden Enzyme mit eNOS bzw. nNOS vorliegen könnte. Dadurch würde das durch diese Enzyme generierte Arginin direkt an die NOS weitergereicht und nicht über Transporter gegen andere basische Aminosäuren (AS) im Extrazellulärraum ausgetauscht werden. Eine intrazelluläre Substrat-Quelle besteht aus dem so genannten „Recycling“, der Umwandlung des bei der NO-Synthese entstehenden Citrullins in Arginin. Eine Kopplung von Arginin-bereitstellenden „Recycling“-Enzymen mit NOS wird in Endothelzellen und teilweise auch in TGW-nu-I Neuroblastomzellen beobachtet, nicht jedoch in A673 Neuroepitheliomzellen. Die Kopplung scheint daher vom Zelltyp abhängig zu sein. Das zur Arginin-Regeneration benötigte Citrullin kann allen untersuchten Zellen durch den Austausch mit spezifischen neutralen AS, die ausschließlich zum Substratprofil des System N Transporters SN1 passen, entzogen werden. Die Anwesenheit von SN1-Substraten im Extrazellulärraum führt daher indirekt zu einer Depletion der Recycling-Quelle. SN1 mRNA ist in allen untersuchten Zellen nachweisbar. Aus Protein-Abbau stammendes Arginin stellt den zweiten Teil der intrazellulären Arginin-Quelle dar. Dieser ist in allen untersuchten eNOS- oder nNOS exprimierenden Zellen vorhanden. Das Arginin stammt dabei sowohl aus lysosomalem als auch proteasomalen Proteinabbau, wie der Einsatz spezifischer Inhibitoren zeigt. Extrazelluläres Histidin (aber keine andere Aminosäure) kann diese Arginin-Quelle depletieren. Wir vermuten deshalb, dass Histidin über den Peptid-Histidin-Transporter PHT1, der in allen untersuchten Zellen stark exprimiert ist, gegen die durch lysosomalen und proteasomalen Proteinabbau entstehenden Arginin-haltigen Di- und Tripeptide ausgetauscht wird. Der wichtigste endogene NOS-Inhibitor, asymmetrisches Dimethylarginin (ADMA), ein Marker für endotheliale Dysfunktion und Risikofaktor für kardiovaskuläre Erkrankungen, stammt ebenfalls aus Proteinabbau. Die Verfügbarkeit dieser intrazellulären Arginin-Quelle wird deshalb stark vom Methylierungsgrad des Arginins in den abgebauten Proteinen abhängen. Eine lokale ADMA-Anreicherung könnte eine Erklärung für das Arginin-Paradox sein, der unter pathophysiologischen Bedingungen beobachteten Verminderung der endothelialen NO-Synthese bei anscheinend ausreichenden intrazellulären Argininkonzentrationen. Da auch in neurodegenerativen Erkrankungen, wie Morbus Alzheimer, ADMA eine Rolle zu spielen scheint, könnte das Arginin-Paradox auch für die nNOS-vermittelte NO-Synthese von Bedeutung sein. Die Resultate demonstrieren, dass die Substratversorgung der beiden NOS-Isoformen nicht ausschließlich von kationischen Aminosäuretransportern abhängig ist, sondern auch von Transportern für neutrale Aminosäuren und Peptide, und außerdem von Arginin-bereitstellenden Enzymen. Der jeweilige Beitrag der verschiedenen Arginin-Quellen zur Substratversorgung der NOS ist daher abhängig vom Anteil der jeweiligen Aminosäuren und Peptide in der extrazellulären Flüssigkeit.

Untersuchung der zellulären Antwort von Tumor und Endothelium auf radioaktive Bestrahlung in vitro und in vivo

Tumore des Kopf-Hals Bereiches sprechen aufgrund schneller Resistenzbildung häufig schlecht auf die derzeit praktizierten Bestrahlungstherapien an. Der Erfolg dieser Behandlung wird dabei maßgeblich durch die Strahlenresistenz des malignen Gewebes limitiert. Das Verständnis der zugrunde liegenden zellulären und molekularen Mechanismen ist diesbezüglich unvollständig. Die Resistenzzunahme während der klinischen Behandlung könnte durch die Selektion strahlenresistenter Einzelzellen verursacht werden oder durch die Aktivierung von Resistenzmechanismen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die bestrahlungsvermittelte Freisetzung möglicherweise protektiv wirkender Faktoren durch Tumorzelllinien des Kopf-Hals Bereiches untersucht. Durch Bestrahlung erfolgte eine Induktion von VEGF (vascular endothelial growth factor) und FGF-2 (fibroblast growth factor 2), IL-8 (Interleukin-8) und PGE2 (Prostaglandin E2). Die Untersuchung von VEGF und FGF-2 zeigte weiterhin ein zytoprotektives Potential dieser Faktoren, d.h. die T

Mikroskopische Untersuchung der ferroelektrischen Elektronenemission von der freien Oberfläche von Triglyzinsulfat

In dieser Arbeit wurden erstmalig orts- und energieaufgelöste Untersuchungen der ferroelektrischen Elektronenemission (FEE) durchgeführt. Als Modellsystem diente Triglyzinsulfat (TGS). Als spektromikroskopische Methode kam die Emissions-Elektronenmikroskopie zum Einsatz. Typische Schaltfelder betrugen 2 kV/mm, angelegt wurde eine sinusoïdale Wechselspannung mit 300 Hz. Die Temperatur, bei der die FEE verschwindet (32°C), liegt unterhalb der Curie-Temperatur des TGS (TC=49°C). Dieser Unterschied kann auf den Einfluss des Extraktionsfeldes des Emissions-Elektronenmikroskops (1 kV/mm) zurückgeführt werden. Oberhalb der Curie-Temperatur konnte keine Emission beobachtet werden. Die Elektroden vor und nach der Messung waren identisch, d.h. nicht zerstört, wie man es erwarten würde, wenn ein Oberflächenplasma gezündet wurde. Bei ca. 150 V/mm beginnt die Intensität der beobachteten Emission Schwankungen aufzuweisen. Dies könnte die Ursache in dem Einsatz von ersten Zündungen eines Mikroplasmas mit destruktiver Wirkung haben. Die ortsintegrierte Energieverteilung weist bei Spannungsamplituden bis 300 V zwei Maxima auf. Dies deutet auf zwei Emissionsmechanismen hin, einen sekundären (ca. 10 eV) und einen primären (ca. 13 bis 45 eV) Effekt. Die Hochenergie-Abschneidekanten korrelieren im Bereich bis 200 V bis auf wenige eV mit der angelegten Spannungsamplitude. Die Messung der ortsaufgelösten Energieverteilung zeigt, dass die primäre Emission aus den Bereichen ohne Elektrode stammt. Sie wird der FEE zugeschrieben. Diese Elektronen können– auf Grund der lokalen Felder – auf die Elektroden beschleunigt werden und hier sekundäre Prozesse auslösen (niederenergetischer Bereich des Spektrums). Dies wird durch die lokalen Spektren dieser Bereiche bestätigt.

Charakterisierung von T-Zell-Antworten gegen humane Nierenzellkarzinome sowie Identifizierung von HLA-G als tumorassoziiertes Antigen und Immunevasionsmechanismus des Nierenzellkarzinoms

Humane Nierenzellkarzinom-(NZK)-Zelllinien wurden etabliert, um sie zur Generierung von autologen zytotoxischen T-Zelllinien einzusetzen. Erst nach Modifikation mit dem kostimulierenden B7-1-Molekül wurden mit der NZK-Zelllinie MZ1257RC autologe, tumorspezifische T-Zelllinien generiert und charakterisiert. Die Aufklärung eines T-Zell-definierten TAA eines autologen, zytotoxischen T Zellklons wurde mittels Expressionsklonierung einer hergestellten cDNS-Expressionsbank begonnen. Nach in vitro-Sensibilisierung von peripheren Blutmonozyten mit der autologen NZK-Zelllinie MZ2733RC wurde die HLA-Klasse I-restringierte T Zelllinie XIE6 generiert, die die autologe und verschiedene allogene NZK- sowie Zervixkarzinom-Zelllinien, jedoch nicht autologe Nierenzellen lysiert. Die T Zellen exprimieren TZR Vβ13.6-Ketten und sezernieren GM-CSF und IL-10 nach Antigenstimulation. Jedoch ist die NZK-Zelllinie MZ2733RC wenig sensitiv gegenüber autologen und allogenen Effektorzellen. Erst die Blockade ihrer HLA Klasse I-Moleküle auf der Zelloberfläche erhöht ihre Sensitivität gegenüber allogenen lymphokin-aktivierten Killer-Zellen. Verantwortlich dafür können nicht-klassische HLA Klasse Ib-Moleküle, insbesondere HLA-G sein, dessen Transkripte in der RNS der NZK-Zellen, jedoch nicht in Nierenzellen detektiert wurden. In einer detaillierten Studie wurden HLA-G-Transkripte in NZK-Zelllinien (58%), in NZK-Biopsien (80%), und nur in wenigen Nierenepithelbiopsien (10%) nachgewiesen. In der NZK-Zelllinie MZ2733RC wurde eine konstitutive HLA-G1-Proteinexpression beobachtet, die durch eine IFN-γ-Behandlung induzierbar ist.

Automatisierte Flüssigchromatographie mit Säulenschaltung und Ultraviolettspektroskopie oder Massenspektrometrie für therapeutisches Drug Monitoring von Antipsychotika und Antidepressiva

Therapeutisches Drug Monitoring (TDM) wird zur individuellen Dosiseinstellung genutzt, um die Effizienz der Medikamentenwirkung zu steigern und das Auftreten von Nebenwirkungen zu senken. Für das TDM von Antipsychotika und Antidepressiva besteht allerdings das Problem, dass es mehr als 50 Medikamente gibt. Ein TDM-Labor muss dementsprechend über 50 verschiedene Wirkstoffe und zusätzlich aktive Metaboliten messen. Mit der Flüssigchromatographie (LC oder HPLC) ist die Analyse vieler unterschiedlicher Medikamente möglich. LC mit Säulenschaltung erlaubt eine Automatisierung. Dabei wird Blutserum oder -plasma mit oder ohne vorherige Proteinfällung auf eine Vorsäule aufgetragen. Nach Auswaschen von störenden Matrixbestandteilen werden die Medikamente auf einer nachgeschalteten analytischen Säule getrennt und über Ultraviolettspektroskopie (UV) oder Massenspektrometrie (MS) detektiert. Ziel dieser Arbeit war es, LC-Methoden zu entwickeln, die die Messung möglichst vieler Antipsychotika und Antidepressiva erlaubt und die für die TDM-Routine geeignet ist. Eine mit C8-modifiziertem Kieselgel gefüllte Säule (20 µm 10x4.0 mm I.D.) erwies sich in Vorexperimenten als optimal geeignet bezüglich Extraktionsverhalten, Regenerierbarkeit und Stabilität. Mit einer ersten HPLC-UV-Methode mit Säulenschaltung konnten 20 verschiedene Psychopharmaka einschließlich ihrer Metabolite, also insgesamt 30 verschiedene Substanzen quantitativ erfasst werden. Die Analysenzeit betrug 30 Minuten. Die Vorsäule erlaubte 150 Injektionen, die analytische Säule konnte mit mehr als 300 Plasmainjektionen belastet werden. Abhängig vom Analyten, musste allerdings das Injektionsvolumen, die Flussrate oder die Detektionswellenlänge verändert werden. Die Methode war daher für eine Routineanwendung nur eingeschränkt geeignet. Mit einer zweiten HPLC-UV-Methode konnten 43 verschiedene Antipsychotika und Antidepressiva inklusive Metaboliten nachgewiesen werden. Nach Vorreinigung über C8-Material (10 µm, 10x4 mm I.D.) erfolgte die Trennung auf Hypersil ODS (5 µm Partikelgröße) in der analytischen Säule (250x4.6 mm I.D.) mit 37.5% Acetonitril im analytischen Eluenten. Die optimale Flussrate war 1.5 ml/min und die Detektionswellenlänge 254 nm. In einer Einzelprobe, konnten mit dieser Methode 7 bis 8 unterschiedliche Substanzen gemessen werden. Für die Antipsychotika Clozapin, Olanzapin, Perazin, Quetiapin und Ziprasidon wurde die Methode validiert. Der Variationskoeffizient (VK%) für die Impräzision lag zwischen 0.2 und 6.1%. Im erforderlichen Messbereich war die Methode linear (Korrelationskoeffizienten, R2 zwischen 0.9765 und 0.9816). Die absolute und analytische Wiederfindung lagen zwischen 98 und 118 %. Die für das TDM erforderlichen unteren Nachweisgrenzen wurden erreicht. Für Olanzapin betrug sie 5 ng/ml. Die Methode wurde an Patienten für das TDM getestet. Sie erwies sich für das TDM als sehr gut geeignet. Nach retrospektiver Auswertung von Patientendaten konnte erstmalig ein möglicher therapeutischer Bereich für Quetiapin (40-170 ng/ml) und Ziprasidon (40-130 ng/ml) formuliert werden. Mit einem Massenspektrometer als Detektor war die Messung von acht Neuroleptika und ihren Metaboliten möglich. 12 Substanzen konnten in einem Lauf bestimmt werden: Amisulprid, Clozapin, N-Desmethylclozapin, Clozapin-N-oxid, Haloperidol, Risperidon, 9-Hydroxyrisperidon, Olanzapin, Perazin, N-Desmethylperazin, Quetiapin und Ziprasidon. Nach Vorreinigung mit C8-Material (20 µm 10x4.0 mm I.D.) erfolgte die Trennung auf Synergi MAX-RP C12 (4 µm 150 x 4.6 mm). Die Validierung der HPLC-MS-Methode belegten einen linearen Zusammenhang zwischen Konzentration und Detektorsignal (R2= 0,9974 bis 0.9999). Die Impräzision lag zwischen 0.84 bis 9.78%. Die für das TDM erforderlichen unteren Nachweisgrenzen wurden erreicht. Es gab keine Hinweise auf das Auftreten von Ion Suppression durch Matrixbestandteile. Die absolute und analytische Wiederfindung lag zwischen 89 und 107 %. Es zeigte sich, dass die HPLC-MS-Methode ohne Modifikation erweitert werden kann und anscheinend mehr als 30 verschiedene Psychopharmaka erfasst werden können. Mit den entwickelten flüssigchromatographischen Methoden stehen neue Verfahren für das TDM von Antipsychotika und Antidepressiva zur Verfügung, die es erlauben, mit einer Methode verschiedene Psychopharmaka und ihre aktiven Metabolite zu messen. Damit kann die Behandlung psychiatrischer Patienten insbesondere mit Antipsychotika verbessert werden.

Generierung und Charakterisierung von rekombinanten Cytomegaloviren mit Punktmutationen in antigenen Peptiden

Die Kontrolle der produktiven Cytomegalovirus- (CMV) Infektion ist von der effizienten Rekonstitution antiviraler CD8 T-Zellen abhängig. Dies führt jedoch nicht zur vollständigen Eliminierung des viralen Genoms aus den Zielorganen, sondern das Virus verbleibt in einem nicht-replikativen Zustand: der Latenz. Es ist bekannt, dass während der Latenz nur ein geringer Anteil latenter mCMV-Genome in der Lunge die Major Immediate Early (MIE) Gene ie1 und ie2 exprimiert, die Latenz aber dennoch bestehen bleibt, weil das differentielle Splicing des primären IE1/3-Transkripts zum Transaktivator-Transkript IE3 nicht erfolgt. Damit war neben der Initiation der IE-Genexpression am MIE-Promotor-Enhancer das IE1/3-Splicing als zweiter molekularer Latenz-Kontrollpunkt identifiziert. Parallel zur Latenz-assoziierten IE1-Genexpression sind in der Lunge aktivierte CD62L-low CD8 T-Zellen mit Spezifität für das immundominante IE1-Peptid 168-YPHFMPTNL-176 angereichert. Dies legte die Hypothese nahe, dass neben der molekularen Kontrolle der Latenz auch eine immunologische Kontrolle, beispielsweise durch IE1-Epitop-spezifische CD8 T-Zellen besteht. Zur Evaluierung dieser Hypothese wurde in der vorliegenden Arbeit mittels BAC-Mutagenese erstmals ein rekombinantes mCMV generiert, in dem das IE1-Peptid durch Punktmutation der C-terminalen MHC-Ankeraminosäure L176A zerstört ist. Dazu musste zunächst die Technik der BAC-Mutagenese herpesviraler Genome (in Anlehnung an die publizierten Arbeiten von Messerle et al., 1997; Borst et al., 1999, 2004; Wagner et al., 1999) in der Arbeitsgruppe etabliert werden. Neben der Funktionsverlust-Mutante (mCMV-IE1-L176A) wurden zur Kontrolle zwei Revertanten (mCMV-IE1-A176L und mCMV-IE1-A176L*) generiert. In letzterer, als Wobble-Revertante bezeichnet, wird wieder die authentische MHC-Ankeraminosäure L eingesetzt, es verbleibt aber ein singulärer Nukleotidaustausch A->T in der Wobble-Position des Codons als Marker zur Unterscheidung zum WT-mCMV zurück. Der immunologische Phänotyp der Funktionsverlust-Mutante, also die funktionelle Auslöschung des antigenen IE1-Peptids im Priming einer CD8 T-Zell-Antwort, entsprach der Erwartung. Entsprechend konnte nach Infektion mit der Funktionsverlust-Mutante keine Reaktivität gegen das IE1-Peptid nachgewiesen werden. In den Revertanten hingegen war die Erkennung des IE1-Peptids wieder hergestellt. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen weiter, dass die Funktionsverlust-Mutante sowie die Revertanten ohne signifikante Beeinflussung in vitro in permissiven Fibroblasten und in vivo in verschiedenen Geweben replizieren. Wie aktuelle Daten nach Knochenmarktransplantation und Infektion mit der Funktionsverlust-Mutante im Vergleich zu den Revertanten zeigen, ist die Frequenz Latenz-assoziierter IE1-Transkriptionsereignisse bei der Funktionsverlust-Mutante signifikant erhöht. Damit konnte erstmalig der Beweis für eine Kontrolle der Latenz-assoziierten IE1-Genexpression durch IE1-Epitop-spezifische CD8 T-Zellen und damit für eine Präsentation des IE1-Peptids während der Latenz erbracht werden.