Kontrolle der Grenzflächeneigenschaften anorganischer Nanopartikel mittels amphiphiler Polymere

Im Rahmen dieser Arbeit wurden amphiphile Co- und Terpolymere verwendet, um die Grenzflächeneigenschaften anorganischer Nanopartikel zu kontrollieren. Es wurde eine effiziente und vielseitige Methode entwickelt, mit der in-situ hydrophobierte, formanisotrope ZnO-, CdS- und Au-Nanopartikel sowie poröse TiO2-Nanopartikel hergestellt werden konnten. Diese Technik basierte auf der Fällung anorganischer Nanopartikel in einer inversen Emulsion mittels kombinierten Einsatzes zweier maßgeschneiderter amphiphiler Polymere. Ein Copolymer ermöglichte sowohl die Stabilisierung der Emulsion als auch die Hydrophobierung der Partikel, und ein weiteres Struktur-dirigierendes Agens (SDA) kontrollierte den Kristallisationsprozess. Infolge ihrer Form zeigten die Nanopartikel von sphärischen Teilchen abweichende Lagen der Oberflächenplasmonenresonanz und der Bandlücke. Aufgrund der hervorragenden Hydrophobierung dieser Kolloide mittels amphiphiler Copolymere konnten diese homogen in polymere Materialien eingearbeitet werden. Dies erlaubte es die speziellen Eigenschaften von nicht-sphärischen Kolloiden auf Nanokompositmaterialien zu übertragen. Darüber hinaus wurden amphipolare Copolymere genutzt, um superhydrophobe Oberflächen zu generieren. Hierzu wurden Filme bestehend aus rauen SiO2-Nanopartikeln mit fluorierten Emulgatoren beschichtet. In einem dritten Schwerpunkt dieser Arbeit wurden amphiphile Co- und Terpolymere verwendet, um anorganische Nanopartikel zu hydrophilieren. Durch Variation der Emulgatorzusammensetzung konnten die Ladung und Ladungsdichte auf der Partikeloberfläche gezielt gesteuert werden. Darüber hinaus konnte die Partikelhülle zusätzlich mit Farbstoffmolekülen funktionalisiert werden, was den erfolgreichen Einsatz der Kolloide in Zellaufnahmeexperimenten ermöglichte.

Synthese von polymergebundenen Sialyl-Lewis x-Strukturen und deren Mimetika als Zelladhäsionsinhibitoren für E-, L- und P-Selektin

Kohlenhydrate dienen nicht nur der Ernährung oder der Stabilisierung von Zellwänden, sondern sie sind auch von essentieller Bedeutung für Zell-Zell-Wechselwirkungen im Organismus. Damit sind sie von besonderem Interesse für die Behandlung von Entzündungen sowie tumorösen Erkrankungen, die auf Wechselwirkungen zwischen bestimmten Kohlenhydraten und Rezeptoren, Selektine genannt, basieren. Die vorliegende Dissertation mit dem Titel „Synthese von polymergebundenen Sialyl-Lewis x-Strukturen und deren Mimetika als Zelladhäsionsinhibitoren für E-, L- und P-Selektin“ befasst sich mit der Synthese und der Modifizierung des natürlich vorkommenden Selektin-Liganden Sialyl-Lewisx und seinen potentiell mimetischen Strukturen auf Basis von Gemischen der an der Bindung beteiligten Kohlenhydrate sowie von sulfatierten Einheiten. Um im Organismus eine verstärkte Bindung an die zu adressierenden Rezeptoren und eine erhöhte Zirkulationsdauer zu erreichen, wurden die geeignet funktionalisierten Liganden mittels reaktiver Polymere auf Basis von Pentafluorphenyl-Reaktivestern im Rahmen einer polymeranalogen Umsetzung an ein definiertes Methacrylamid-Polymer gebunden.Um die biologische Wirksamkeit der synthetisierten Polymere zu überprüfen, wurden Oberflächenplasmonenresonanz-Messungen (SPR-Messungen) durchgeführt. Dabei zeigte sich bei den verschiedenen Selektinen eine unterschiedlich hohe Affinität der Sialyl-Lewis x sowie der mimetischen Polymere. Es konnten bei E-Selektin die geringsten, bei L-Selektin mittlere und bei P-Selektin die höchsten Affinitäten im unteren nanomolaren Bereich festgestellt werden.

Design of cell adhesive and angiogenic titanium surfaces for cellular stimulation

Die Förderung der Zelladhäsion durch sogenannte biomimetische Oberflächen wird in der Medizin als vielversprechender Ansatz gesehen, um Komplikationen wie z. B. Fremdkörperreaktionen nach der Implantation entgegenzuwirken. Neben der Immobilisierung einzelner Biomoleküle wie z. B. dem RGD-Peptid, Proteinen und Wachstumsfaktoren auf verschiedenen Materialien, konzentriert man sich derzeit in der Forschung auf die Co-Immobilisierung zweier Moleküle gleichzeitig. Hierbei werden die funktionellen Gruppen z. B. von Kollagen unter Verwendung von nur einer Kopplungschemie verwendet, wodurch die Kopplungseffizienz der einzelnen Komponenten nur begrenzt kontrollierbar ist. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung eines Immobilisierungsverfahrens, welches die unabhängige Kopplung zweier Faktoren kontrolliert ermöglicht. Dabei sollten exemplarisch das adhäsionsfördernde RGD-Peptid (Arginin-Glycin-Asparaginsäure) zusammen mit dem Wachstumsfaktor VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) auf Titan gebunden werden. In weiteren Experimenten sollten dann die pro-adhäsiven Faktoren Fibronektin, Kollagen, Laminin und Osteopontin immobilisiert und untersucht werden. rnDie Aminofunktionalisierung von Titan durch plasma polymerisierte Allylaminschichten wurde als Grundlage für die Entwicklung des nasschemischen Co-immobilisierungsverfahren verwendet. Für eine unabhängige und getrennte Anbindung der verschiedenen Biomoleküle stand in diesem Zusammenhang die Entwicklung eines geeigneten Crosslinker Systems im Vordergrund. Die Oberflächencharakterisierung der entwickelten Oberflächen erfolgte mittels Infrarot Spektroskopie, Surface Plasmon Resonance Spektroskopie (SPR), Kontaktwinkelmessungen, Step Profiling und X-Ray Photoelectron Spektroskopie (XPS). Zur Analyse der Anbindungsprozesse in Echtzeit wurden SPR-Kinetik Messungen durchgeführt. Die biologische Funktionalität der modifizierten Oberflächen wurde in vitro an Endothelzellen (HUVECs) und Osteoblasten (HOBs) und in vivo in einem Tiermodell-System an der Tibia von Kaninchen untersucht.rnDie Ergebnisse zeigen, dass alle genannten Biomoleküle sowohl einzeln auf Titan kovalent gekoppelt als auch am Bespiel von RGD und VEGF in einem getrennten Zwei-Schritt-Verfahren co-immobilisiert werden können. Des Weiteren wurde die biologische Funktionalität der gebundenen Faktoren nachgewiesen. Im Falle der RGD modifizierten Oberflächen wurde nach 7 Tagen eine geförderte Zelladhäsion von HUVECs mit einer signifikant erhöhten Zellbesiedlungsdichte von 28,5 % (p<0,05) gezeigt, wohingegen auf reinem Titan Werte von nur 13 % beobachtet wurden. Sowohl VEGF als auch RGD/VEGF modifizierte Proben wiesen im Vergleich zu Titan schon nach 24 Stunden eine geförderte Zelladhäsion und eine signifikant erhöhte Zellbesiedlungsdichte auf. Bei einer Besiedlung von 7,4 % auf Titan, zeigten VEGF modifizierte Proben mit 32,3 % (p<0,001) eine deutlichere Wirkung auf HUVECs als RGD/VEGF modifizierte Proben mit 13,2 % (p<0,01). Die pro-adhäsiven Faktoren zeigten eine deutliche Stimulation der Zelladhäsion von HUVECs und HOBs im Vergleich zu reinem Titan. Die deutlich höchsten Besiedlungsdichten von HUVECs konnten auf Fibronektin mit 44,6 % (p<0,001) und Kollagen mit 39,9 % (p<0,001) nach 24 Stunden beobachtet werden. Laminin zeigte keine und Osteopontin nur eine sehr geringe Wirkung auf HUVECs. Bei Osteoblasten konnten signifikant erhöhte Besiedlungsdichten im Falle aller pro-adhäsiven Faktoren beobachtet werden, jedoch wurden die höchsten Werte nach 7 Tagen auf Kollagen mit 90,6 % (p<0,001) und Laminin mit 86,5 % (p<0,001) im Vergleich zu Titan mit 32,3 % beobachtet. Die Auswertung der Tierexperimente ergab, dass die VEGF modifizierten Osteosyntheseplatten, im Vergleich zu den reinen Titankontrollen, eine gesteigerte Knochenneubildung auslösten. Eine solche Wirkung konnte für RGD/VEGF modifizierte Implantate nicht beobachtet werden. rnInsgesamt konnte gezeigt werden, dass mittels plasmapolymerisierten Allylamin Schichten die genannten Biomoleküle sowohl einzeln gebunden als auch getrennt und kontrolliert co-immobilisiert werden können. Des Weiteren konnte eine biologische Funktionalität für alle Faktoren nach erfolgter Kopplung in vitro gezeigt werden. Wider Erwarten konnte jedoch kein zusätzlicher biologischer Effekt durch die Co-immobilisierung von RGD und VEGF im Vergleich zu den einzeln immobilisierten Faktoren gezeigt werden. Um zu einer klinischen Anwendung zu gelangen, ist es nun notwendig, das entwickelte Verfahren in Bezug auf die immobilisierten Mengen der verschiedenen Faktoren hin zu optimieren. rn

Synthese und Testung potentieller Elongin-C-Antagonisten als neuartige HIV-Therapeutika

Weltweit sind über 34 Millionen Menschen mit dem HI-Virus infiziert. Da die Behandlung mit der HAART-Therapie aufgrund der hohen Mutationsrate des Virus oft fehlschlägt, ist die stetige Forschung an neuen, verbesserten Wirkstoffen zwingend nötig. Mit einem neuartigen Therapieansatz, der die Aufrechterhaltung des menschlichen antiretroviralen Schutz-mechanismus durch Hemmung des APOBEC3G-Abbaus zum Ziel hat, existiert eine neue Möglichkeit zur Bekämpfung der Infektion. Im Gegensatz zu den HAART-Virustatika soll hier das menschliche Immunsystem aufrechterhalten werden, sodass es die Abwehr des Virus selbst übernehmen kann. Der durch das Virus induzierte Abbau von APOBEC3G ist gekoppelt an die Bildung eines Komplexes aus mehreren Proteinen, darunter das virale Protein vif (viral infectivity factor) und das humane Protein Elongin–C. Wird eine der Interaktionen dieser Komplexbildung gehemmt, so kann APOBEC3G nicht mehr abgebaut werden und der humane Schutzmechanismus bleibt aufrechterhalten.rnDie vorliegende Arbeit widmete sich in diesem Zusammenhang der Suche nach Inhibitoren der vif-Elongin–C-Interaktion. Nach Dockingstudien wurden potentielle Kandidaten synthetisiert und anschließend zunächst mit Hilfe der Mikrokalorimetrie (ITC) und der Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie (SPR) auf ihre Affinität zu rekombinant exprimiertem Elongin–C getestet. Zusätzlich wurde ein auf der Mikroskalierten Thermo-phorese (MST) basierender Bindungsassay etabliert, und die Substanzen auch mit dieser Methode getestet. Während die Bindung in diesen Assays nicht eindeutig nachgewiesen werden konnte, zeigte sich eine Substanz in In-vitro-Tests auf Hemmung der APOBEC3G- und vif-abhängigen Virusreplikation als sehr vielversprechend. Auch wenn der genaue molekulare Wirkort in weiteren Tests erst noch ermittelt werden muss, stellt diese Molekülstruktur aufgrund der bisherigen Testergebnisse bereits eine vielversprechende Basis für weitere Derivatisierungen dar.rn

Rod-shaped plasmonic sensors

Plasmonic nanoparticles exhibit strong light scattering efficiency due to the oscillations of their conductive electrons (plasmon), which are excited by light. For rod-shaped nanoparticles, the resonance position is highly tunable by the aspect ratio (length/width) and the sensitivity to changes in the refractive index in the local environment depends on their diameter, hence, their volume. Therefore, rod-shaped nanoparticles are highly suitable as plasmonic sensors.rnWithin this thesis, I study the formation of gold nanorods and nanorods from a gold-copper alloy using a combination of small-angle X-ray scattering and optical extinction spectroscopy. The latter represents one of the first metal alloy nanoparticle synthesis protocols for producing rod-shaped single crystalline gold-copper (AuxCu(1-x)) alloyed nanoparticles. I find that both length and width independently follow an exponential growth behavior with different time-constants, which intrinsically leads to a switch between positive and negative aspect ratio growth during the course of the synthesis. In a parameter study, I find linear relations for the rate constants as a function of [HAuCl4]/[CTAB] ratio and [HAuCl4]/[seed] ratio. Furthermore, I find a correlation of final aspect ratio and ratio of rate constants for length and width growth rate for different [AgNO3]/[HAuCl4] ratios. I identify ascorbic acid as the yield limiting species in the reaction by the use of spectroscopic monitoring and TEM. Finally, I present the use of plasmonic nanorods that absorb light at 1064nm as contrast agents for photoacoustic imaging (BMBF project Polysound). rnIn the physics part, I present my automated dark-field microscope that is capable of collecting spectra in the range of 450nm to 1750 nm. I show the characteristics of that setup for the spectra acquisition in the UV-VIS range and how I use this information to simulate measurements. I show the major noise sources of the measurements and ways to reduce the noise and how the combination of setup charactersitics and simulations of sensitivity and sensing volume can be used to select appropriate gold rods for single unlabeled protein detection. Using my setup, I show how to estimate the size of gold nano-rods directly from the plasmon linewidth measured from optical single particle spectra. Then, I use this information to reduce the distribution (between particles) of the measured plasmonic sensitivity S by 30% by correcting for the systematic error introduced from the variation in particle size. I investigate the single particle scattering of bowtie structures — structures consisting of two (mostly) equilateral triangles pointing one tip at each other. I simulate the spectra of the structures considering the oblique illumination angle in my setup, which leads to additional plasmon modes in the spectra. The simulations agree well with the measurements form a qualitative point of view.rn

Plasmonenresonanzen von sichelförmigen metallischen Nanoobjekten

Metallische Objekte in der Größenordnung der optischen Wellenlänge zeigen Resonanzen im optischen Spektralbereich. Mit einer Kombination aus Kolloidlithographie, Metallfilmbedampfung und reaktivem Ionenstrahl¨atzen wurden Nanosicheln aus Gold bzw. Silber mit identischer Form und Orientierung in Sichelform mit einer Größe von 60nm bis 400nm hergestellt. Der Öffnungswinkel der Nanosicheln lässt sich kontinuierlich einstellen. Durch die einheitliche Orientierung lassen sich Messungen am Ensemble direkt auf das Verhalten des Einzelobjektes übertragen, wie ein Vergleich der Extinktionsspektren einer Ensemblemessung am UV/Vis/NIR-Spektrometer mit einer Einzelpartikelmessung in einem konfokalen Mikroskop zeigt. Die optische Antwort der Nanosicheln wurde als zwei-dimensionales Modell mit einer Finite Elemente Methode berechnet. Das Ergebnis sind mehrere polarisationsabhängige Resonanzen im optischen Spektrum. Diese lassen sich durch Variation des Öffnungswinkels und der Gr¨oße der Nanosichel verschieben. Durch Beleuchten lassen sich plasmonische Schwingungen anregen, die ein stark lokalisiertes Nahfeld an den Spitzen und in der Öffnung der Nanosicheln erzeugen. Das Nahfeld der Partikelresonanz wurde mit einer Fotolackmethode nachgewiesen. Die Untersuchungen am UV/Vis/NIR-Spektrometer zeigen mehrere polarisationsabhängige Resonanzen im Spektralbereich von 300 nm bis 3200 nm. Die Resonanzen der Nanosicheln lassen sich durch den Öffnungswinkel und den Durchmesser in der Größenordnung der Halbwertbreite im optischen Spektrum verschieben. In der Anwendung als Chemo- bzw. Biosensor zeigen Gold-Nanosicheln eine ähnliche Empfindlichkeit wie vergleichbare Sensoren auf der Basis von dünnen Metallstrukturen. Das Nahfeld zeichnet sich durch eine starke Lokalisierung aus und dringt, je nach Multipolordnung, zwischen 14 nm und 70 nm in die Umgebung ein. Quantenpunkte wurden an das Nahfeld der Nanosicheln gekoppelt. Die Emission der Quantenpunkte bei einer Wellenlänge von 860nm wird durch die Resonanz der Nanosicheln verstärkt. Die Nanosicheln wurden als optische Pinzette eingesetzt. Bei einer Anregung mit einem Laser bei einer Wellenlänge von 1064 nm wurden Polystyrolkolloide mit einem Durchmesser von 40 nm von den resonanten Nanosicheln eingefangen. Die Nanosicheln zeigen außergewöhnliche optische Eigenschaften, die mithilfe der Geometrieparameter über einen großen Bereich verändert werden können. Die ersten Anwendungen haben Anknüpfungspunkte zur Verwendung in der Sensorik, Fluoreszenzspektroskopie und als optische Pinzette aufgezeigt.

Plasmonic nanorods and nanoparticle-assemblies

Die vorliegenden Dissertation beschäftigt sich mit plasmonischen Nanopartikeln, deren Wechselwirkung mit Licht in einer Plasmonenschwingung resultiert. Suspensionen dieser Partikel zeigen kräftige Farben, da sich die Resonanzfrequenz der Plasmonenschwingung im sichtbaren Bereich des elektromagnetischen Spektrum befindet. Durch die Veränderung interner (Material, Größe, Form) oder externer Parameter (Brechungsindex der Umgebung, Abstand zu anderen plasmonischen Partikeln) lässt sich die Farbe der Partikel verändern, eine Verschiebung der Resonanzfrequenz kann beobachtet werden. Ihre Sensitivität gegenüber äußeren Bedingungen ist der Grund, weshalb plasmonische Nanopartikel als Sensoren eingesetzt werden können. Wichtig ist hierbei nicht nur, dass die Partikel eine hohe Sensitivität zeigen, sondern auch die Möglichkeit, reproduzierbar Partikel zu synthetisieren, die experimentellen Anforderungen entsprechen. In der vorliegenden Arbeit wird das Wachstum von reinen Gold- und mit Silber beschichteten Goldnanostäbchen untersucht. Des Weiteren werden plasmonische Nanopartikel als Orientierungs-, Brechungsindex- und Abstandssensoren verwendet. Die Synthese von Goldnanostäbchen erfolgt auf nasschemischen Weg, ihr anisotropes Wachstum aus isotropen Keimen wird durch zahlreiche Faktoren beeinflusst. In diesem Zusammenhang wurde ein Wachstumsmodell entwickelt, das neben dem Vorhandensein eines Stabilisators auch die Rolle von Bromid- und Silberionen herausstellt, die durch selektive Adsorption das Wachstum bestimmter Kristallflächen inhibieren. Zudem konnte gezeigt werden, dass die Potentialdifferenz zwischen Reduktions- und Oxidationsmittel klein sein muss, um ein langsames selektives Wachstum zu gewährleisten. rnDurch das Aufwachsen einer dünnen Silberschicht auf Goldnanostäbchen verbessert sich deren Qualität im Bezug auf die heterogene Linienbreite. Der “Plasmonic Focusing Effect”, die Änderung der Steigung des linearen Zusammenhangs von Plasmonenresonanz und Aspektverhältnis, konnte theoretisch berechnet und experimentell verifiziert werden. Durch die Aufnahme zeitaufgelöster Spektren und die Untersuchung des Verlaufs der Reaktion wurden sowohl Reaktionsordnung, als auch Aktivierungsenergie ermittelt. Das so gefundene kinetische Model erlaubt zudem die Vorhersage des Reaktionsprodukts zu verschiedenen Zeiten. rnEinzelne Goldnanostäbchen wurden in einer Gelmatrix bei verschiedenen Temperaturen untersucht, die Aufnahme der zeitlichen Variation der polarisationsabhängigen Streuintensität konnte genutzt werden, um den Kollaps des Gels zu charakterisieren. Neben der Verwendung einzelner plasmonischer Nanopartikel wurden auch Dimere, bestehend aus zwei Goldnanokugeln, untersucht. Nach der Kalibrierung der Resonanzfrequenz gegenüber des Abstandes der beiden Partikel durch externe Methoden (Lichtstreuung, Cryo- Elektronenmikroskopie) wurde der so gefundene exponentielle Zusammenhang verwendet, um sowohl den Brechungsindex der Umgebung, als auch den Abstand der beiden Goldnanokugeln zu bestimmen. Des Weiteren wurden Goldnanopartikeldimere benutzt, um ein als Linker verwendetes thermoresponsives Elastin-Polymer bei verschiedenen Temperaturen zu charakterisieren. Neben Aggregaten aus zwei Goldnanokugeln wurden auch so genannte “core-satellite” Strukturen synthetisiert, die um einen großen Goldnanopartikelkern viele kleine Goldnanopartikel tragen. Diese Partikel haben eine theoretisch vorhergesagte höhere Sensitivität gegenüber Brechungsindexänderungen, was in ersten Experimenten gezeigt werden konnte.

Fluctuation spectroscopy of single plasmonic nanostructures

Plasmonic nanoparticles are great candidates for sensing applications with optical read-out. Plasmon sensing is based on the interaction of the nanoparticle with electromagnetic waves where the particle scatters light at its resonance wavelength. This wavelength depends on several intrinsic factors like material, shape and size of the nanoparticle as well as extrinsic factors like the refractive index of the surrounding medium. The latter allows the nanoparticle to be used as a sensor; changes in the proximate environment can be directly monitored by the wavelength of the emitted light. Due to their minuscule size and high sensitivity this allows individual nanoparticles to report on changes in particle coverage.rnrnTo use this single particle plasmon sensor for future sensing applications it has to meet the demand for detection of incidents on the single molecule level, such as single molecule sensing or even the detection of conformational changes of a single molecule. Therefore, time resolution and sensitivity have to be enhanced as today’s measurement methods for signal read-out are too slow and not sensitive enough to resolve these processes. This thesis presents a new experimental setup, the 'Plasmon Fluctuation Setup', that leads to tremendous improvements in time resolution and sensitivity. This is achieved by implementation of a stronger light source and a more sensitive detector. The new setup has a time resolution in the microsecond regime, an advancement of 4-6 orders of magnitude to previous setups. Its resonance wavelength stability of 0.03 nm, measured with an exposure time of 10 ms, is an improvement of a factor of 20 even though the exposure time is 3000 times shorter than in previous reports. Thus, previously unresolvable wavelength changes of the plasmon sensor induced by minor local environmental alteration can be monitored with extremely high temporal resolution.rnrnUsing the 'Plasmon Fluctuation Setup', I can resolve adsorption events of single unlabeled proteins on an individual nanorod. Additionally, I monitored the dynamic evolution of a single protein binding event on a millisecond time scale. This feasibility is of high interest as the role of certain domains in the protein can be probed by a study of modified analytes without the need for labels possibly introducing conformational or characteristic changes to the target. The technique also resolves equilibrium fluctuations in the coverage, opening a window into observing Brownian dynamics of unlabeled macromolecules. rnrnA further topic addressed in this thesis is the usability of the nanoruler, two nanospheres connected with a spacer molecule, as a stiffness sensor for the interparticle linker under strong illumination. Here, I discover a light induced collapse of the nanoruler. Furthermore, I exploit the sensing volume of a fixed nanorod to study unlabeled analytes diffusing around the nanorod at concentrations that are too high for fluorescence correlation spectroscopy but realistic for biological systems. Additionally, local pH sensing with nanoparticles is achieved.