Behavioural analysis of mouse mutants with altered neuronal and glial genes

Im ersten Teil dieser Doktorarbeit beabsichtigte meine Arbeit, die funktionelle Beteiligung des CB1 Rezeptors, einer Hauptkomponente des neuronalen Endocannabinoid-Systems (ECS), an der Ausbildung von verschiedenen Verhaltensphänotypen mit Hilfe von konditionalen Mausmutanten, denen der CB1 Rezeptor auf verschiedenen neuronalen Unterpopulationen fehlt, aufzuschlüsseln und zu untersuchen. Verschiedene Verhaltensmodelle wurden hierzu getestet. Dabei lag der Fokus dieser Arbeit auf der CB1f/f;D1-Cre Mauslinie, welche der CB1 Rezeptor auf den D1 Rezeptor exprimierenden Neuronen des Striatums fehlt. Ich konnte zeigen, dass der Verlust des CB1 Rezeptors auf diesen Neuronen keinen Einfluss auf basale neurologische Funktionen, Gewicht, Bewegung, Exploration, Sozialverhalten, Angst und Stressbewältigung der Tiere hat, jedoch eine Beteiligung an der Entwicklung von Suchtverhalten gegeben ist. Bei Betrachtung des Kokain-induzierten Suchtverhaltens zeigten die konditionalen Mausmutanten eine reduzierte Suchtanfälligkeit sowohl im Vergleich zu Tieren mit einem totalen CB1 Rezeptor Verlust in allen Körperzellen, als auch zu genetisch unveränderten Kontrollmäusen beider Linien.rnDes Weiteren zeigen die Ergebnisse dieser Studie eine große, aber gegensätzliche Beteiligung des ECS bei der Regulation von Exploration in Abhängigkeit des Verlustes des CB1 Rezeptors auf GABAergen Neuronen des Vorderhirns und kortikalen glutamatergen Neuronen, jedoch nicht auf striatalen Neuronen alleine. Zusätzlich war ich in der Lage, die Wichtigkeit des genetischen Hintergrunds von Mauslinien nicht nur auf die Ausbildung von spezifischen Verhaltensphänotypen, sondern auch auf die Genexpression zu zeigen.rnIn dem zweiten Teil dieser Arbeit, in dem ich mich auf die Funktion von Gliazellen konzentrierte, wurden ebenfalls Mausmutanten in verschiedenen Verhaltensmodellen getestet. Ein genetisches Auslöschen des NG2 Glykoproteins in Gliazellen sorgt in den Knock-out Mäusen für ein schlechteres Hörvermögen und ein reduziertes Depressionsverhalten im Vergleich zu ihren Wildtyp-Kontrollmäusen. Interessanterweise zeigten diese Tiere auch eine reduzierte Empfänglichkeit bei chemisch induzierten epileptischen Krämpfen, was eine Rolle des NG2 Glykoproteins bei der Kontrolle der glutamatergen Homöostase vorschlägt, die wahrscheinlich durch Strukturänderungen der Neuron-Glia-Synapse verursacht wird. rn

Morbus Hunter : Neutralisationskapazität von Antikörpern unter Enzymersatztherapie und deren klinischen Auswirkungen

Morbus Hunter, eine lysosomale Speicherkrankheit, ist eine seltene, progrediente, x-chromosomal vererbte Stoffwechselkrankheit, die durch ein Defizit an Iduronat-2-sulfatase (IDS) hervorgerufen wird. Als Folge daraus erfolgt kein Abbau von Heparan- und Dermatansulfat und die Glykosaminoglykane reichern sich in de Lysosomen der Zelle an. M. Hunter ist eine Multisystemerkrankung und weist ein breites klinisches Spektrum mit interindividuell unterschiedlichem Krankheitsbeginn, Ausprägungen und Progression der Symptome auf. Seit 2007 besteht die Therapieoption einer Enzymersatztherapie (ERT) mit Elaprase®. Einige Patienten entwickeln Antikörper gegen das substituierte Enzym, welche partiell neutralisierende Eigenschaften besitzen. Ziel dieser Untersuchung war es zu klären, ob die Neutralisationskapazität der gebildeten Antikörper mittels einer Bestimmung im Mischserum festgestellt werden kann und ob persistierende Antikörper mit Neutralisationskapazität zu einer Einschränkung der Wirksamkeit der Enzymersatztherapie führen. Es sollte weiterhin untersucht werden, ob sich mittels Messung der neuronenspezifischen Enolase (NSE) und S-100 Rückschlüsse auf eine neuropathische Beteiligung ziehen lassen, da bis jetzt noch keine klinische oder biochemische Messmethode existiert, die für M. Hunter-Patienten eine verlässliche Vorhersage für eine neuropathische Beteiligung bietet. 30 Patienten wurden in die retrospektive/prospektive Kohortenstudie eingeschlossen. Bei der Bestimmung der IDS-Aktivität im Mischserum mit einem gesunden Menschen zeigten fünf der Patienten (17%) in zwölf Mischseren eine um ≥ 40% reduzierte Aktivität. Zwei (7%) der 30 untersuchten Patienten wurden mit dieser Methode als positiv für persistierende neutralisierende Antikörper identifiziert. Zum gleichen Ergebnis bezüglich der persistierenden neutralisierenden Antikörper führten die Anti-Elaprase®-Immunglobulin-Bestimmungen unter Berücksichtigung des Bestimmungszeitpunkts, die bei Shire Pharmaceuticals durchgeführt wurden. Die Untersuchungsergebnisse lassen den Schluss zu, dass die gebildeten Antikörper auch intraindividuell unterschiedlich sind. Zudem interagieren sie mit den verschiedensten Epitopen des Enzyms der ERT und besitzen nicht alle neutralisierende Eigenschaften. Aufgrund der heterogenen Zusammensetzung folgt die Hemmung der Enzymaktivität vermutlich keiner eindeutigen Kinetik. Anti-Elaprase®-Immunglobulin G spielt für die Neutralisationskapazität jedoch eine wichtige Rolle. Die Auswertung und Beurteilung der Einschränkung der Wirksamkeit der Therapie hervorgerufen durch die Antikörper mit Neutralisationskapazität gestaltete sich kompliziert. Im Ergebnis zeigte sich, dass sich die beiden Patienten mit persistierenden neutralisierenden Antikörpern in der Entwicklung der klinischen Parameter interindividuell stark unterschieden. Um einen Zusammenhang zwischen klinischem Verlauf und Antikörperbildung gegen die ERT zu finden, müssen in einem größeren Patientenkollektiv mehr Patienten mit persistierenden neutralisierenden Antikörpern identifiziert werden und der Einfluss der Antikörper untersucht werden. Die Untersuchung der NSE und S-100 ergab, dass weder die Konzentration der NSE noch der S-100 Rückschlüsse auf die neuropathische Beteiligung des Patienten zulässt.

Comparative functional analysis of factors controlling glial differentiation in Drosophila and mouse

The present study is a comparative functional analysis of three factors controlling glial differentiation in mouse (Fyn Src kinase, hnRNPF/H and NG2) and their homologues in Drosophila (Src42A and 64B, Glorund and Kon-tiki (Kon)). In Drosophila, mutations in any of these genes were not associated with major embryonic neurodevelopmental phenotypes. Src kinases and Glorund were shown to be ubiquitously expressed, whereas kon mRNA showed selective expression in muscles as well as in central and peripheral glia. Kon was also shown to be expressed in L3 larvae with high levels of protein accumulation at the neuromuscular junction (NMJ) and in muscles in the form of speckles. Knockdown of kon in glia resulted in NMJ phenotypes, mainly characterized by a significant increase in bouton number and a reduction in α-Konecto staining intensity at the NMJ. From the three glial layers ensheathing the peripheral nervous system, subperineurial glial showed to be the one contributing the most to kon knockdown dependent NMJ phenotypes, while perineurial glia only had a minor role. The knockdown of kon in glia also showed to affect Glutamate receptor subunit (α-GluRIIA) clustering in the postsynapse, same as microtubule arrangement in the presynapse, as seen by α-Futsch pattern interruptions and alterations. kon knockdown in glia also resulted in impaired axonal transport, as seen by the accumulation of Bruchpilot-positive vesicles along the nerves, abnormal formation of neuronal derived protrusions and swellings, filled with vacuole-like structures. Glia number along the peripheral nerves is also reduced as consequence of kon knockdown. Muscle derived Kon was shown to accumulate at the NMJ and play a role in bouton consolidation and to interfere with phagocytosis of ghost boutons. NMJ bouton and branch number was also significantly increased in Kon overexpression in glia. The overexpression of Kon in glia also resulted in a massive elongation of the ventral nerve cord, which served in a suppressor screen to identify intracellular interaction partners of Kon in glia. It was shown that Kon is processed in glia and preliminary results indicate that the metalloendopeptidase Kuzbanian (the fly homologue of ADAM10) may play a role in the shedding of Konecto. In the present work, Kon is shown as a multifunctional gene with various roles in glia-neuron and glia-neuron-muscle interaction.

The physiological role of APP in the activation of neuroprotective signaling mechanisms

Accumulating evidence indicates that loss of physiological amyloid precursor protein (APP) function leads to enhanced susceptibility of neurons to cellular stress during brain aging. This study investigated the neuroprotective function of the soluble APP ectodomain sAPPα. Recombinant sAPPα protected primary hippocampal neurons and neuroblastoma cells from cell death induced by trophic factor deprivation. This protective effect was abrogated in APP-depleted neurons, but not in APLP1-, APLP2- or IGF1-R-deficient cells, indicating that expression of holo-APP is required for sAPPα-dependent neuroprotection. Strikingly, recombinant sAPPα, APP-E1 domain and the copper-binding growth factor-like domain (GFLD) of APP were able to stimulate PI3K/Akt survival signaling in different wildtype cell models, but failed in APP-deficient cells. An ADAM10 inhibitor blocking endogenous sAPPα secretion exacerbated neuron death in organotypic hippocampal slices subjected to metabolic stress, which could be rescued by exogenous sAPPα. Interestingly, sAPPα-dependent neuroprotection was unaffected in neurons of APP-ΔCT15 mice which lack the intracellular C-terminal YENPTY motif of APP. In contrast, sAPPα-dependent Akt signaling was completely abolished in APP mutant cells lacking the C-terminal G-protein interaction motif and by specifically blocking Gi/o-dependent signaling with pertussis toxin. Collectively, the present thesis provides new mechanistic insights into the physiological role of APP: the data suggest that cell surface APP mediates sAPPα-induced neuroprotection via Go-protein-coupled activation of the Akt pathway.

Blood-CNS barriers in neurodegenerative diseases

The blood-brain barrier (BBB) and the blood-spinal cord barrier (BSCB) separate the brain and the spinal cord from the circulating blood and are important for the maintenance of the CNS homeostasis. They build a physical barrier thereby protecting the CNS from pathogens and toxic agents, and their disruption plays a crucial role in the pathogenesis of several CNS disorders. In this thesis, the blood-CNS-barriers were studied via in vitro models in two case studies for neurodegenerative disorders, in particular Alzheimer’s disease (AD) and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). The first model evaluates treatment possibilities of AD using nanotechnology-based strategies. Since the toxic amyloid-β42 (Aβ42) peptide plays a crucial role in the pathogenesis of AD, reduced generation or enhanced clearance of Aβ42 peptides are expected to modify the disease course in AD. Therefore, several Aβ42-lowering drugs like flurbiprofen had been tested in clinical trials, but most of them failed due to their low brain penetration. Here, flurbiprofen was embedded in polylactide (PLA) nanoparticles and its transport was examined in an in vitro BBB model. The embedding of flurbiprofen into the nanoparticles disguised its cytotoxic potential and enabled the administration of higher drug concentrations which resulted in a sufficient transport of the drug across an endothelial cell monolayer. These results demonstrate that non-permeable drugs can be transported efficiently via nanoparticles and that these nanotechnology-based strategies are a promising tool to generate novel therapeutic options for AD and other CNS diseases. rnThe focus of the second project was to investigate the impaired integrity of the BSCB in a mouse model for ALS. About 20% of all familial ALS cases are associated with missense mutations or small deletions in the gene that encodes Cu/Zn-superoxide dismutase 1 (SOD1). To date, the molecular mechanisms resulting in ALS are still unknown, but there is evidence that the disruption of the BSCB is one of the primary pathological events. In both familial and sporadic ALS patients, loss of endothelial integrity and endothelial cell damage was observed, and studies with SOD1 transgenic mice demonstrated that the BSCB disruption was found prior to motor neuron degeneration and neurovascular inflammation. Thus, an in vitro model for ALS endothelial cells was generated which exhibited comparable integrity characteristics and tight junction (TJ) protein expression profiles as isolated primary endothelial cells of the BSCB of SOD1 transgenic mice. In this, an alteration of the βcat/AKT/FoxO1 pathway, which regulates the expression of the TJ protein claudin-5, could be observed. These data furthermore indicate that ALS is a neurovascular disease, and understanding of the primary events in ALS pathogenesis will hopefully provide ideas for the development of new therapeutic strategies. rn

Die Rolle der Oligodendrozyten-Vorläuferzellen im Zentralen Nervensystem

Im Fokus dieser Studie stehen die zu den Gliazellen zählenden OPC, sowie das von diesen exprimierte Typ-1 Membranprotein NG2. Dieses wird auf eine Prozessierung durch α- und γ-Sekretase, in Analogie zu Proteinen wie Notch oder APP, untersucht.rnEine solche Prozessierung ginge mit zusätzlichen intrazellulären Spaltprodukten neben der bekannten Ektodomäne einher. Da OPC mit dem Neuronalen Netzwerk durch synaptische Innervierungen in Verbindung stehen, stellt sich die Frage, ob diese mit der Spaltung von NG2 in Verbindung gebracht werden können. Dazu käme mechanistisch beispielsweise eine aktivitätsabhängige Regulierung der Proteolyse, wie sie jüngst für das neuronale synaptische cell adhesion molecule Neuroligin gezeigt werden konnte, in Frage. Zudem werden eine physiologische Rolle der NG2 Ektodomäne bzw. der möglichen intrazellulären Fragmente untersuchen. Insbesondere potentielle neuromodulatorische Funktionen sind hier von Interesse, da diese die OPC tiefer in das Neuronale Netzwerk integrieren würden. Die Existenz eines NG2 Homologes in D. melanogaster, wirft weiterhin die Frage auf, in wie weit diese Mechanismen in diesem Modellsystem konserviert sind.rnIn Analogie zur Lokalisierung von Markerproteinen an Neuron-Neuron Synapsen in vivo, ergibt sich die Frage ob sich die synaptischen Verbindungen zwischen Neuronen und OPC in ähnlicher Weise darstellen lassen.rnEin Charakteristikum von OPC ist die Teilungsaktivität in sich entwickelnden und adulten Säugern. Zudem gibt es Evidenzen für direkte funktionelle Verknüpfungen zwischen dem NG2 Protein und dem Teilungsmodus der OPC. Deshalb war ein weiteres Ziel mögliche Änderungen in der Zellteilung der OPC, die mit dem NG2 Protein in Verbindung stehen könnten, in NG2 -/- Mäusen zu untersuchen.rn

Excited-state dynamics in donor-acceptor systems for energy conversion

In dieser Arbeit werden die Dynamiken angeregter Zustände in Donor-Akzeptorsystemen für Energieumwandlungsprozesse mit ultraschneller zeitaufgelöster optischer Spektroskopie behandelt. Der Hauptteil dieser Arbeit legt den Fokus auf die Erforschung der Photophysik organischer Solarzellen, deren aktive Schichten aus diketopyrrolopyrrole (DPP) basierten Polymeren mit kleiner Bandlücke als Elektronendonatoren und Fullerenen als Elektronenakzeptoren bestehen. rnEin zweiter Teil widmet sich der Erforschung von künstlichen primären Photosynthesereaktionszentren, basierend auf Porphyrinen, Quinonen und Ferrocenen, die jeweils als Lichtsammeleinheit, Elektronenakzeptor beziehungsweise als Elektronendonatoren eingesetzt werden, um langlebige ladungsgetrennte Zustände zu erzeugen.rnrnZeitaufgelöste Photolumineszenzspektroskopie und transiente Absorptionsspektroskopie haben gezeigt, dass Singulettexzitonenlebenszeiten in den Polymeren PTDPP-TT und PFDPP-TT Polymeren kurz sind (< 20 ps) und dass in Mischungen der Polymere mit PC71BM geminale Rekombination von gebundenen Ladungstransferzuständen ein Hauptverlustkanal ist. Zudem wurde in beiden Systemen schnelle nichtgeminale Rekombination freier Ladungen zu Triplettzuständen auf dem Polymer beobachtet. Für das Donor-Akzeptor System PDPP5T:PC71BM wurde nachgewiesen, dass die Zugabe eines Lösungsmittels mit hohem Siedepunkt, und zwar ortho-Dichlorbenzol, die Morphologie der aktiven Schicht stark beeinflusst und die Solarzelleneffizienz verbessert. Der Grund hierfür ist, dass die Donator- und Akzeptormaterialien besser durchmischt sind und sich Perkolationswege zu den Elektroden ausgebildet haben, was zu einer verbesserten Ladungsträgergeneration und Extraktion führt. Schnelle Bildung des Triplettzustands wurde in beiden PDPP5T:PC71BM Systemen beobachtet, da der Triplettzustand des Polymers über Laungstransferzustände mit Triplettcharakter populiert werden kann. "Multivariate curve resolution" (MCR) Analyse hat eine starke Intensitätsabhängigkeit gezeigt, was auf nichtgeminale Ladungsträgerrekombination in den Triplettzustand hinweist.rnrnIn den künstlichen primären Photosynthesereaktionszentren hat transiente Absorptionsspektroskopie bestätigt, dass photoinduzierter Ladungstransfer in Quinon-Porphyrin (Q-P) und Porphyrin-Ferrocen (P-Fc) Diaden sowie in Quinon-Porphyrin-Ferrocen (Q-P-Fc) Triaden effizient ist. Es wurde jedoch auch gezeigt, dass in den P-Fc unf Q-P-Fc Systemen die ladungsgetrennten Zustände in den Triplettzustand der jeweiligen Porphyrine rekombinieren. Der ladungsgetrennte Zustand konnte in der Q-P Diade durch Zugabe einer Lewissäure signifikant stabilisiert werden.