Untersuchungen über Wechselwirkungen zwischen Proteinen der Leber und dem großen Hüllprotein des Hepatitis-B-Virus

Zusammenfassung:Im Infektionszyklus des Hepatitis-B-Virus spielt das große L-Hüllprotein mit seiner einzigartigen PräS1-Domäne eine zentrale Rolle. Es vermittelt die Bindung und Aufnahme in die Leberzelle, die Verpackung der Nukleokapside in die Virushülle, die Regulation der cccDNA-Amplifikation und eine transkriptionelle Aktivierung in der Wirtszelle. Zur Erfüllung seiner vielfältigen Aufgaben benötigt das L-Protein Unterstützung durch Wirtzellfaktoren, von denen einige im Rahmen dieser Untersuchung durch Verwendung von PräS1-Konstrukten als Fängerproteine im Hefe-Zwei-Hybrid-System identifiziert wurden. Mehrere Klone, die im Hefe-Zwei-Hybrid-Test mit dem C-terminalen PräS1-Fängerprotein (Aminosäure 44-108) isoliert worden waren, enthielten Teile der cDNA von gamma2-Adaptin, einem mutmaßlichen Mitglied der Clathrin-Adaptor-Proteine. Diese sind für intrazelluläre Membrantransportprozesse mittels clathrinumhüllter Vesikel verantwortlich. Unter den interagierenden Klonen, die mit dem N-terminalen Konstrukt des L-Proteins (Aminosäure 1-70) isoliert worden waren, befand sich überproportional häufig eine cDNA, die der schweren Kette H4 der Inter-Alpha-Trypsin-Inhibitor-Familie homolog war. H4 besitzt vermutlich bei der 'Akute-Phase-Reaktion', die Entzündungen folgt, und bei der Stabilisierung der extrazellulären Matrix physiologische Bedeutung. Weitere Klone kodierten für die Serinprotease C1r. Diese ist Bestandteil des C1-Komplex, der ersten Komponente des klassischen Komplementsystems. Die Spezifität der Bindung zwischen den positiven Klonen und der PräS1-Domäne wurde in weiteren biochemischen Interaktionstests bestätigt, sodaß H4, C1r und gamma2-Adaptin als Wirtszellfaktoren in der Physiologie des Hepatitis-B-Virus wahrscheinlich eine Rolle spielen.Abstract:Little is known about host cell factors necessary for hepatitis B virus assembly and infectivity. Central to virogenesis is the large L envelope protein that mediates hepatocyte receptor binding, envelopment of viral capsids, regulation of supercoiled DNA amplification and transcriptional transactivation. To assess its multiple functions and host-protein assistance involved, we here initiated a yeast two-hybrid screen using the L-specific preS1 domain as bait to screen a human liver cDNA library for L-interacting proteins. One of the most prominent cDNAs interacting with aminoacid sequence 44-108 of L-protein encodes for gamma2-adaptin, a novel clathrin adaptor-related protein responsible for protein sorting and trafficking. Among the clones interacting with the N-terminal construct of L-protein (aminoacid sequence 1-70), a frequently isolated cDNA corresponds to the gene for inter-alpha-trypsin family heavy chain H4, likely to be involved in acute inflammatory phase response and stabilization of extracellular matrices. Some other interacting clones were found to carry the cDNA for the serine protease C1r, a subunit of the C1 complex which initiates the classical complement cascade. The specificity of the interaction between the positive clones and the preS1 domain was further confirmed in independent biochemical experiments. Taken together, the results suggest a role for H4, C1r and gamma2-adaptin as host-cell factors in L-mediated process of viral biogenesis and/or pathogenesis.

Isolation and identification of molecular partners of the proteins encoded by the Drosophila tumor suppressor gene lethal(2)tumorous imaginal discs

Ziel dieser Arbeit war es, die funktionelle Bedeutung des Drosophila melanogaster tumor suppressor Gens lethal(2)tumorous imaginal discs (l(2)tid) durch die Identifikation von molekularen Partnern der vom Gen kodierten Proteine zu etablieren. Mit dem Screening einer Expressionsbibliothek mittels des Hefe-Di-Hybrid-Systems wurde das Protein Patched (Ptc) als ein neues Tid-bindendes Protein identifiziert. Ptc ist ein Zentralregulator der Hedhehog-Signalkette. Diese ist in der Entwicklung konserviert und in manchen humanen Krebsarten verwickelt. Die Tid/Ptc-Interaktion wurde mittels unabhängigen biochemischen Methoden wie dem GST-pulldown-Test oder der Immunopräzipitation überprüft. Außerdem ergaben funktionelle Studien in tumorosen Imaginalscheiben einen möglichen inhibitorischen Effekt von Tid über die Hh Signaltransduktion.Im letzten Teil dieser Arbeit wurde die Interaktion zwischen Tid und dem E-APC-Protein (Adenomatous polyposis coli) bewiesen. Polakis und seine Gruppe zeigten durch Studien mit dem Hefe-Di-Hybrid-System und in vitro, dass das hTid mit dem APC-Protein interagiert. Um dies auch auf Drosophila-Ebene zu überprüfen, wurden Immunopräzipitation-Studien mit den Drosophila-Gegenstücken durchgeführt. Diese Studien zeigen zum ersten Mal eine direkte Interaktion beider Proteine in vivo.

Charakterisierung und Stabilität von Arthropoden-Hämocyanin

Hämocyanine sind große, multimere Sauerstofftransport- proteine, die frei gelöst in der Hämolymphe von Arthropoden und Mollusken vorkommen.Zur Charakterisierung verschiedener Arthropoden-hämocyanine wurden deren molare Massen bestimmt. Die mit einer Vielwinkel-Laser-Lichtstreuapparatur ermittelten Molekulargewichte zeigten eine grosse Schwankungsbreite. Dies konnte auf Ungenauigkeiten der zur Berechnung der Molekulargewichte verwendeten spezifischen Extinktions- koeffizienten und Brechungsindex-Inkremente zurückgeführt werden.Mit der Methode der Massenspektrometrie (MALDI-TOF) bestimmte Molekulargewichte einzelner Untereinheiten des Hämocyanins der Vogelspinne Eurypelma californicum zeigten eine sehr gute Übereinstimmung mit aus der Sequenz errechneten Werten.Für das 24-mere Spinnenhämocyanin von Eurypelma californicum wurde die Stabilität gegenüber GdnHCl und der Temperatur auf den verschiedenen strukturellen Ebenen des Proteins untersucht.Viele Stabilitätsuntersuchungen werden an kleinen Proteinen durchgeführt, deren Entfaltung kooperativerfolgt. Bei größeren Proteinen mit unterschiedlichen strukturellen Bereichen (Domänen) ist der Entfaltungs-prozess weitaus komplexer. Ziel war es, durch die Denaturierung des Spinnen-Hämocyanins Erkenntnisse über die Stabilität und Entfaltung der verschiedenen strukturellen Ebenen eines so großen Proteinkomplexes zu gewinnen.Ein wichtiges Charakteristikum für die Interpretation der Entfaltungsexperimente ist die starke Löschung der Tryptophanfluoreszenz im oxygenierten Spinnen-Hämocyanin. Die Löschung kann vollständig durch Förster-Transfer erklärt werden kann. Sie bleibt auf die einzelnen Untereinheiten beschränkt und stellt somit ein reines O₂-Beladungssignal dar.Unter Einwirkung von GdnHCl dissoziiert das native, 24-mere Spinnen-Hämocyanin ohne die Entstehung langlebiger Inter- mediate. Die Untereinheiten werden durch das Oligomer stabilisiert. Die Entfaltung eines Monomers, der Unter- einheit e, folgt einer Hierarchie der verschiedenen strukturellen Ebenen des Moleküls. Die Entfaltung beginnt zunächst von außen mit der Auflockerung der Tertiärstruktur. Der Kern von Domäne II mit dem aktiven Zentrum weist hingegen eine besondere Stabilität auf.Die ausgeprägte Hitzestabilität des Eurypelma-Hämocyanins hängt vom Oligomerisierungsgrad, dem verwendeten Puffer und dessen Ausgangs-pH-Wert ab und spiegelt offensichtlich die extremen Lebensbedingungen im Habitat wider.

Untersuchung der Strukturdynamik arbeitender F1-ATPase und ATP-Synthase aus Micrococcus luteus in Einzelschußexperimenten mit Synchrotronstrahlung

ZusammenfassungDie ATP-Synthase koppelt im Energiestoffwechsel der Zellen den Protonentransport über die biologische Membran mit der Synthese des energiespeichernden Moleküls ATP aus ADP und Phosphat. ATP-Synthasen bestehen aus 2 Subkomplexen, wobei der katalytische F1-Teil von der membranständigen Domäne abgelöst werden kann und nur zur ATP-Hydrolyse fähig ist. Der hochkooperative Reaktionsmechanismus der dreizentrigen ATP-Synthasen ist weitgehend unklar.Im Rahmen dieser Arbeit wurde der ATP-Synthasekomplex und ihr wasserlösliches katalytisches F1-Fragment aus Micrococcus luteus in präparativem Maßstab mittels chromatographischer Trennmethoden isoliert. Die Überprüfung der Funktionalität beider Enzyme erfolgte mit enzymatischen Methoden. Durch zeitaufgelöste Röntgenkleinwinkelstreuung wurde die Strukturdynamik der arbeitenden ATP-Synthase und ihres F1-Fragmentes aus Micrococcus luteus im Laufe des ATP-Hydrolysezyklus untersucht. Diese Methode diente zum Nachweis weiträumiger Konformationsänderungen innerhalb der arbeitenden Enzyme unter nativen physiologischen Bedingungen. Die zeitaufgelösten Streuexperimente fanden an der ESRF (Europäische Synchrotronstrahlungsquelle) in Grenoble (F) statt. Dort wurden für beide Enzyme im Laufe des ATP-Hydrolysezykus molekulare Bewegungen nachgewiesen. Als Referenz zu den zeitaufgelösten Messungen dienten statische Messungen zur Strukturuntersuchung der Proteine am schwächeren DESY. Anhand dieser Strukturdaten wurden Molekülmodelle der F1-ATPase und ATP-Synthase aus Micrococcus luteus konstruiert. Das Molekülmodell der F1-ATPase war die Grundlage zur Modellierung einzelner Teilschritte des ATP-Hydrolysezyklus bei 20°C. Die experimentellen Daten wurden mit einer Kippbewegung der membranseitigen Domäne der katalytischen b-Untereinheiten der F1-ATPase während des ATP-Hydrolysezyklus interpretiert.

Untersuchungen über das Schalten photochromer Indolinospirobenzopyrane

Zusammenfassung Im Rahmen dieser Arbeit wurden grundlegende Aspekte der Photomodulation der Aktivität von Biomolekülen behandelt. Im ersten Teil der Arbeit wurde ein Weg ausgearbeitet, photochrome Indolinospirobenzopyrane kovalent an Immunoglobulin G zu koppeln. Dazu wurde ein vollständig wässriges Verfahren entwickelt, was die Synthese eines noch nicht in der Literatur beschriebenen wasserlöslichen und gleichzeitig zur Kopplung befähigten Indolinospirobenzopyrans voraussetzte. Der zweite Teil der Arbeit beschäftigte sich mit der spektroskopischen Charakterisierung einer Reihe von photochromen Indolinospirobenzopyranen. Zur Untersuchung der Kinetik des Schaltprozesses wurde die zeitaufgelöste, transiente Absorptionsspektroskopie eingesetzt. Die erhaltenen Daten wurden vor dem Hintergrund von in der Literatur postulierten Schaltmechanismen kontrovers diskutiert. Darüber hinaus wurden mit Hilfe der elektrooptischen Absorptionsmessung die Dipolmomente im Grundzustand und im ersten angeregten Zustand für eine Reihe von Indolinospirobenzopyranen bestimmt. Zur Durchführung der Messungen wurde die bestehende Apparatur zu Messung von photochromen Verbindungen im photostationären Gleichgewicht erweitert. Erwartungsgemäß wurden für die Merocyaninformen sehr große Dipolmomente um 18 Debye gefunden. Das Dipolmoment im ersten angeregten Zustand betrug dagegen nur etwa 12 Debye. Im Fall der Spiroformen war das Dipolmoment im Grundzustand klein (3-5 Debye), während es im ersten angeregten Zustand auf etwa 20 D anstieg.

Development of a comprehensive on-line multidimensional high performance column liquid chromatography system for protein and peptide mapping with integrated size selective sample fractionation

Aufbau einer kontinuierlichen, mehrdimensionalen Hochleistungs-flüssigchromatographie-Anlage für die Trennung von Proteinen und Peptiden mit integrierter größenselektiver ProbenfraktionierungEs wurde eine mehrdimensionale HPLC-Trennmethode für Proteine und Peptide mit einem Molekulargewicht von <15 kDa entwickelt.Im ersten Schritt werden die Zielanalyte von höhermolekularen sowie nicht ionischen Bestandteilen mit Hilfe von 'Restricted Access Materialien' (RAM) mit Ionenaustauscher-Funktionalität getrennt. Anschließend werden die Proteine auf einer analytischen Ionenaustauscher-Säule sowie auf Reversed-Phase-Säulen getrennt. Zur Vermeidung von Probenverlusten wurde ein kontinuierlich arbeitendes, voll automatisiertes System auf Basis unterschiedlicher Trenngeschwindigkeiten und vier parallelen RP-Säulen aufgebaut.Es werden jeweils zwei RP-Säulen gleichzeitig, jedoch mit zeitlich versetztem Beginn eluiert, um durch flache Gradienten ausreichende Trennleistungen zu erhalten. Während die dritte Säule regeneriert wird, erfolgt das Beladen der vierte Säule durch Anreicherung der Proteine und Peptide am Säulenkopf. Während der Gesamtanalysenzeit von 96 Minuten werden in Intervallen von 4 Minuten Fraktionen aus der 1. Dimension auf die RP-Säulen überführt und innerhalb von 8 Minuten getrennt, wobei 24 RP-Chromatogramme resultieren.Als Testsubstanzen wurden u.a. Standardproteine, Proteine und Peptide aus humanem Hämofiltrat sowie aus Lungenfibroblast-Zellkulturüberständen eingesetzt. Weiterhin wurden Fraktionen gesammelt und mittels MALDI-TOF Massenspektrometrie untersucht. Bei einer Injektion wurden in den 24 RP-Chromatogrammen mehr als 1000 Peaks aufgelöst. Der theoretische Wert der Peakkapazität liegt bei ungefähr 3000.

Untersuchungen zur posttranslationalen präS-Translokation des großen Hüllproteins des Hepatitis-B-Virus

Untersuchungen zur posttranslationalen präS-Translokation des großen Hüllproteins des Hepatitis-B-Virus. Das große (L) Hüllprotin des Hepatitis-B-Virus (HBV) besitzt die ungewöhnliche Eigenschaft, mittels partieller, posttranslationaler Translokation seiner präS-Domäne durch intrazelluläre Membranen zwei unterschiedliche Transmembrantopologieen auszubilden. Unter Berücksichtigung der Hypothese eines HBV-spezifischen Transmembrankanals, der sich möglicherweise während der Virusmorphogenese bilden und die präS-Translokation ermöglichen könnte, wurden Parameter untersucht, welche die L-Topologie beeinflussen. Dazu wurden Wildtyp-L-Proteine und L-Mutanten in Säugerzellen synthetisiert und deren Topologie mittels Proteaseschutzversuchen untersucht. Ich konnte zeigen, daß alle Faktoren, für die angenommen wurde, daß sie für die Ausbildung einer HBV-spezifischen Pore und die damit verbundene präS-Reorientierung wichtig seien, entbehrlich sind. Im einzelnen konnte nachgewiesen werden, daß die posttranslationale präS-Translokation weder die Helferfunktion der HBV S und M Proteine, noch die kovalente Dimerausbildung der Hüllproteine benötigt. Weiterhin ergaben die Untersuchungen, daß keine der amphipathischen Transmembrandomänen des L-Proteins an der präS-Reorientierung beteiligt ist. Vielmehr wurde die hydrophobe Transmembrandomäne 2 (TM2) als ausreichend und essentiell für diesen Prozeß identifiziert. Zellfraktionierungsstudien ergaben weiterhin, daß die präS-Reorientierung und damit die duale Topologie des L-Proteins innerhalb des Endoplasmatischen Retikulums (ER) herbeigeführt wird. Letztlich konnte eine Interaktion des L-Proteins mit zellulären Chaperonen (Hsc70, Hsp40, BiP) gezeigt werden, was eine Beteiligung dieser Proteine am Translokationsprozeß nahelegt.

Zur Kooperativität des Vogelspinnen-Hämocyanins

Zusammenfassung Kooperativität bei Atmungsproteinen bedeutet eine Änderung der O2-Affinität während der Beladung mit O2 und läßt sich durch die Wechselbeziehung zwischen O2-Beladung und Konformation beschreiben. In dieser Arbeit wurde das 24-mere Hämocyanin der Vogelspinne Eurypelma californicum bzgl. Beladung und Konformationen sowohl auf der Ensemble- wie auch auf der Einzel-Molekül-Ebene charakterisiert. EnsembleDie Bindung von O2 an Hämocyanine ist mit einer drastischen Abnahme der Fluoreszenz-Quantenausbeute verbunden. Durch Vergleich von theoretisch und experimentell bestimmten Quantenausbeuten konnte gezeigt werden, daß die Löschung auf Förster-Transfer zurückzuführen ist, und daß kein Einfluß der Oligomerisierung, Protein-Konformation, Beweglichkeit oder Tierart besteht. Die Konformation von Hämocyaninen konnte mit Crosslinkern im oxy- und deoxy-Zustand fixiert werden. Die Charakterisierung der Produkte führte zu einer neuen Vorstellung, wie unterschiedliche Affinitäten realisiert sein können. Hierbei kommt der Dynamik der Protein-Matrix eine entscheidende Rolle zu. Einzel-MoleküleMittels Zwei-Photonen-Anregung konnten erstmalig einzelne Proteine über ihre intrinsische Tryptophan-Fluoreszenz nachgewiesen werden. Zum einen gelang es, Modellsysteme mit nur 340 Trp abzubilden, andererseits konnte die Diffusion einzelner Hämocyanine (148 Trp) mit Hilfe der Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie nachgewiesen werden.Einzelne Hämocyanine konnten durch Adsorption und mildes Eintrocknen an verschiedenen Oberflächen immobilisiert werden. Mittels Atomarer Kraft-Mikroskopie (AFM) ließen sich individuelle Hämocyanine abgebilden, wobei Details der Quarärstruktur aufgelöst werden konnten.

In vivo- und In vitro-DNA-Verpackung in virusähnliche Partikel des Humanen Papillomvirus Typ 33

Die Rolle der DNA-Bindungsdomäne der Kapsidproteine L1 und L2 humaner Papillomviren (HPV) wird bezüglich der in vitro DNA-Verpackung kontrovers diskutiert und ist für die in vivo DNA-Verpackung noch ungeklärt. Ich konnte zeigen, dass die L1 Proteine der HPV Typen 16, 18 und 33 DNA binden, nicht aber das HPV33 L2 Protein. Die DNA-Bindungsdomäne habe ich auf die letzten sieben Aminosäuren des Carboxyterminus eingegrenzt. In Funktionsanalysen zeigte ich, dass die DNA-Bindungsdomäne des L1 Proteins für den Einschluss von Markerplasmid DNA in Kapside in einem in vivo Ansatz essentiell ist, nicht aber für eine in vitro DNA-Verpackung. Das L2 Protein, das in Kapside eingebaut wurde, denen die L1 DNA-Bindungsdomäne fehlte, konnte die DNA-Verpackung nicht aufrechterhalten.Zusätzlich habe ich die Infektiösität in vitro und in vivo hergestellter DNA-haltiger Kapside (Pseudovirionen) verglichen. Dabei konnte ich zeigen, dass in vivo gewonnene Pseudovirionen, die DNA in Form von Chromatin enthalten, bis zu fünffach infektiöser sind als Pseudovirionen, die in vitro hergestellt wurden und histonfreie DNA enthalten. Biochemische und strukturelle Unterschiede konnten zwischen den zwei Arten von Pseudovirionen nicht festgestellt werden. Chromatin scheint demzufolge die Infektiösität der Pseudovirionen zu verstärken.

Struktur und rheologische Eigenschaften von PS-PI und PS-PB Blockcopolymeren

In der vorliegenden Arbeit wurde das Orientierungsverhalten der Mikrophasenseparation von industriellen und eigens synthetisierten Blockcopolymeren unter Extrusion untersucht.Dabei stellte sich heraus, daß bis auf eine Probe mit hexagonaler Morphologie die Mikrophasenseparationen der untersuchten Systeme unter dem Einfluß der Scherströmung derart in Extrusionsrichtung gedehnt werden, daß eine Art 'pseudo-lamellare' Morphologie entsteht. Aus Röntgenstreumessungen wurde die Güte dieser Orientierung in Form von Ordnungsparametern bestimmt. Dabei zeigte sich, daß der Orientierungsgrad der Proben deutlich von der Scherrate der Extrusion abhängt.Mit Hilfe von Zugversuchen konnte die mechanische Festigkeit der untersuchten Extrudate analysiert werden, wobei sich eine dem Ordnungsgrad analoge Scherratenabhängigkeit zeigte. Somit hat die rheologische Beanspruchung der Materialien einen deutlichen Einfluß auf deren mechanische Festigkeit.Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurde die Orientierung und die Reorientierung einer lamellaren Morphologie durch oszillatorische Verscherung mit großen Amplituden (LAOS) untersucht.Bei der Untersuchung des Orientierungsexperimentes zeigte sich, daß die exponentielle Abnahme der relativen Intensität des 3. Obertons (I3/I1) des fouriertransformierten Spektrums des Drehmomentes dazu genutzt werden konnte, um die Kinetik des Orientierungsprozesses zu bestimmen.Bei der Untersuchung des Umorientierungsprozesses konnte gezeigt werden, daß die nicht-lineare mechanische Antwort geeignet ist, um die Entwicklung bimodaler Orientierungsverteilungen zu verfolgen.

Zwei-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie und -Spektroskopie von Sauerstofftransportproteinen

In dieser Arbeit wurde die intrinsische Tryptophanfluoreszenz von Proteinen nach Zwei-Photonen-Anregung untersucht. Als interessantes Modellsystem wurde das Sauerstofftransportprotein der Vogelspinne Eurypelma californicum gewählt. Zum einen besitzt das Protein 148 Tryptophan-Seitenketten, so daß deren geringer Absorptionsquerschnitt kompensiert werden kann und eventuell einzelne Proteine aufgrund ihrer Tryptophanfluoreszenz detektiert werden können. Zum anderen signalisiert diese Fluoreszenz die Sauerstoffbeladung, so daß die kooperative Sauerstoffbindung auf Einzelmolekülebene untersucht werden könnte. Als limitierender Faktor hat sich die Photostabilität der Tryptophane nach Zwei-Photonen-Anregung herausgestellt. Im Mittel können von einem Hämocyanin-Molekül drei Photonen detektiert werden, bevor alle 148 Tryptophan-Seitenketten geblichen sind. Dies ist ein für Einzelmolekülspektroskopie äußerst niedriger Wert. Trotz dieser geringen Photostabilität ist es zum erstem Mal gelungen, die Diffusion einzelner Proteine mit Hilfe ihrer intrinsischen Tryptophanfluoreszenz zu beobachten. Wenn in einer geeigneten Umgebung die Photostabilität der Tryptophane höher ist, so reicht die Zahl der detektierten Photonen aus, um einzelne Teilchen abzubilden. Überraschend hat sich ergeben, daß es möglich ist, durch Lichteinstrahlung von außen in das Sauerstoffbindungsgleichgewicht einzugreifen und die Reaktion des Proteins auf die Auslenkung aus dem Gleichgewichtszustand zu beobachten. Das intensitätsabhängige Sauerstoffbindungsverhalten wurde modelliert und an die Messungen angepaßt. Die lichtinduzierte Sauerstoffabgabe führt anscheinend nicht zu einem Konformationswechsel.

Durchdringungs- und Adsorptionsverhalten von Stern-Polymeren

Änderungen in der Architektur von Polymeren abweichend von einer linearen Kette, beeinflussen deren physikalisch-chemisches Verhalten. Eine mögliche Architektur der verzweigten Moleküle stellen sternförmige Polymere dar. An einem zentralen Molekül als Kern, beispielsweise einem Dendrimer, sind an dessen Endpunkte lineare Polymerketten kovalent gebunden. In dieser Arbeit wurden zwei Problemstellungen behandelt. Zunächst wurde das Verhalten von Sternpolymeren aus Polybutadien in einer Matrix aus linearem Polybutadien mittels Neutronenkleinwinkelstreuung untersucht. Die Molekulargewichte der linaren Ketten wurden so gewählt, daî eines ein kleineres und das zweite ein größeres Molekulargewicht hat, als der leichteste bzw. schwerste Arm der verwendeten Sternpolymere. Neben den Parametern Armanzahl und -gewicht wurde die Konzentrations- und Temperaturabhängig durchgeführt. Die aus diesen Messungen extrahierten Parameter wurden mit den theoretischen Vorhersagen bezüglich des Skalenverhaltens vonSternpolymeren in derartigen Mischungen verglichen. Weiterhin wurde ein Interaktionsparameter bestimmt und in einzelne Anteile verschiedener Arten der Wechselwirkungen zerlegt. Die zweite Fragestellung betraf das Adsorptionsverhalten von Sternpolymeren im Vergleich mit linearen Polymeren. Es wurde die Kinetik der Adsorption mittels Ellipsometrie, die Strukturbildung mit dem Rasterkraftmikroskop und Streuung unter streifendem Einfalluntersucht.

Analyse der Mechanismen zur Regulation der Zellzyklus-abhängigen Stabilität der MARCKS-mRNA

Die Expression des PKC-Hauptsubstrates MARCKS (myristoylated alanine-rich C kinase substrate) wird in Swiss 3T3-Fibroblasten in Abhängigkeit des Zellzyklus durch Variation der mRNA-Stabilität reguliert. In der vorliegenden Arbeit wurde die Beteiligung der 3' nichttranslatierten Region (3'UTR) der MARCKS-mRNA an der Stabilitätskontrolle analysiert. Durch Einsatz der RNase/EMSA-Technik konnten zwei cis-Elemente der MARCKS 3'UTR identifiziert und lokalisiert werden, die mit RNA-bindenden Swiss 3T3-Proteinen (trans-Faktoren) interagieren. Diese neu identifizierten cis-Elemente sind AU-reiche Elemente (ARE) der Klasse III, da sie sehr große Sequenzhomologie zu ARE dieser Klasse aufweisen und der MARCKS 3'UTR, wie für ARE typisch, Instabilität vermitteln.Durch UV-crosslinking wurden vier Proteine mit Molekülmassen von 55, 40, 36 und 30 kDa nachgewiesen, die spezifisch an das 52nt lange Haupt-ARE (MARCKS 52nt) mit unterschiedlicher Affinität binden konnten. Mit Hilfe von rekombinant hergestellten ELAV/Hu-Proteinen und einem ELAV/Hu-spezifischen, affinitätsgereinigten Antiserum konnte eines der vier Proteine (p36) als das ELAV/Hu-Protein HuR identifiziert werden. Die Funktion der ELAV/Hu-Proteine für die Stabilitätskontrolle der MARCKS-mRNA ließ sich durch transiente und stabile Transfektion von HuR und neuronenspezifischem HuD mit dem Tetracyclin induzierbaren Expressionssystem (Tetoff) in Swiss 3T3- bzw. MEF/3T3-Tetoff-Zellen verdeutlichen: Durch Überexpression von HuR und HuD wurde die wachstumsinduzierte Destabilisierung der MARCKS-mRNA bei Wiedereintritt der Zellen in den Zellzyklus unterbunden.

Bedeutung N- und C-terminaler Aminosäuren für die Monomer- und Dimerbildung von Lichtsammelproteinen des Photosystems I

Der LHCI-730 ist ein heterodimerer, Chlorophyll a/b-bindender Lichtsammelkomplex (LHC) des Photosystem I in höheren Pflanzen. Mit Hilfe rekombinanter, modifizierter Proteine wurde untersucht, welche terminalen Bereiche der Untereinheiten Lhca1 und Lhca4 für die Bildung von monomeren und dimeren Lichtsammelproteinen relevant sind. Durch PCR-Mutagenese modifizierte Apoproteine wurden in vitro mit Gesamtpigmentextrakt rekonstituiert und auf ihre Fähigkeit mono- bzw. dimere LHCs zu bilden untersucht.Für die Monomerbildung sind der extrinsische N-Terminus und die der amphipathischen vierten Helix folgenden Aminosäuren beider Proteine für die Faltung stabiler monomerer Pigmentproteinkomplexe nicht notwendig. Die Aminosäuren, mit deren Deletion die Monomerbildung an N- und C-Terminus verhindert wurde, verfügten über geladene (Glu, Asp), aromatische (Trp) oder neutrale Seitenketten (Leu).Die Untersuchungen zur Dimerbildung des LHCI-730 zeigten, daß am N-Terminus des Lhca1 nur bis zu einer Entfernung von drei Aminosäuren (Trp) eine Assemblierung der Untereinheiten möglich ist. Nur Phe (anstatt Trp) war in Substitutionsexperimenten im Vollängenprotein in der Lage, Dimere zu bilden. Das Ausbleiben der Dimerbildung der bis einschließlich zum Trp-39 und Ile-168 verkürzten Deletionsmutanten des Lhca4 ist vermutlich auf die Instabilität dieser Lhca4-Mutanten zurückzuführen. Die Deletion von Trp-185 am C-Terminus des Lhca1 führt zu einem Ausbleiben der Dimerbildung, die aber offensichtlich durch weitere, zuvor schon deletierte Aminosäuren beeinträchtigt wurde.

Zur Evolution des Cytoskeletts beim Sibirischen Stör Acipenser baeri

Im Rahmen meiner Arbeit wurden erstmals die Intermediärfilament-Proteine (IF-Proteine) des Sibirischen Störs Acipenser baeri (Strahlenflosser, Knorpelganoid) kloniert und sequenziert. Aus einer cDNA-Bank konnten die Sequenzen von 13 IF-Proteine gewonnen werden. Von insgesamt zehn Keratinen codieren sieben für Typ I-Keratine und drei für Typ II. Zusätzlich konnten noch Desmin, Vimentin und ein Lamin identifiziert werden. Je einem Typ I- (K13) und einem Typ-II-Keratin (K2) fehlen wenige Aminosäuren in der Head-Domäne.Cytoskelett-Präparationen aus Epidermis, Mitteldarm, Magen und Kieme wurden mittels 2D-PAGE aufgetrennt. Durch Einsatz des CKBB-Test und Immunoblots wurden die verschiedenen Typ I und II-Keratine sowie Desmin und Vimentin identifiziert. Die gewebsspezifische Expression der Keratine ermöglichte zumeist ihre Einteilung in 'E' (epidermal) und 'S' ('simple epithelial').Die MALDI-MS-Analyse einer 2D-PAGE-Koelektrophorese von Seitenflosse und Mitteldarm zeigte, daß die 34 vorhandenen Proteinflecke auf nur 13 verschiedene IF-Proteine zurückgehen. Neun dieser Flecke konnten Sequenzen zugewiesen werden. Zusammen mit den verbleibenden vier Proteinflecken ergeben sich für den Stör nunmehr insgesamt 17 bekannte IF-Proteine. Von drei biochemisch identifizierten IS-Keratinen kommt eines nur im Mitteldarm vor und nur einem konnte eine Sequenz zugeordnet werden (K18). Dem einzigen Typ IIS-Keratin konnte keine Sequenz zugeordnet werden, wahrscheinlich handelt es sich um dabei um das K8-Orthologe. Jedem der fünf Typ IE-Proteine konnte eine Sequenz zugeordnet werden (K10 bis K14), ebenso wie dem einzigen identifizierten Typ IIE-Keratin (K2). Von den Typ III-Proteinen wurden Desmin und Vimentin ihren Proteinflecken zugeordnet. Die nicht zugeordnete Sequenz aba-k1 codiert möglicherweise für ein IIE-Keratin, während aba-k15 vermutlich die Sequenz für ein IE-Keratin enthält. Bei den Proteinflecken, denen eine Sequenz zugeordnet werden konnten, kann für Aba-K2 die Zugehörigkeit zum IIE-Typ angenommen werden, während es sich bei Aba-K10 wahrscheinlich um ein IE-Keratin handelt.Durch Datenbankvergleiche und molekulare Stammbäume konnte die Zugehörigkeit der identifizierten Lamin-Sequenz zum B3-Subtyp der Vertebraten gezeigt werden.Die Daten der Biochemie und indirekten Immunfluoreszenzmikroskopie zeigen, daß Keratine in Epithelien und Vimentin in mesenchymalen Geweben vorkommen. Es existieren starke Hinweise, daß im letzten Gewebetyp Keratine auch koexprimiert werden. Desmin kommt in großen Mengen im Magen und im Mitteldarm vor und stellt dort das prominenteste Protein.Mit den gewonnenen Sequenzdaten wurden molekulare Stammbäume und Sequenzidentitäten berechnet. Die daraus resultierenden Konsequenzen für die Verwandtschaftsverhältnisse der verschiedenen IF-Proteine sowie der Wirbeltiere werden diskutiert.