The oxygen sensors FNR from Escherichia coli and NreABC from Staphylococcus carnosus

Im Laufe der Evolution entwickelte sich eine Reihe von Sauerstoff-Sensorsystemen in Bakterien, um die Genexpression der Sauerstoffverfügbarkeit anzupassen. Der Sauerstoffsensor FNR aus Escherichia coli bindet unter anaeroben Bedingungen ein [4Fe4S]2+ Zentrum. Unter Sauerstoffeinfluß zerfällt aktives [4Fe4S]2+FNR zu inaktivem [2Fe2S]2+FNR und weiter zu ebenfalls inaktivem apoFNR. In der vorliegenden Arbeit wurde der Zustand von FNR in vivo in aeroben und anaeroben Zellen von Escherichia coli aufgeklärt. Durch Alkylierung der Cysteine in FNR und anschließender Analyse im Massenspektrometer konnte gezeigt werden, das FNR in aeroben Zellen hauptsächlich in der apo-Form vorliegt. Nach ca. 6 Minuten war in lebenden E. coli Zellen die Umwandlung von [4Fe4S]2+ FNR zu apoFNR abgeschlossen.rnrnIn dem gram positiven Bakterium Staphylococcus carnosus aktiviert das NreBC System unter anaeroben Wachstumsbedingungen die Gene der Nitratatmung. NreB ist eine cytoplasmatische Sensorhistidinkinase, die ein sauerstofflabiles [4Fe4S]2+ Zentrum über eine PAS-Domäne bindet. Das [4Fe4S]2+ Zentrum wird von vier Cysteinen gebunden. Der Responsregulator NreC steuert nach Aktivierung durch NreB die Transkription der Zielgene. In der vorliegenden Arbeit wurde NreB mit Hilfe von Cysteinmarkierungen in vivo charakterisiert. Durch die Änderung der Cystein-Zugänglichkeit für Thiolreagenzien nach Sauerstoffzugabe konnte eine Halbwertszeit von ca. 3 Minuten für das [4Fe4S]2+ Zentrum in vivo bestimmt werden. In anaeroben Bakterien stellt [4Fe4S]2+NreB die Hauptform von NreB dar, während in aeroben Bakterien hauptsächlich apoNreB vorkommt. Dieses Ergebnis konnte durch Massenspektroskopie bestätigt werden. Weiterhin konnte gezeigt werden das NreA mit NreB und NreC wechselwirkt und Bestandteil des NreABC Drei-Komponentensystems ist. rn

Polymerisation in perfluorierter Emulsion

Die vorliegende Arbeit behandelt die Polymerisation in nicht-wässrigen Emulsionen – bestehend aus einem perfluorierten Solvens und einem Kohlenwasserstoff - unter Einsatz verschiedener Monomere, Katalysatoren und Polymeristionsmethoden zur Generierung von Polymerpartikeln verschiedenster Art. Es wurde gezeigt, dass in diesen inerten Medien zahlreiche Methoden zur Polymererzeugung unter gleichzeitiger Morphologiekontrolle eingesetzt werden können, die in konventionellen wässrigen, heterophasischen Systemen versagen.rnrnAusgangspunkt war die literaturbekannte Metallocen-katalysierte Synthese von Polyethylen (PE)- und Polypropylen (PP)-Nanopartikeln in perfluorierter Emulsion in Gegenwart hochmolekularer Blockcopolymere als Stabilisierungsagens. Mithilfe kinetischer Untersuchungen hinsichtlich der PE-Synthese wurde im Rahmen dieser Arbeit ein Modell entwickelt, welches den Diffusionsweg eines gasförmigen Monomers über die verschiedenen Phasengrenzen hinweg zum aktiven katalytischen Zentrum in der dispergierten Phase beschreibt. Ferner konnte die Diffusions- und Reaktionsbestimmtheit der Reaktion in Abhängigkeit verschiedener Reaktionsparameter nachgewiesen sowie ein tieferer Einblick über den Ort der Polymerisation in den heterophasischen Systemen erhalten werden.rnrnDie so gewonnenen Erkenntnisse wurden für die erfolgreiche Synthese von Poly(ethylen-1-hexen)-Copolymeren in perfluorierter Emulsion genutzt, wobei der Comonomergehalt im resultierenden Polymer über einen breiten Bereich variiert werden konnte. Neben der Homo- und Copolymerisation von Polyolefinen wurde in der vorliegenden Arbeit weiter gezeigt, dass die heterogenen Fluide zum Aufbau komplexerer Morphologien wie Kern-Schale-Nanopartikeln genutzt werden können; so gelangte man zu Partikeln mit Kernen aus isotaktischem PP, ummantelt von „weichem“ Poly(n-butylacrylat).rnrnEin weiterer Fokus dieser Arbeit lag auf der Erweiterung der Anwendungsmöglichkeiten der perfluorierten Emulsionen, und so wurde bspw. der Zugang zu Polymerdispersionen aus konjugierten Materialien mit Partikeldurchmessern von 70-100 nm mittels Cyclopolymerisation eröffnet. Ferner konnten als bioverträgliche und biologisch abbaubare Materialien Partikel aus epsilon-Caprolacton in koordinativ-anionischer Polymerisation gewonnen werden. Im Zuge dessen wurden Emulgatoren entwickelt, die den Einsatz polarer Monomere in perfluorierter Emulsion erlauben.rnrnSchlussendlich konnten mittels trifunktioneller Polymere mit lipophilen und fluorophilen Gruppen sowie Lewis-basischen Ankergruppen Ag- und Cu-Partikel dergestalt oberflächenmodifiziert werden, dass ein homogenes Einbetten in eine perfluorierte Matrix möglich war, was antibakterielle perfluorierte Werkstoffe - erwiesen an E. coli - lieferte.

The development and deployment of FOTOS: a fast observation of trace organics system

Flüchtige organische Bestandteile (engl.: VOC) sind in der Atmosphäre in Spuren vorhanden, spielen aber trotzdem eine wichtige Rolle in der Luftchemie: sie beeinflussen das Ozon der Troposphäre, städtischen Smog, Oxidationskapazität und haben direkte und indirekte Auswirkungen auf die globale Klimaveränderung. Eine wichtige Klasse der VOC sind die Nicht-Methan-Kohlenwasserstoffe (engl.: NMHC), die überwiegend von anthropogenen Quellen kommen. Aus diesem Grund ist für Luftchemiker ein Messinstrument nötig, das die VOC, die NMHC eingeschlossen, mit einer höheren Zeitauflösung misst, besonders für Echtzeitmessungen an Bord eines Forschungsflugzeuges. Dafür wurde das System zur schnellen Beobachtung von organischen Spuren (engl.: FOTOS) entworfen, gebaut für den Einsatz in einem neuen Wissenschaftlichen Flugzeug, das in großen Höhen und über weite Strecken fliegt, genannt HALO. In der Folge wurde FOTOS in zwei Messkampagnen am Boden getestet. FOTOS wurde entworfen und gebaut mit einem speziell angefertigten, automatisierten, kryogenen Probensystem mit drei Fallen und einem angepassten, erworbenen schnellen GC-MS. Ziel dieses Aufbaus war es, die Vielseitigkeit zu vergrößern und das Störungspotential zu verringern, deshalb wurden keine chemischen Trocknungsmittel oder adsorbierenden Stoffe verwendet. FOTOS erreichte eine Probenfrequenz von 5.5 Minuten, während es mindestens 13 verschiedene C2- bis C5-NMHC maß. Die Drei-Sigma-Detektionsgrenze für n- und iso-Pentan wurde als 2.6 und 2.0 pptv ermittelt, in dieser Reihenfolge. Labortests bestätigten, dass FOTOS ein vielseitiges, robustes, hochautomatisiertes, präzises, genaues, empfindliches Instrument ist, geeignet für Echtzeitmessungen von VOC in Probenfrequenzen, die angemessen sind für ein Forschungsflugzeug wie HALO. Um die Leistung von FOTOS zu bestätigen, wurde vom 26. Januar bis 4. Februar 2010 ein Zwischenvergleich gemacht mit dem GC-FID-System am Meteorologischen Observatorium Hohenpeißenberg, einer WMO-GAW-globalen Station. Dreizehn verschiedene NMHC wurden innerhalb des Rahmens der GWA Data Quality Objectives (DQO) analysiert und verglichen. Mehr als 80% der Messungen von sechs C3- bis C5-NMHC erfüllten diese DQO. Diese erste Messkampagne im Feld hob die Robustheit und Messgenauigkeit von FOTOS hervor, zusätzlich zu dem Vorteil der höheren Probenfrequenz, sogar in einer Messung am Boden. Um die Möglichkeiten dieses Instrumentes im Feld zu zeigen, maß FOTOS ausgewählte leichte NMHC während einer Messkampagne im Borealen Waldgebiet, HUMPPA-COPEC 2010. Vom 12. Juli bis zum 12. August 2010 beteiligte sich eine internationale Gruppe von Instituten und Instrumenten an Messungen physikalischer und chemischer Größen der Gas- und Partikelphasen der Luft über dem Borealen Wald an der SMEAR II-Station nahe Hyyttiälä, Finnland. Es wurden mehrere Hauptpunkte von Interesse im Mischungsverhältnis der Alkane und im Isomerenverhätnis von Pentan identifiziert, insbesondere sehr unterschiedliche Perioden niedriger und hoher Variabilität, drei Rauchschwaden von Biomassen-Verbrennung von russischen Waldbränden und zwei Tage mit extrem sauberer Luft aus der Polarregion. Vergleiche der NMHC mit anderen anthropogenen Indikatoren zeigten mehrere Quellen anthropogener Einflüsse am Ort auf und erlaubten eine Unterscheidung zwischen lokalen und weiter entfernten Quellen. Auf einen minimalen natürlichen Beitrag zum 24h-Kreislauf von NOx wurde geschlussfolgert aus der Korrelation von NOx mit Alkanen. Altersschätzungen der Luftmassen durch das Isomerenverhältnis von Pentan wurden erschwert durch sich verändernde Verhältnisse der Quellen und durch Besonderheiten der Photochemie während des Sommers im hohen Norden. Diese Messungen zeigten den Wert des Messens leichter NMHC, selbst in abgelegenen Regionen, als einen zusätzlichen spezifischen Marker von anthropogenem Einfluss.

Design of multifunctional magnetic nanomaterials for biomedical applications

Diese Arbeit ist ein Beitrag zu den schnell wachsenden Forschungsgebieten der Nano-Biotechnologie und Nanomedizin. Sie behandelt die spezifische Gestaltung magnetischer Nanomaterialien für verschiedene biomedizinische Anwendungsgebiete, wie beispielsweise Kontrastmittel für die magnetische Resonanztomographie (MRT) oder "theragnostische" Agenzien für simultane optische/MR Detektion und Behandlung mittels photodynamischer Therapie (PDT).rnEine Vielzahl magnetischer Nanopartikel (NP) mit unterschiedlichsten magnetischen Eigenschaften wurden im Rahmen dieser Arbeit synthetisiert und erschöpfend charakterisiert. Darüber hinaus wurde eine ganze Reihe von Oberflächenmodifizierungsstrategien entwickelt, um sowohl die kolloidale als auch die chemische Stabilität der Partikel zu verbessern, und dadurch den hohen Anforderungen der in vitro und in vivo Applikation gerecht zu werden. Diese Strategien beinhalteten nicht nur die Verwendung bi-funktionaler und multifunktioneller Polymerliganden, sondern auch die Kondensation geeigneter Silanverbindungen, um eine robuste, chemisch inerte und hydrophile Siliziumdioxid- (SiO2) Schale um die magnetischen NP auszubilden.rnGenauer gesagt, der Bildungsmechanismus und die magnetischen Eigenschaften monodisperser MnO NPs wurden ausgiebig untersucht. Aufgrund ihres einzigartigen magnetischen Verhaltens eignen sich diese NPs besonders als (positive) Kontrastmittel zur Verkürzung der longitudinalen Relaxationszeit T1, was zu einer Aufhellung im entsprechenden MRT-Bild führt. Tatsächlich wurde dieses kontrastverbessernde Potential in mehreren Studien mit unterschiedlichen Oberflächenliganden bestätigt. Au@MnO „Nanoblumen“, auf der anderen Seite, sind Vertreter einer weiteren Klasse von Nanomaterialien, die in den vergangenen Jahren erhebliches Interesse in der wissenschaftlichen Welt geweckt hat und oft „Nano-hetero-Materialien“ genannt wird. Solche Nano-hetero-partikel vereinen die individuellen physikalischen und chemischen Eigenschaften der jeweiligen Komponenten in einem nanopartikulärem System und erhöhen dadurch die Vielseitigkeit der möglichen Anwendungen. Sowohl die magnetischen Merkmale von MnO, als auch die optischen Eigenschaften von Au bieten die Möglichkeit, diese „Nanoblumen“ für die kombinierte MRT und optische Bildgebung zu verwenden. Darüber hinaus erlaubt das Vorliegen zweier chemisch unterschiedlicher Oberflächen die gleichzeitige selektive Anbindung von Katecholliganden (auf MnO) und Thiolliganden (auf Au). Außerdem wurde das therapeutische Potential von magnetischen NPs anhand von MnO NPs demonstriert, die mit dem Photosensibilisator Protoporhyrin IX (PP) funktionalisiert waren. Bei Bestrahlung mit sichtbarem Licht initiiert PP die Produktion von zytotoxisch-reaktivem Sauerstoff. Wir zeigen, dass Nierenkrebszellen, die mit PP-funktionalisierten MnO NPs inkubiert wurden nach Bestrahlung mit Laserlicht verenden, während sie ohne Bestrahlung unverändert bleiben. In einem ähnlichen Experiment untersuchten wir die Eigenschaften von SiO2 beschichteten MnO NPs. Dafür wurde eigens eine neuartige SiO2-Beschichtungsmethode entwickelt, die einer nachfolgende weitere Anbindung verschiedenster Liganden und die Einlagerung von Fluoreszenzfarbstoffen durch herkömmliche Silan- Sol-Gel Chemie erlaubt. Die Partikel zeigten eine ausgezeichnete Stabilität in einer ganzen Reihe wässriger Lösungen, darunter auch physiologische Kochsalzlösung, Pufferlösungen und humanes Blutserum, und waren weniger anfällig gegenüber Mn-Ionenauswaschung als einfache PEGylierte MnO NPs. Des Weiteren konnte bewiesen werden, dass die dünne SiO2 Schicht nur einen geringen Einfluss auf das magnetische Verhalten der NPs hatte, so dass sie weiterhin als T1-Kontrastmittel verwendet werden können. Schließlich konnten zusätzlich FePt@MnO NPs hergestellt werden, welche die individuellen magnetischen Merkmale eines ferromagnetischen (FePt) und eines antiferromagnetischen (MnO) Materials vereinen. Wir zeigen, dass wir die jeweiligen Partikelgrößen, und damit das resultierende magnetische Verhalten, durch Veränderung der experimentellen Parameter variieren können. Die magnetische Wechselwirkung zwischen beiden Materialien kann dabei auf Spinkommunikation an der Grenzfläche zwischen beiden NP-Sorten zurückgeführt werden.rn

Immunregulatorische Mechanismen bei einer experimentellen akuten Graft-versus-Host-Disease

Die allogene hämatopoetische Stammzelltransplantation ist bereits seit mehreren Jahrzehnten zur Therapie von Leukämien und anderen malignen Erkrankungen etabliert, aber ihre Effektivität wird durch Graft-versus-Host Reaktionen weiterhin deutlich eingeschränkt. Um die zu Grunde liegenden Mechanismen besser zu verstehen und Möglichkeiten zur Modulation zu untersuchen, wurden in dieser Arbeit verschiedene Ansätze verfolgt.rnRegulatorische T-Zellen sind in der Lage allogene T-Zell-Antworten, wie sie auch bei einer GvH-Erkrankung auftreten zu supprimieren. Es konnte gezeigt werden, dass dies unabhängig von Interleukin-10 geschieht, dafür jedoch ein kontaktabhängiger Mechanismus eine wichtige Rolle spielt. Dabei wird cAMP von Treg über Gap-Junctions in allogene Dendritische Zellen übertragen und deren Aktivierung dadurch verhindert. Versuche zur Modulation dieses Mechanismus mithilfe von Phosphodiesterase-Inhibitoren haben gezeigt, dass diese nicht nur die suppressiven Fähigkeiten von Treg verbessern, sondern ebenfalls direkt auf die T-Zellen einwirken, die schließlich die GvH-Erkrankung auslösen. Diese Ergebnisse konnten in vivo bestätigt werden und zeigen somit einen möglichen Ansatz hin zu einer kombinierten zellulären und pharmakologischen Therapie von GvH-Erkrankungen. Ein großer Vorteil dabei wäre, dass bereits eine Palette an PDE-Inhibitoren in der Klinik zur Verfügung steht.rnInterleukin-10 ist ein immunsuppressives und anti-inflammatorisches Zytokin, dem bei der Regulation des Immunsystems eine wichtige Rolle zukommt. Wie in dieser und anderen Arbeiten gezeigt, ist diese Funktion von IL-10 auch bei GvH-Erkrankungen essentiell. Ein Ziel war es daher, die Zellpopulationen, die für die Produktion des Zytokins verantwortlich sind, zu identifizieren. Mittels einer IL-10 Reporter-Maus konnten B-Zellen vom Spender, wie auch vom Empfänger als IL-10 Produzenten ausgemacht werden. Darüberhinaus zeigen die so gefundenen Zellen auch einen typischen Phänotyp für sog. immunregulatorische B-Zellen. Transplantationsexperimente mit Mäusen, die einen B-Zell-spezifischen Knock-out für IL-10 tragen, konnten die Relevanz der B Zellen als IL-10 Produzenten in vivo belegen.rnDendritische Zellen sind sehr potente Antigenpräsentierende Zellen und somit in der Lage GvH-Reaktionen zu induzieren. Überraschenderweise ist das Überleben von Versuchsmäusen, denen alle DC oder auch nur die BATF3-abhängige Subpopulation der CD8α+ DC fehlt, nicht besser als das des WT, sondern sogar deutlich schlechter. Dies geht einher mit entsprechenden Veränderungen im Zytokinmilieu der peripheren lymphatischen Organe. Bei Abwesenheit der CD8α+ DC sind die Zellen der mesenterialen Lymphknoten nach dem Konditionierungsprotokoll stärkere Stimulatoren für allogene T-Zell-Proliferation, was eine Erklärung für die stärkere GvH-Erkrankung ist. Eine Erklärung für diese Befunde liefert die verringerte Anzahl an Treg, die nach einer Transplantation in Abwesenheit der CD8α+ DC zu beobachten ist.rnDie aufgezeigten immunsupressiven Mechanismen stellen gute Ansatzpunkte dar, um GvH-Erkrankungen besser zu verstehen und damit die Effektivität der allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation zu verbessern.rn

Untersuchungen zur Wirkung des Ginkgo-biloba-Extraktes EGb 761 auf die Proteinaggregation in der Huntington-Krankheit

Der Ginkgo biloba-Extrakt EGb 761 besteht aus einer Reihe pharmakologisch wirksamer Substanzen, welche gut beschriebene Wirkungen auf verschiedene potentiell zytoprotektive Signalwege ausüben und u.a. antioxidative Wirksamkeit haben. Folglich wurde EGb 761 bisher als eine natürliche Behandlung bei neurodegenerativen Erkrankungen mit zellulärem oxidativen Stress angewendet, einschließlich der Alzheimer-Krankheit (AD). Aufgrund von vielen gemeinsamen Merkmalen zwischen der AD und der Huntington-Krankheit (HD) wurde vermutet, dass EGb 761 eventuell auch positive Wirksamkeit bei der HD aufweisen könnte. rnDie Neuropathologie der HD wird durch pathologische Verlängerung an Glutamin-Wiederholungen im Huntingtin-Protein (polyQ-Protein) verursacht, wodurch es zu Fehlfaltungen im Protein kommt und hierdurch der proteasomale Abbau aberranter Proteine erschwert wird. Somit sollten in der vorliegenden Arbeit die EGb 761-Wirkungen auf die Proteasom-Aktivität und die Proteinaggregation in zellulären Modellen der HD untersucht werden. rnWie die ersten Untersuchungen in nativen HEK293-Zellen ergaben, bewirkte die Behandlung der Zellen mit EGb 761 eine Steigerung der basalen Proteasom-Aktivität sowie des proteasomalen Proteinabbaus und erhöhte die Transkription proteasomaler Gene. Hieraus ergaben sich Untersuchungen in Zellen mit Expressionen pathologischer Varianten von polyQ-Proteinen als zelluläre Modelle der HD. Hierbei konnte festgestellt werden, dass die Expression aberranter polyQ-Proteine eine verminderte zelluläre Proteasom-Aktivität bewirkte. Interessanterweise verursachte EGb 761 eine Abmilderung der pathologisch-induzierten verminderten Proteasom-Aktivität, in dem die EGb 761-Behandlung der Zellen zu einer erhöhten Proteasom-Aktivität, einem verbesserten proteasomalen Proteinabbau, sowie zu einer erhöhten Transkription proteasomaler Gene führte. Da diese EGb 761-Effekte unabhängig von der Expression aberranter polyQ-Proteine waren, demonstrierten diese Ergebnisse eine allgemeine EGb 761-Wirkungen auf die Proteasom-Aktivität. Anhand dieser Ergebnisse sollten anschließend weitere Untersuchungen mit zellulären Modellen der HD die genau Wirkung von EGb 761 auf die Degradation von abnormal verlängerten polyQ-Proteinen sowie auf die Bildung von polyQ-Aggregaten klären. rnHier konnte gezeigt werden, dass die Expression aberranter polyQ-Proteinen zu einer Akkumulation von SDS-resistenten bzw. SDS-unlöslichen, aggregierten polyQ-Proteinen führte, sowie die Bildung von sichtbaren polyQ-Aggregaten in Zellen bewirkte. Hierbei verursachte eine EGb 761-Behandlung der Zellen eine signifikante Verminderung im Gehalt an SDS-resistenten polyQ-Proteinen sowie eine Reduzierung von Aggregat-tragenden Zellen. Zudem konnte gezeigt werden, dass eine pharmakologische Inhibition des Proteasoms in EGb 761-behandelten Zellen, den Gehalt an SDS-unlöslichen polyQ-Proteinaggregate wieder erhöhte und somit den Effekt von EGb 761 aufhob. Folglich zeigten diese Ergebnisse, dass die EGb 761-induzierte Reduzierung der polyQ-Proteinaggregate durch einen effizienteren proteasomalen Abbau von fehlgefalteten, aberranten polyQ-Proteinen bewirkte wurde. rnAufbauend auf diesen Ergebnissen wurde eine experimentell-therapeutische Anwendung von EGb 761 in Modellen der HD in vitro und in vivo überprüft und hierzu primäre humane Fibroblasten sowie transgene C. elegans Würmer mit Expressionen aberranter polyQ-Proteine untersucht. Interessanterweise konnte in vitro und in vivo gezeigt werden, dass die EGb 761-Behandlung auch hier eine Reduzierung von SDS-unlöslichen polyQ-Proteinen bewirkte und zudem eine Reduzierung des pathologisch erhöhten Gehalts an Polyubiquitin-Proteinen bewirkte. Folglich wurde auch hier vermutet, dass EGb 761 einen verbesserten proteasomalen Abbau von polyQ-Proteinen induzierte und dies eine Verminderung der polyQ-Proteinaggregate verursachte. Darüber hinaus führte die EGb 761-Behandlung von seneszenten Fibroblasten zur Reduzierung von altersabhängig erhöhten Mengen von polyQ-Aggregaten, wodurch ein therapeutischer Effekt auf den proteasomalen Abbau der polyQ-Proteine verdeutlicht wurde. Zusätzlich konnte in polyQ-transgenen C. elegans demonstriert werden, dass eine EGb 761-Behandlung die Abmilderung eines typischen pathologischen Phänotyps bewirkte, indem eine polyQ-induzierte verminderte Motilität der Nematoden verbessert wurde und hierdurch eine positive EGb 761-Wirkung auf die Pathologie der HD in vivo dargestellt wurde. rnZusammenfassend konnten in dieser Arbeit neue Wirkungen von EGb 761 in der HD demonstriert werden. Hierbei wurde gezeigt, dass EGb 761 die Aggregation von pathogenen aberranten polyQ-Proteinen in vitro und in vivo reduziert, indem eine effizientere Degradation von polyQ-Proteinen erfolgt. Somit könnte diese Wirkungen von EGb 761 eine potentiell therapeutische Anwendung in der HD und ähnliche neurodegenerativen Erkrankungen darstellen.

Einfluss membranmimetischer Umgebungen auf die Dimerisierung von Glykophorin A

Bei der Untersuchung von Membranproteinen bedarf es der Entwicklung von neuen Methoden, da Standardmethoden, entwickelt für lösliche Proteine, meist nicht auf Membranproteine angewendet werden können. Das größte Problem besteht in der schlechten Wasserlöslichkeit der Membranproteine, da diese sich in vivo in einer hydrophoben Umgebung, der Membran, befinden. Um dennoch isolierte Membranproteine und ihre Faltung in vitro charakterisieren zu können, sind membranmimetische Systeme notwendig um Membranproteine in Lösung zu bringen. In dieser Arbeit wurden Lysophosphocholin Detergenzien, die Copolymere Amphipol A8-35, p(HMPA)-co-p(LMA) sowie synthetische Membranen aus Phospholipiden auf Ihre Eigenschaften in wässriger Lösung untersucht, und deren Auswirkungen auf die Solubilisierung und Dimerisierung der Glykophorin A (GpA)-Transmembranhelix analysiert. Es wurde erstmals gezeigt, dass die Aggregtionszahl von Detergenzmizellen die Dimerisierung von GpA beeinflusst. Die Copolymere A8-35 und pHPMA-pLMA sind in der Lage die Sekundärstruktur von GpA sowie dessen Dimer zu stabilisieren. Allerdings ist dies bei pHPMA-pLMA Copolymeren erst ab einem LMA-Anteil von über 15% möglich. In synthetischen Membranen zeigte die Dimerisierung von GpA eine Abhängigkeit von negativ geladenen Lipiden, die die Dimerisierung zwar vermindern aber die Ausbildung der Transmembranhelix fördern. Eine Zugabe von physiologischen Konzentrationen an Calciumionen ändert die Membraneigenschaften drastisch aber die Dimerisierung von GpA wird nur geringfügig beeinflusst.

The dynamics of ultra-thin polymer films in different confinements studied by resonance enhanced dynamic light scattering

Die Kontroverse über den Glasübergang im Nanometerbereich, z. B. die Glas¬über¬gangs-temperatur Tg von dünnen Polymerfilmen, ist nicht vollständig abgeschlossen. Das dynamische Verhalten auf der Nanoskala ist stark von den einschränkenden Bedingungen abhängig, die auf die Probe wirken. Dünne Polymerfilme sind ideale Systeme um die Dynamik von Polymerketten unter der Einwirkung von Randbedingungen zu untersuchen, wie ich sie in dieser Arbeit variiert habe, um Einblick in dieses Problem zu erhalten.rnrnResonanzverstärkte dynamische Lichtstreuung ist eine Methode, frei von z.B. Fluoreszenzmarkern, die genutzt werden kann um in dünnen Polymerfilmen dynamische Phänomene

Evolutionäre Veränderungen in der Nutzung redox-aktiver Aminosäuren und ihre Ursachen

Gewebe, Zellen und speziell Zellkompartimente unterscheiden sich in ihrer Sauerstoffkonzentration, Stoffwechselrate und in der Konzentration an gebildeten reaktiven Sauerstoffspezies. Um eine mögliche Änderung in der Aminosäurennutzung durch den Einfluss von Sauerstoff und seinen reaktiven Spezies untersuchen zu können wurden, Bereiche bzw. Kompartimente der menschlichen Zelle definiert, die einen Referenzrahmen bildeten und bekannt dafür sind, einen relativ hohen Grad an reaktiven Sauerstoffspezies aufzuweisen. Aus dem Vergleich wurde deutlich, dass vor allem die beiden redox-aktiven und schwefeltragenden Aminosäuren Cystein und Methionin durch eine besondere Verteilung und Nutzung charakterisiert sind. Cystein ist hierbei diejenige Aminosäure mit den deutlichsten Änderungen in den fünf untersuchten Modellen der oxidativen Belastung. In all diesen Modellen war die Nutzung von Cystein deutlich reduziert, wohingegen Methionin in Proteinen des Mitochondriums und der Elektronentransportkette angereichert war. Dieser auf den ersten Blick paradoxe Unterschied zwischen Cystein und Methionin wurde näher untersucht, indem die differenzierte Methioninnutzung in verschiedenen Zellkompartimenten von Homo sapiens charakterisiert wurde.rnDie sehr leicht zu oxidierende Aminosäure Methionin zeigt ein ungewöhnliches Verteilungsmuster in ihrer Nutzungshäufigkeit. Entgegen mancher Erwartung wird Methionin in zellulären Bereichen hoher oxidativer Belastung und starker Radikalproduktion intensiv verwendet. Dieses Verteilungsmuster findet man sowohl im intrazellulären Vergleich, als auch im Vergleich verschiedener Spezies untereinander, was daraufhin deutet, dass es einen lokalen Bedarf an redox-aktiven Aminosäuren gibt, der einen sehr starken Effekt auf die Nutzungshäufigkeit von Methionin ausübt. Eine hohe Stoffwechselrate, die im Allgemeinen mit einer erhöhten Produktion von Oxidantien assoziiert wird, scheint ein maßgeblicher Faktor der Akkumulation von Methionin in Proteinen der Atmungskette zu sein. Die Notwendigkeit, oxidiertes Antioxidans wieder zu reduzieren, findet auch bei Methionin Anwendung, denn zu Methioninsulfoxid oxidiertes Methionin wird durch die Methioninsulfoxidreduktase wieder zu Methionin reduziert. Daher kann die spezifische Akkumulation von Methionin in Proteinen, die verstärkt reaktiven Sauerstoffspezies ausgesetzt sind, als eine systematische Strategie angesehen werden, um andere labile Strukturen vor ungewollter Oxidation zu schützen. rnDa Cystein in allen untersuchten Modellen der oxidativen Belastung und im Besonderen in Membranproteinen der inneren Mitochondrienmembran lebensspannenabhängig depletiert war, wurde dieses Merkmal näher untersucht. Deshalb wurde die Hypothese getestet, ob ein besonderer Redox-Mechanismus der Thiolfunktion für diese selektive Depletion einer im Allgemeinen als harmlos oder antioxidativ geltenden Aminosäure verantwortlich ist. Um den Effekt von Cysteinresten in Membranen nachzustellen, wurden primäre humane Lungenfibroblasten (IMR90) mit diversen Modellsubstanzen behandelt. Geringe Konzentrationen der lipophilen Substanz Dodecanthiol verursachten eine signifikante Toxizität in IMR90-Zellen, die von einer schnellen Zunahme an polyubiquitinierten Proteinen und anderen Indikatoren des proteotoxischen Stresses, wie Sequestosom 1 (P62), HSP70 und HSP90 begleitet wurde. Dieser Effekt konnte spezifisch der Chemie der Thiolfunktion in Membranen zugeordnet werden, da Dodecanol (DOH), Dodecylmethylsulfid (DMS), Butanthiol oder wasserlösliche Thiole weder eine cytotoxische Wirkung noch eine Polyubiquitinierung von Proteinen verursachten. Die Ergebnisse stimmen mit der Hypothese überein, dass Thiole innerhalb von biologischen Membranen als radikalische Kettentransferagentien wirken. Diese Eigenschaft wird in der Polymerchemie durch Nutzung von lipophilen Thiolen in hydrophoben Milieus technisch für die Produktion von Polymeren benutzt. Da die Thiylradikal-spezifische Reaktion von cis-Fettsäuren zu trans-Fettsäuren in 12SH behandelten Zellen verstärkt ablief, kann gefolgert werden, dass 12SH zellulär radikalisiert wurde. In lebenden Organismen kann demnach die Oxidation von Cystein die Schädigung von Membranen beschleunigen und damit Einfallstore für die laterale Radikalisierung von integralen Membranproteinen schaffen, welche möglicherweise der Langlebigkeit abträglich ist, zumindest, wenn sie in der inneren Mitochondrienmembran auftritt.