Neue Untersuchungen zum Verordnungsmonitoring sowie zur Kompatibilität und Stabilität applikationsfertiger Zytostatika-Zubereitungen

Applikationsfertige Zytostatikazubereitungen werden heute unter der Verantwortung eines Apothekers in zentralisierten Herstellungsbereichen hergestellt. Weil die Verordnung der Chemotherapie ein großes Fehlerrisiko birgt, ist konsequentes Verordnungsmonitoring ein wesentlicher Teilprozess der zentralen Zytostatikazubereitung. rnDie aktuelle Umsetzung und die Ergebnisse des Verordnungsmonitorings in den Universitätskliniken Deutschlands wurden im Rahmen dieser Arbeit in einer prospektiven Erhebung erfasst. Als häufigste Verordnungsirrtümer wurden Dosisberechnungsfehler (48%), welche als von hoher Relevanz (78%) für die Patientensicherheit angesehen wurden, genannt. Die Inzidenz der Verordnungsfehler betrug durchschnittlich 0,77% bei rund 1950 Verordnungen pro Tag. Das konsequente Verordnungsmonitoring von pharmazeutischer Seite erfolgt höchst effizient und leistet einen hohen Beitrag zur Patienten- und Arzneimitteltherapiesicherheit in der Onkologie.rnFür die Herstellung der applikationsfertiger Zytostatika-Zubereitungen sind fundierte Kenntnisse zu deren physikalisch-chemischen Stabilität erforderlich. Zu neu zugelassenen Zytostatika und insbesondere Biologicals, stehen häufig noch keine Daten zur Stabilität der applikationsfertigen Lösungen zur Verfügung. Die Bestimmung der physikalisch-chemischen Stabilität war daher Gegenstand dieser Arbeit. Die applikationsfertigen Infusionslösungen der Purin-Analoga Nelarabin und Clofarabin (RP-HPLC), sowie des monoklonalen Antiköpers Trastuzumab (SEC, UV-Spektroskopie, SDS-Page), erwiesen sich über einen Zeitraum von mindestens 28 Tagen als stabil. Die Stabilität zweier Camptothecin-Derivate (Topotecan und Irinotecan) beladen auf DC Beads™, wie auch die Ladungskapazität und Kompatibilität mit Kontrastmitteln, wurde ebenfalls bewiesen. rn

Untersuchungen über ADAMTS13 in Gerinnungsfaktorpräparaten

Zusammenfassung rnIn der vorliegenden Arbeit wurden sechs VWF/FVIII Gerinnungsfaktorkonzentrate unterschiedlicher Chargen auf ihre ADAMTS13 Aktivität, Antigen und VWF Multimere untersucht. Grund dafür ist die Annahme, dass bei der Aufkonzentrierung des VWFs möglicherweise auch erhöhte Mengen an ADAMTS13 vorhanden sind. Wäre dies nachweisbar, könnten die entsprechenden Konzentrate auch Anwendung bei TTP Patienten finden. Neben den Gerinnungsfaktorkonzentraten wurden ebenfalls die zur Plasmapherese verwendeten Therapeutika FFP und s/d Plasma analysiert. Es soll getestet werden, ob Unterschiede hinsichtlich der Qualität zwischen den Präparaten bestehen und inwiefern die Blutgruppen eine Auswirkung auf die ADAMTS13 Aktivität/Antigen haben. Überdies wurde die Bedeutung von ADAMTS13 als wichtiges diagnostisches Merkmal im Rahmen der Gegenüberstellung von Patienten mit thrombotischen Mikroangiopathien erörtert. Alle angewandten Methoden wurden zudem kritisch miteinander verglichen und auf ihre Eignung für die klinische Diagnostik getestet. Zur Untersuchung der ADAMTS13 Aktivität kamen drei unterschiedliche Methoden zur Anwendung, die BCS-Methode nach Böhm und zwei FRET Kits (Technozym®ADAMTS13/ActifluorTMADAMTS13). Für die Bestimmung des ADAMTS13 Antigen wurde das Technozym®ADAMTS13 Kit verwendete als auch der Imubind®ELISA angewendet. Mittels der SDS-Gelelektrophorese konnten die VWF Multimere dargestellt werden. Die Untersuchungen konnten zeigen, dass nur in Haemate®P, deutlich höhere ADAMTS13 Aktivitäten (12,3% bzw. 470ng/ml) sowie ein physiologische Antigenwerte vorlagen. Die anderen Faktorkonzentrate wiesen entweder nur sehr geringe bzw. keine Aktivitäten auf. Das Antigen lag bei allen Konzentraten im nachweisbaren Bereich. Folglich ist ein Einsatz von Haemate®P bei der Therapie der TTP, insbesondere bei hereditären Formen sowie bei Kindern, die durch eine Plasmapherese stark belastet werden, und bei Schwangeren, könnten, in Erwägung zu ziehen und innerhalb der Klinik zu testen. Die Plasmapräparate FFP und Octaplas® wiesen in allen Untersuchungen ADAMTS13 Aktivitäten und Antigen im mittleren bis hohen physiologischen Bereich auf. Insbesondere bei Blutgruppe 0 ließ sich beiden Präparaten eine höhere ADAMTS13 Aktivität und Antigen gegenüber den drei anderen Blutgruppen darstellen. Insgesamt waren die interindividuellen Schwankungen bei FFP deutlich höher als bei Octaplas®, was sich in der unterschiedlichen Herstellung der Präparate begründen lässt. Octaplas® ist also genauso geeignet zur Plasmapherese bei der TTP wie FFP, kann jedoch aufgrund seiner intensiveren Virusinaktivierung eine größere Sicherheit aufweisen und stellt sich auch in der Klinik als nebenwirkungsärmer dar. Bei der Gegenüberstellung der thrombotischen Mikroangiopathien konnte gezeigt werden, dass eine verminderte ADAMTS13 Aktivität ein wichtiges Unterscheidungsmerkmal ist und auch während der Remission schon diagnostizierbar werden kann. Auf der Grundlage der labordiagnostischen Werte und dem klinischen Erscheinungsbild im akuten Schub und in der Remission konnte ein diagnostischer Algorithmus für den klinischen Alltag erstellt werden. In der Methodenvalidierung erwies sich der ActifluorTMADAMTS13 Kit als der beste Kit, da er innerhalb kürzester Zeit zuverlässige Werte in Standardeinheiten liefert. Nach neuesten Erkenntnissen, bei der eine Unterscheidung von ADAMTS13 Aktivitäten über und unter 5 % von großer prognostischer Bedeutung sind, ist die BCS-Methode nach Böhm mit einer unteren Nachweisgrenze von 6,2% zu ungenau und auch hinsichtlich ihres Zeitaufwandes eher ungünstig.rn

Synthese und Charakterisierung von Polymethylmethacrylat (PMMA)-Silika-Komposit-Partikeln und fluorierten Nanopartikeln unter Verwendung des Miniemulsionsprozesses

In der vorliegenden Dissertation wurden zwei verschiedene Fragestellungen bearbeitet. Zum einen wurde im Rahmen des Schwerpunktprojektes „Kolloidverfahrenstechnik“ und in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Heike Schuchmann vom KIT in Karlsruhe die Verkapselung von Silika-Nanopartikeln in eine PMMA-Hülle durch Miniemulsionspolymerisation entwickelt und der Aufskalierungsprozess unter Verwendung von Hochdruckhomogenisatoren vorangetrieben. Zum anderen wurden verschiedene fluorierte Nanopartikel durch den Miniemulsionsprozess generiert und ihr Verhalten in Zellen untersucht.rnSilika-Partikel konnten durch Miniemulsionspolymerisation in zwei unterschiedlichen Prozessen erfolgreich verkapselt werden. Bei der ersten Methode wurden zunächst modifizierte Silika-Partikel in einer MMA-Monomerphase dispergiert und anschließend durch den normalen Miniemulsionsprozess Silika-beladene Tröpfchen generiert. Diese konnten zu Komposit-Partikeln polymerisiert werden. Bei der Verkapselung durch den Fission/Fusion Prozess wurden die hydrophobisierten Silika-Partikel durch Fission und Fusion Prozesse in schon vorhandene Monomertröpfchen eingebracht, welche hinterher polymerisiert wurden. Um hydrophiles Silika in einem hydrophoben Monomer zu dispergieren, musste zunächst eine Modifizierung der Silika-Partikel stattfinden. Dies geschah unter anderem über eine chemische Anbindung von 3-Methacryloxypropyltri-methoxysilan an der Oberfläche der Silika-Partikel. Des Weiteren wurden die hydrophilen Silika-Partikel durch Adsorption von CTMA-Cl physikalisch modifiziert. Unter anderem durch die Variation des Verkapselungsprozesses, der Silika-Menge, der Tensidart und –menge und der Comonomere konnten Komposit-Partikel mit unterschiedlichen Morphologien, Größen, und Füllgraden erhalten werden.rnFluorierte Nanopartikel wurden erfolgreich über den Prozess der Miniemulsionspolymerisation synthetisiert. Als Monomere dienten dabei fluorierte Acrylate, fluorierte Methacrylate und fluoriertes Styrol. Es war möglich aus jeder dieser drei Gruppen an Monomeren fluorierte Nanopartikel herzustellen. Für genauere Untersuchungen wurden 2,3,4,5,6-Pentafluorstyrol, 3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,9,9,10,10,10-Heptadecafluorodecyl-methacrylat und 1H,1H,2H,2H-Perfluorodecylacrylat als Monomere ausgewählt. Als Hydrophob zur Unterdrückung der Ostwaldreifung wurde Perfluromethyldecalin eingesetzt. Die stabilsten Miniemulsionen wurden wiederum mit den ionischen Tensid SDS generiert. Mit steigendem Gehalt an SDS gelöst in der kontinuierlichen Phase, wurde eine Verkleinerung der Partikelgröße festgestellt. Neben den Homopolymerpartikeln wurden auch Copolymerpartikel mit Acrylsäure erfolgreich synthetisiert. Zudem wurde noch das Verhalten der fluorierten Partikel in Zellen überprüft. Die fluorierten Partikel wiesen ein nicht toxisches Verhalten vor. Die Adsorption von Proteinen aus Humanem Serum wurde über ITC Messungen untersucht. rnSomit konnte gezeigt werden, dass die Technik der Miniemulsionspolymerisation eine abwechslungsreiche und effektive Methode ist, um Hybridnanopartikel mit verschiedenen Morphologien und oberflächenfunktionalisierte Nanopartikel erfolgreich zu generieren.rn

Photo-induced reversible assembly of colloidal polymer nanoparticles

Polymer nanoparticles functionalized on the surface with photo-responsive labels were synthesized. In a first synthetic step, polystyrene was copolymerized with the cross-linker divinylbenzene and poly(ethylene glycol) acrylate in a miniemulsion, to produce nano-sized spheres (~ 60 nm radius) with terminal hydroxyl groups, which were functionalized in a subsequent synthetic step with photo-responsive labels. For this purpose, two photo-active molecular structures were separately used: anthracene, which is well known to form covalently bonded dimers upon photo-excitation; and pyrene, which only forms short lived excited state dimers (excimers). Acid derivatives of these labels (9-anthracene carboxylic acid and 1-pyrene butyric acid) were bonded to the hydroxyl terminal groups of the nanoparticles through an esterification reaction, via the intermediate formation of the corresponding acid chloride.rnThe obtained labeled nanoparticles appeared to be highly hydrophobic structures. They formed lyophobic suspensions in water, which after analysis by dynamic light scattering (DLS) and ultramicroscopic particle tracking, appeared to equilibrate as a collection of singly dispersed nanoparticles, together with a few nanoparticle aggregates. The relative amount of aggregates decreased with increasing amounts of the surfactant sodium dodecyl sulfate (SDS), thus confirming that aggregation is an equilibrated state resulting from lyophobicity. The formation of such aggregates was corroborated using scanning electron microscopy (SEM). The photo-irradiation of the lyophobic aqueous suspensions of anthracene labeled nanoparticles (An-NP) resulted in the formation of higher aggregates, as evidenced by DLS and ultramicroscopy. The obtained state of aggregation could be reverted by sonication. The possibility to re-aggregate the system in subsequent photo-excitation and sonication cycles was established. Likewise, the photo-irradiation of lyophobic aqueous suspensions of pyrene-labeled nanoparticles (Py-NP) resulted in the formation of higher aggregates, as evidenced by DLS and ultramicroscopy. These appeared to remain aggregated due to hydrophobic interactions. This system could also be re-dispersed by sonication and re-aggregated in subsequent cycles of photo-excitation and sonication.

Cellular localization and mechanism of amyloid precursor protein (APP) homodimer formation in an oxidizing environment

The amyloid precursor protein (APP) is a type I transmembrane glycoprotein, which resembles a cell surface receptor, comprising a large ectodomain, a single spanning transmembrane part and a short C-terminal, cytoplasmic domain. It belongs to a conserved gene family, with over 17 members, including also the two mammalian APP homologues proteins APLP1 and APLP2 („amyloid precursor like proteins“). APP is encoded by 19 exons, of which exons 7, 8, and 15 can be alternatively spliced to produce three major protein isoforms APP770, APP751 and APP695, reflecting the number of amino acids. The neuronal APP695 is the only isoform that lacks a Kunitz Protease Inhibitor (KPI) domain in its extracellular portion whereas the two larger, peripheral APP isoforms, contain the 57-amino-acid KPI insert. rnRecently, research effort has suggested that APP metabolism and function is thought to be influenced by homodimerization and that the oligomerization state of APP could also play a role in the pathology of Alzheimer's disease (AD), by regulating its processing and amyloid beta production. Several independent studies have shown that APP can form homodimers within the cell, driven by motifs present in the extracellular domain, as well as in the juxtamembrane (JM) and transmembrane (TM) regions of the molecule, whereby the exact molecular mechanism and the origin of dimer formation remains elusive. Therefore, we focused in our study on the actual subcellular origin of APP homodimerization within the cell, an underlying mechanism, and a possible impact on dimerization properties of its homologue APLP1. Furthermore, we analyzed homodimerization of various APP isoforms, in particular APP695, APP751 and APP770, which differ in the presence of a Kunitz-type protease inhibitor domain (KPI) in the extracellular region. In order to assess the cellular origin of dimerization under different cellular conditions, we established a mammalian cell culture model-system in CHO-K1 (chinese hamster ovary) cells, stably overexpressing human APP, harboring dilysine based organelle sorting motifs at the very C-terminus [KKAA-Endoplasmic Reticulum (ER); KKFF-Golgi]. In this study we show that APP exists as disulfide-bound, SDS-stable dimers, when it was retained in the ER, unlike when it progressed further to the cis-Golgi, due to the KKFF ER exit determinant. These stable APP complexes were isolated from cells, and analyzed by SDS–polyacrylamide gel electrophoresis under non-reducing conditions, whereas strong denaturing and reducing conditions completely converted those dimers to monomers. Our findings suggested that APP homodimer formation starts early in the secretory pathway and that the unique oxidizing environment of the ER likely promotes intermolecular disulfide bond formation between APP molecules. We particularly visualized APP dimerization employing a variety of biochemical experiments and investigated the origin of its generation by using a Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) approach with split GFP-APP chimeras. Moreover, using N-terminal deletion constructs, we demonstrate that intermolecular disulfide linkage between cysteine residues, exclusively located in the extracellular E1 domain, represents another mechanism of how an APP sub-fraction can dimerize within the cell. Additionally, mutational studies revealed that cysteines at positions 98 and 105, embedded in the conserved loop region within the E1 domain, are critical for interchain disulfide bond formation. Using a pharmacological treatment approach, we show that once generated in the oxidative environment of the ER, APP dimers remain stably associated during transport, reaching the plasma membrane. In addition, we demonstrate that APP isoforms, encompassing the KPI domain, exhibit a strongly reduced ability to form cis-directed dimers in the ER, whereas trans-directed cell aggregation of Drosophila Schneider (S2)-cells was isoform independent, mediating cell-cell contacts. Thus, suggesting that steric properties of KPI-APP might be the cause for weaker cis-interaction in the ER, compared to APP695. Finally, we provide evidence that APP/APLP1 heterointeractions are likewise initiated in the ER, suggesting a similar mechanism for heterodimerization. Therefore, dynamic alterations of APP between monomeric, homodimeric, and possibly heterodimeric status could at least partially explain some of the variety in the physiological functions of APP.rn

Miniemulsionen als räumliche Begrenzungen : Synthese von Polymer-Hydroxylapatit-Nanopartikeln, bio-inspirierten Nanokapseln und Polymer-Einzelkettenpartikeln

In der vorliegenden Arbeit wurden Miniemulsionen als räumliche Begrenzungen für die Synthese von unterschiedlichen funktionellen Materialien mit neuartigen Eigenschaften verwendet. Das erste Themengebiet umfasst die Herstellung von Polymer/Calciumphosphat-Hybridpartikeln und –Hybridkapseln über die templatgesteuerte Mineralisation von Calciumphosphat. Die funktionalisierte Oberfläche von Polymernanopartikeln, welche über die Miniemulsionspolymerisation hergestellt wurden, diente als Templat für die Kristallisation von Calciumphosphat auf den Partikeln. Der Einfluss der funktionellen Carboxylat- und Phosphonat-Oberflächengruppen auf die Komplexierung von Calcium-Ionen sowie die Mineralisation von Calciumphosphat auf der Oberfläche der Nanopartikel wurde mit mehreren Methoden (ionenselektive Elektroden, REM, TEM und XRD) detailliert analysiert. Es wurde herausgefunden, dass die Mineralisation bei verschiedenen pH-Werten zu vollkommen unterschiedlichen Kristallmorphologien (nadel- und plättchenförmige Kristalle) auf der Oberfläche der Partikel führt. Untersuchungen der Mineralisationskinetik zeigten, dass die Morphologie der Hydroxylapatit-Kristalle auf der Partikeloberfläche mit der Änderung der Kristallisationsgeschwindigkeit durch eine sorgfältige Wahl des pH-Wertes gezielt kontrolliert werden kann. Sowohl die Eigenschaften der als Templat verwendeten Polymernanopartikel (z. B. Größe, Form und Funktionalisierung), als auch die Oberflächentopografie der entstandenen Polymer/Calciumphosphat-Hybridpartikel wurden gezielt verändert, um die Eigenschaften der erhaltenen Kompositmaterialien zu steuern. rnEine ähnliche bio-inspirierte Methode wurde zur in situ-Herstellung von organisch/anorganischen Nanokapseln entwickelt. Hierbei wurde die flexible Grenzfläche von flüssigen Miniemulsionströpfchen zur Mineralisation von Calciumphosphat an der Grenzfläche eingesetzt, um Gelatine/Calciumphosphat-Hybridkapseln mit flüssigem Kern herzustellen. Der flüssige Kern der Nanokapseln ermöglicht dabei die Verkapselung unterschiedlicher hydrophiler Substanzen, was in dieser Arbeit durch die erfolgreiche Verkapselung sehr kleiner Hydroxylapatit-Kristalle sowie eines Fluoreszenzfarbstoffes (Rhodamin 6G) demonstriert wurde. Aufgrund der intrinsischen Eigenschaften der Gelatine/Calciumphosphat-Kapseln konnten abhängig vom pH-Wert der Umgebung unterschiedliche Mengen des verkapselten Fluoreszenzfarbstoffes aus den Kapseln freigesetzt werden. Eine mögliche Anwendung der Polymer/Calciumphosphat-Partikel und –Kapseln ist die Implantatbeschichtung, wobei diese als Bindeglied zwischen künstlichem Implantat und natürlichem Knochengewebe dienen. rnIm zweiten Themengebiet dieser Arbeit wurde die Grenzfläche von Nanometer-großen Miniemulsionströpfchen eingesetzt, um einzelne in der dispersen Phase gelöste Polymerketten zu separieren. Nach der Verdampfung des in den Tröpfchen vorhandenen Lösungsmittels wurden stabile Dispersionen sehr kleiner Polymer-Nanopartikel (<10 nm Durchmesser) erhalten, die aus nur wenigen oder einer einzigen Polymerkette bestehen. Die kolloidale Stabilität der Partikel nach der Synthese, gewährleistet durch die Anwesenheit von SDS in der wässrigen Phase der Dispersionen, ist vorteilhaft für die anschließende Charakterisierung der Polymer-Nanopartikel. Die Partikelgröße der Nanopartikel wurde mittels DLS und TEM bestimmt und mit Hilfe der Dichte und des Molekulargewichts der verwendeten Polymere die Anzahl an Polymerketten pro Partikel bestimmt. Wie es für Partikel, die aus nur einer Polymerkette bestehen, erwartet wird, stieg die mittels DLS bestimmte Partikelgröße mit steigendem Molekulargewicht des in der Synthese der Partikel eingesetzten Polymers deutlich an. Die Quantifizierung der Kettenzahl pro Partikel mit Hilfe von Fluoreszenzanisotropie-Messungen ergab, dass Polymer-Einzelkettenpartikel hoher Einheitlichkeit hergestellt wurden. Durch die Verwendung eines Hochdruckhomogenisators zur Herstellung der Einzelkettendispersionen war es möglich, größere Mengen der Einzelkettenpartikel herzustellen, deren Materialeigenschaften zurzeit näher untersucht werden.rn

Einfluss unterschiedlicher polymerer Nanopartikel auf das Differenzierungsverhalten von humanen Stammzellen

n der vorliegenden Dissertation wurde systematisch die Interaktion von rnunterschiedlichen polymeren Nanopartikeln auf die Zellfunktionalität und das rnDifferenzierungspotential zweier humaner Stammzelllinien (mesenchymale und rnhämatopoetische Stammzellen) untersucht. Als Modellsystem wurden Polystyrol-rnPartikel für bioinerte Nanopartikel und PLLA-Partikel als Modell für bioabbaubare Nanopartikel gewählt. rnDie Analyse der Partikelaufnahme und der Zytotoxizität ergab, dass alle getesteten Partikel nach einen Zeitraum von 24 h und einer Inkubation mit 300 µg/mL Partikeln in beiden Zellsorten nicht toxisch waren. Für die CTMA-Cl-stabilisierten Partikel wurde während Differenzierungsversuche mit hMSCs eine Langzeittoxizität festgestellt, so dass diese Partikel für weitere Versuche nicht verwendet werden konnten. rnAlle Partikel wurden in die Zellen aufgenommen. Die Lutensol-stabilisierten Polystyrol-Partikel zeigten sowohl in unfunktionalisierter Form als auch mit Aminogruppen auf der Oberfläche ein geringeres Aufnahmeverhalten in hMSCs und wurden deswegen nicht für weitere Versuche verwendet. Die SDS-stabilisierten Polystyrol-Partikel zeigten eine gute Aufnahme, die durch die funktionalisierung mit Carboxylgruppen um ca. das 3-fache rnverstärkt werden konnte (hMSCs). Gleiches wurde für die CTMA-Cl stabilisierten rnPolystyrol und dem dazugehörigen aminofunktionalisierten Partikel beobachtet rn(hMSCs). In hHSCs wurden nur die SDS-stabilisierten Polystyrol-Partikel (nicht rnfunktionalisiert, carboxylfunktionalisiert) getestet. Hierbei konnte kein Unterschied bezüglich der Aufnahme festgestellt werden. Die PLLA- und PLLA-Fe-Partikel wurden sowohl in hMSCs als auch in hHSCs sehr gut und besser als die Polystyrol-Partikel aufgenommen. Das in den Partikeln eingebaute Magnetit zeigt keine Auswirkungen auf die Zellaufnahme. Für weitere Versuche wurden deshalb auf Grund der Aufnahme und Toxizitätsdaten die SDS-stabilisierten Polystyrol-Partikel (PS und PS-COOH) sowie die ebenfalls SDS-stabilisierten PLLA-Partikel (PLLA und PLLA-Fe) gewählt. Somit standen 4 Partikel zur Auswahl, die sich sowohl in ihrer Größe als auch im verwendeten Tensid nicht unterscheiden und so Aussagen über den Einfluss von Oberflächenfunktionalisierung sowie Magnetit zulassen. rnDie Zellfunktionalität der hMSCs unter Partikeleinfluss wurde mit Hilfe von IL-6 und IL-8 Messungen untersucht, hierbei zeigte sich, dass nur der PLLA-Fe-Partikel zu einer signifikant erhöhten IL-8 Ausschüttung führte, die Sekretion von IL-6 blieb vollständig unverändert. Die IL-8 Sekretion der hHSCs wurde durch die Anwesenheit der Partikel nicht verändert. rnUm den Einfluss der oben beschriebenen Partikel auf das Differenzierungspotential von hMSCs und hHSCs zu untersuchen, wurden beide Zelllinien vor der Induktion der Differenzierung für 24 h mit 300 µg/mL Partikeln inkubiert. Sowohl die histochemischen Färbungen der differenzierten hMSCs als auch die CD-Marker-Färbungen der differenzierten hHSCs zeigten keinen Einfluss der Partikel auf die Differenzierungsfähigkeit. Bei den hMSCs konnte auch keine durch die Partikel hervorgerufene Differenzierung nachgewiesen werden. Die Analyse der Differenzierung auf RNA-Ebene (qPCR) ergab jedoch für beide Zelllinien, dass einzelne Partikel einzelne Differenzierungsmarker in ihrer Expression positiv oder negativ beeinflussen. Einzig der PLLA-Partikel zeigt bei allen untersuchten Differenzierungsrichtungen in beiden Zelllinien rnkeine Veränderung der Expression. Die jeweils beobachteten Expressionsveränderungen sind jedoch nicht stark genug, um die Differenzierung sichtbar zu beeinflussen, was die histologischen bzw. CD-Marker-Färbungen gezeigt haben. rnIn einem Kooperationsprojekt mit der Gruppe von Arancha del Campo (MPI für rnPolymerforschung) wurde der Einfluss unterschiedlicher BMP-2-Peptide auf die rnosteogene Differenzierung von hMSCs untersucht. Hierbei konnte gezeigt werden, dass die unterschiedlichen Peptide in keiner Konzentration und Kombination eine positive Wirkung auf die osteogene Differenzierung haben. rnIm Rahmen eines Kooperationsprojekts mit Kerstin Münnemann (MPI für rnPolymerforschung) konnte gezeigt werden, dass eine quantitative Bestimmung des rnzellulären Eisengehalts nach Inkubation mit SPIOs sowohl mit Hilfe von MRT, H1rn NMR als auch UV/VIS Messungen bis zu einem Detektionslimit von 100.000 Zellen /mL (bei einer Beladung von 10 pg Fe/Zelle) erfolgen kann.

Optimierung der inhalativen Therapie bei Patienten mit Cystischer Fibrose und bei Kleinkindern

Patienten mit Cystischer Fibrose müssen in der Regel verschiedene Arzneimittel mehrmals täglich inhalieren. Um den hohen Zeitaufwand dafür zu reduzieren werden die Arzneimittel häufig gemischt und simultan inhaliert. Die Kenntnis der physikalisch-chemischen Kompatibilität von Mischinhalationslösungen/ -suspensionen ist deshalb von großer Bedeutung. In der vorliegenden Arbeit wurden die Kompatibilitäten von Mischungen aus Colistimethat-Inhalationslösung (mikrobiologische Wertbestimmung) mit verschiedenen Tobramycin-Inhalationslösungen, Budesonid (HPLC) mit 5,85%-iger Natriumchlorid-Lösung sowie mit Colistimethat-Inhalationslösung und Dornase alfa (SE-HPLC, SDS-PAGE, UV-Spektrometrie, T-SCX-Chromatographie) mit verschiedenen Tobramycin-Inhalationslösungen (Fluoreszenzpolarisations-Immunoassay) nachgewiesen. Durch das Mischen mit Tobramycin-Inhalationslösungen wurden die aerodynamischen Eigenschaften (FPF, MMAD, GSD) von Dornase alfa bei simultaner Verneblung nicht verändert (bestimmt mittels Kaskadenimpaktion).rnDurch die physiologischen und anatomischen Gegebenheiten, sowie die kognitiven Fähigkeiten kleiner Kinder stellt die effektive inhalative Therapie eine große Herausforderung dar. Der Respimat® bietet mit seiner langen Sprühdauer und den kleinen Aerosolpartikeln eine vielversprechende Alternative für die Anwendung bei Kleinkindern. In der vorliegenden Studie wurde untersucht ob bei Kindern unter 5 Jahren der Respimat® als Inhalationsgerät verwendet werden kann und welchen Grad an Hilfestellung sie für ein erfolgreiches Inhalationsmanöver benötigen.rnDie Ergebnisse der Handhabungsuntersuchung, sowie die Bewertung aufgezeichneter Inhalationsprofile zeigten, dass der Respimat® für Kinder < 4 Jahre nur in Kombination mit einer Inhalierhilfe wie dem AeroChamber Plus® verwendet werden sollte. Kinder im Alter von 4 Jahren sind mit entsprechender Schulung in der Lage mit dem Respimat® alleine zu inhalieren.rn

Einfluss verschiedener nanopartikulärer Systeme auf die zelluläre Aufnahme und Zytotoxizität

Die vorliegende Dissertation untersucht Nanopartikel und Nanokapseln aus verschiedenen Materialien mit verschiedenen Modifikationen für einen zielgerichteten Medikamententransport (Drug Targeting). Obwohl bisher zahlreiche Nanopartikel und -kapseln synthetisiert wurden, besteht nach wie vor hinsichtlich der zellulären Verträglichkeit, Biokompatibilität und Aufnahme kein allumfassendes Verständnis. Mit Hilfe der in dieser Arbeit vorgestellten Untersuchungen und Ergebnissen soll ein Beitrag zur Schließung dieser Lücke geleistet werden.rnIm Rahmen der vorliegenden Dissertation wurde der Einfluss der Herstellungsmaterialien PS, PLLA, PMMA, Biomakromoleküle (BSA, DNA), ggf. stabilisiert durch HPMA-LMA-Copolymere und neu-synthetisierte Surfmere, der Formmodifikationen Streckung und Kristallisierung, der Oberflächenmodifikationen mittels verschiedener Tenside und PEG auf die zelluläre Aufnahme und Verträglichkeit hin untersucht.rnZusammenfassend lässt sich die Aussage treffen, dass zahlreiche Materialien zur Herstellung von Trägersystemen geeignet sind und sich als biokompatibel und nicht-zytotoxisch erwiesen haben, sich jedoch stark hinsichtlich der Aufnahmeeffizienz in verschiedene Zelllinien unterscheiden. rnIm ersten Abschnitt (Kapitel 5.1) wurden in der ersten und zweiten Untersuchung auf allgemeine Parameter, die die Aufnahme von Nanopartikeln beeinflussen, eingegangen. Hier wurde der Einfluss des Alters von PLLA-Partikeln auf die zelluläre Aufnahme und Toxizität untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass mit zunehmender Materialalterung die zelluläre Aufnahme abnimmt. Eine Zytotoxizität konnte nicht gezeigt werden.rnWeiterhin wurde der Einfluss des FCS-Gehalts des Zell-Mediums auf die zelluläre Aufnahme von PMMA-Partikeln untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass mit einer steigenden FCS-Konzentration eine Abnahme der zellulären Aufnahme von PMMA-Partikeln einhergeht. Die höchste zelluläre Aufnahme konnte bei einem FCS-Gehalt des Zellmediums von 0,05% verzeichnet werden. rnIm zweiten Abschnitt (Kapitel 5.2) wurde die Stabilisierung von Nanopartikeln mittels neusynthetisierter Tenside und deren Einfluss auf die Zelle-Nanopartikel-Interaktionen untersucht. Dazu wurde zum einen die Oberflächenfunktionalisierung von Nanopartikeln mit Hilfe neu-synthetisierter „Surfmere“ und deren Einfluss auf die zelluläre Aufnahme und Toxizität untersucht. Die hergestellten Surfmere bewirken gleichzeitig eine Stabilisierung und Funktionalisierung der Nanopartikeloberfläche mit Phosphonatgruppen. Hier wurden kovalente „Surfmer“ stabilisierte Nanopartikel mit Tensid- (SDP) stabilisierten Nanopartikeln verglichen. Zudem wurden dialysierte Nanopartikel mit nicht-dialysierten verglichen. Bezüglich der zellulären Aufnahme konnte für die mittels Dialyse gereinigten Nanopartikel eine gute Aufnahme ohne Unterschiede zwischen den kovalent und nicht-kovalent Phosphonat-funktionalisierten Partikeln beobachtet werden. Die ungereinigten, SDP-stabilisierte, nicht-kovalent gebundene Nanopartikel zeigten hingegen eine bis zu 30% stärkere Aufnahme in die HeLa-Zellen und hMSCs.rnWeiterhin der Einsatz von mit HPMA-LMA-Copolymeren stabilisierte Polystyrol- und PLLA-Partikel, die den Einsatz von Tensiden während des Miniemulsionsprozesses überflüssig machen, untersucht. Auch hier konnte keine Zytotoxizität nachgewiesen werden. Die Aufnahme in HeLa-Zellen scheint mehr von der Größe der Nanopartikel als vom verwendeten Material und in hMSCs mehr von den Oberflächeneigenschaften der Nanopartikel abzuhängen.rnIm dritten Abschnitt (Kapitel 5.3) wird auf die Möglichkeit der Formmodifikation von Polystyrol-Partikeln und deren Einfluss auf die Nanopartikel-Zelle-Interaktionen eingegangen. Es geht dabei um die Aufnahme und Zytotoxizität von verstreckten (elongierten) Polystyrol-Partikeln im Vergleich zu sphärischen Nanopartikeln, sowie die Aufnahme und Zytotoxizität von kristallinen Polystyrol-Partikeln in verschiedene Zelllinien. Bei den verstreckten Partikeln nimmt die Aufnahme-Effizienz in HeLa-Zellen und hMSCs mit zunehmender Verstreckung ab. Eine Zytotoxizität konnte für keinen der erwähnten Nanopartikel nachgewiesen werden. Bei den Polystyrol-Partikeln unterschiedlicher Taktizität zeigen die kristallierten Polystyrol-Partikel eine geringfügig besser Aufnahme-Rate als die nicht-kristallierten Polystyrol-Partikel. Dabei zeigen die nach dem Herstellungsprozess mittels der Lösemittelverdampfungstechnik der wässrigen Phase entnommenen Partikel eine bessere Aufnahme als die nach der Verdampfung des Chloroforms verfügbaren Partikel. Insgesamt konnte jedoch für alle Polystyrol-Partikel trotz der unterschiedlichen Taktizitäten nach der Aufnahme in HeLa-Zellen und hMSCs mittels Durchflusszytometrie hohe Fluoreszenz-Intensitäten verzeichnet werden. Setzt man hohe Fluoreszenz-Intensitäten bei in Zellen aufgenommenen Partikeln mit guten Aufnahmeraten gleich, sind die hier dargestellten Aufnahmeraten als sehr gut zu bezeichnen. rnAuf Nanosysteme mit einer reduzierten zellulären Aufnahme wird im letzten Abschnitt (Kapitel 5.4) eingegangen. Dabei wird zum einen die unterschiedliche Oberflächenmodifikation von Polystyrol-Partikeln mit dem Co-Monomer PEG-MA und den Tensiden SDS und Lutensol AT50 untersucht. Von PEG-MA wurden zudem verschiedene Molekulargewichte (Mn=300 g•mol-1 und Mn=2080 g•mol-1) und verschiedene Konzentrationen (1,5%, 5%, 10%) eingesetzt. Ein Teil der Partikel wurde mit SDS und der andere Teil mit Lutensol AT50 hergestellt. In einem weiteren Schritt wurde das jeweilig gegenteilige Tensid (statt SDS Lutensol AT50 und umgekehrt) eingesetzt, um zu überprüfen, ob sich der zuvor beobachtete Effekt umkehren lässt. Anschließend wurde ein erst mit SDS stabilisierter Nanopartikel (BR01) mit verschiedenen Lutensol AT50-Anteilen (5%, 10%, 25%, 50%, 100%) redispergiert. Die effizienteste Aufnahme zeigte der unmodifizierte, mit SDS stabilisierte Nanopartikel BR01, die niedrigste der ebenfalls unmodifizierte, mit Lutensol AT50 stabilisierte Nanopartikel BR02. Eine steigende Konzentration des PEG-MA Mn=300 g•mol-1 hemmt die Aufnahme von mit SDS stabilisierten Partikeln konstant. Für PEG-MA Mn=2080 g•mol-1 konnte hingegen kein Einfluss nachgewiesen werden. Für die mit Lutensol AT50 stabilisierten Partikel konnte kein Einfluss von PEG-MA nachgewiesen werden. Daraus resultiert, dass der Einsatz von physikalisch adsorbiertem Lutensol AT50 die zelluläre Aufnahme effektiver hemmt als der Einsatz von kovalent gebundenem PEG-MA unterschiedlicher Kettenlänge.rnDer Einsatz von mit Biomakromolekülen hergestellten Nanokapseln, die mit zwei verschiedenen Tensiden (SDS und Lutensol AT50) stabilisiert wurden, wurde im Weiteren näher untersucht. Bei den mit SDS stabilisierten Kapseln erwiesen sich die mit ssDNA hergestellten Kapseln BN-54 und BN-55 als leicht toxisch für die HeLa-Zellen. Dagegen sind alle eingesetzten, mit Lutensol AT50 redispergierten Nanokapseln sowohl für HeLa-Zellen als auch für hMSCs zytotoxisch. Hier ist die toxische Wirkung auf das nicht-ionische Tensid Lutensol AT50 zurückzuführen. Eine zelluläre Aufnahme konnte für keine mit Biomakromolekülen hergestellten Nanokapsel nachgewiesen werden.rnDen Abschluss der Untersuchungen bildet die vergleichende Analyse der in dieser Arbeit mit dem Fluoreszenzfarbstoff PMI versehenen Partikeln hinsichtlich deren Aufnahme in HeLa-Zellen und hMSCs und deren zytotoxische Auswirkungen. In der vergleichenden Analyse werden die zuvor vorgestellten Ergebnisse für PMI-Partikeln nochmal im Kontext betrachtet. Dabei erwies sich sowohl für die HeLa-Zellen als auch für die hMSCs, dass die meisten Partikel eine geringe bis keine zelluläre Aufnahme zeigen. Eine gute Aufnahme konnte nur für wenige Nanopartikel (vor allem für die kristallinen Nanopartikel) verzeichnet werden. Eine Korrelation zwischen der Aufnahmeeffizienz und der Zytotoxizität konnte nicht nachgewiesen werden. rn

Functionalization and characterization of magnetic nanoparticles for biomedical applications

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Oberflächenfunktionalisierung von MnO Nanopartikeln (NP). Durch die Verwendung und Verbesserung verschiedener Polymere durch die Einbindung von Poly (Ethylen Glycol) (PEG), gelang es, die Löslichkeit dieser Nanopartikel in wässrigen Lösungen sowie in Körperflüssigkeiten zu erhöhen. Zusätzlich konnten diese Nanopartikel deutlich besser steril filtriert werden und zeigten eine erhöhte Aktivität alsrnKontrastmittel im MRT. Vorläufige Ergebnisse für die Verwendung von Silika als Schutzhülle für MnO NP werden ebenfalls kurz erläutert. Die verwendeten Polymere besaßen dabei zugängliche Aminogruppen, die eine weitere Funktionalisierung durch Bio-aktiver Gruppen ermöglichte. Der Nachweis einer erfolgreichen Bindung durch verschiedene Methoden wie SDS-PAGE, Western- und Northern Blot sowie die Verwendung unterschiedlicher FluoreszenzMessungen wird ebenfalls diskutiert. MnO NP und anderer magnetischer NP werden weiterhin auf ihr toxisches Verhalten gegenüber Caki1 und HeLa Zellen getestet. Dabei zeigte sich, dass MnO NP, im Gegensatz zu einigen Kupferoxiden, quasi nicht toxisch waren und das Proliferationsverhalten dieser Zellen quasi nicht beeinflussten. Weiterhin wurde ein Fluoreszenzfarbstoff, konkret Protoporphyrin IX, an die Oberfläche von MnO NP angebracht.Diese konnten dann erfolgreich als Kontrastmittel in der MRT verwendet werden und zeigten vielversprechende Ergebnisse für die Photodynamische Therapie. Desweiteren wird die Synthese des Antikörpers gegen p53 ausführlich erläutert. Dabei wurde genau darauf geachtet,dass dieser Antikörper dann an MnO NP gebunden werden kann.

Etablierung eines humanisierten Mausmodells zur In-vivo-Analyse von DC-adressierenden Nanopartikeln

In dieser Arbeit wurde zunächst ein humanisiertes Mausmodell entwickelt für die Analyse von humanen DCs in vivo. Darüber hinaus wurden erste Versuche mit Nanopartikelbeladenen DCs durchgeführt, mit der Intention, durch diese Kombination humane DCs zu untersuchen. Es wurden immunsupprimierte NOD/LtSz-scid IL2R (NSG) Mäuse verwendet und mit humanen CD34+ PBSCs transplantiert. Es wurden insgesamt 14 Modelle getestet, mit einer durchschnittlichen Humanisierungsrate von 76 %. In allen Modellen konnten ab Woche sechs nach Transplantation humane CD45+ Zellen sowie humane Bund NK-Zellen und CD14+ Monozyten gefunden werden. Darüber hinaus waren myeloide DC-Vorläuferzellen, konventionelle HLA DR CD11c DCs (cDCs) und plasmazytoide DCs (pDCs) vorhanden. Humane T-Zellen konnten nicht vor Woche 18 nach Transplantation beobachtet werden. Neben der Rekonstitution humaner DCs in peripheren Organen, wurde ebenfalls nach gewebsständigen DCs, insbesondere den Langerhans Zellen (LCs) der Epidermis geschaut. Waren humane LC vorhanden, konnten diese ab Woche zwölf nach Transplantation in der murinen Epidermis detektiert werden. Diese waren konstant bis in Woche 30 nach Transplantation nachweisbar. In Hinblick auf die Etablierung der DCs in diesem humanisierten Mausmodells wurden verschiedene Einflussgrößen getestet. IL-7 führte zu keiner veränderten Hämatopoese, wohingegen Flt3L zu einer Zunahme von CD14+ Monozyten und cDCs führte. Darüber hinaus konnte eine drastische Abnahmernhumaner B-Zellen beobachtet werden. Es zeigte sich, dass der Zeitpunkt der Flt3LrnApplikation einen entscheidenen Faktor für den Effekt von Flt3L auf die Rekonstitution humaner Zellen darstellt. Für die in dieser Arbeit durchgeführten funktionellen in vivo Studien, wurden humanisierten Mäusen alloreaktive CD8+ T-Zellen appliziert. Somit sollte die Funktionalität der rekonstituierten humanen APCs getestet werden. Es wurde deutlich, dass Monozyten und DCs ihre Funktionalität erst ab Woche 14 nach Transplantation zu entwickeln schienen,rnwohingegen B-Zellen bereits zu früheren Zeitpunkten als Zielzellen für die alloreaktiven T-Zellen dienten. Dies wurde durch den Rückgang der jeweiligen Zellen nach Applikation der T-Zellen sichtbar. Zu erwähnen ist, dass das Anwachsen einer humanen Hämatopoese stark spenderabhängig ist und somit keine allgemeingültigen Aussagen hinsichtlich der in vivo Funktion getroffen werden können. Um im Gewebe verbliebende APCs zu manipulieren gibt es verschiedene Möglichkeiten. Im Rahmen dieser Arbeit wurden auf Polystyren-basierende Nanopartikel getestet. Die verwendeten Partikel hatten eine Größe von 80 bis 160 nm und waren unfunktionalisiert oder mit Amino- bzw. Carboxy-Gruppen versehen. Zusätzlich wurden die Partikel mit BODIPY (Durchflusszytometrie und kLSM-Messungen), einem Infrarotnahem Farbstoff IR 780 (BFI-Messungen) und Platin (in vivo Messungen) beladen. Der Carboxy-funktionalisierte Partikel zeigte den geringsten Einfluss auf die Vitalität von humanen DCs, wohingegen der Amino-funktionalisierte Partikel bei steigender Konzentration toxisch wirkte. Bei unfunktionalisierten Partikeln stieg die Toxizität bei zunehmender Konzentration. Hinsichtlich der Expression diverser DC spezifischer Oberflächenmoleküle nach Beladung mit Nanopartikeln zeigte sich, dass allein der unfunktionalisierte, mit Lutensol AT50 hergestellte Partikel zu einer leichten Hochregulation von MHC-Klasse-II Molekülen führte. Die Expression von CD86 wurde im Gegenzug nur durch die Beladung mit den Amino-, bzw. Carboxy funktionalisierten Partikeln und dem unfunktionalisierten, mit SDS hergestellten Partikel leicht gesteigert. Trotz der teilweise leicht veränderten Expression von Oberflächenmarkern, konnte mit Hilfe von IFN-g ELISpots keine Beeinflussungrnder Funktion als APCs von Nanopartikel-beladenen DCs beobachtet werden. In den in vivo Untersuchungen zeigten alle vier Partikel eine konstante Zirkulation imrnOrganismus und konnten bis 96 h nach Applikation nachgewiesen werden. Alle Partikel konnten primär in der Leber detektiert werden, wobei der unfunktionalisierte, mit Lutensol AT50 hergestelle Partikel das weiteste Verbreitungsmuster zeigte. Erste Versuche im humanisierten Mausmodell zeigten keine Beeinflussung der Verteilung und Kinetik von Nanopartikeln durch die humane Hämatopoese. Mit dem in dieser Arbeit etablierten humanisierten Mausmodell ist es möglich, die Entwicklung, Differenzierung, Aktivierung und Funktionalität humaner DCs in vivo zu untersuchen. Darüber hinaus kann das gezielte Adressieren von DCs in vivo analysiert werden, was sowohl die Möglichkeit der Manipulation von DCs zur Vermeidung einer akuten GvHD bietet als auch Verwendung in anderen DC-vermittelten Therapien (z.B.Vakzinationsstudien) findet.

Untersuchungen zur Wirkung des Ginkgo-biloba-Extraktes EGb 761 auf die Proteinaggregation in der Huntington-Krankheit

Der Ginkgo biloba-Extrakt EGb 761 besteht aus einer Reihe pharmakologisch wirksamer Substanzen, welche gut beschriebene Wirkungen auf verschiedene potentiell zytoprotektive Signalwege ausüben und u.a. antioxidative Wirksamkeit haben. Folglich wurde EGb 761 bisher als eine natürliche Behandlung bei neurodegenerativen Erkrankungen mit zellulärem oxidativen Stress angewendet, einschließlich der Alzheimer-Krankheit (AD). Aufgrund von vielen gemeinsamen Merkmalen zwischen der AD und der Huntington-Krankheit (HD) wurde vermutet, dass EGb 761 eventuell auch positive Wirksamkeit bei der HD aufweisen könnte. rnDie Neuropathologie der HD wird durch pathologische Verlängerung an Glutamin-Wiederholungen im Huntingtin-Protein (polyQ-Protein) verursacht, wodurch es zu Fehlfaltungen im Protein kommt und hierdurch der proteasomale Abbau aberranter Proteine erschwert wird. Somit sollten in der vorliegenden Arbeit die EGb 761-Wirkungen auf die Proteasom-Aktivität und die Proteinaggregation in zellulären Modellen der HD untersucht werden. rnWie die ersten Untersuchungen in nativen HEK293-Zellen ergaben, bewirkte die Behandlung der Zellen mit EGb 761 eine Steigerung der basalen Proteasom-Aktivität sowie des proteasomalen Proteinabbaus und erhöhte die Transkription proteasomaler Gene. Hieraus ergaben sich Untersuchungen in Zellen mit Expressionen pathologischer Varianten von polyQ-Proteinen als zelluläre Modelle der HD. Hierbei konnte festgestellt werden, dass die Expression aberranter polyQ-Proteine eine verminderte zelluläre Proteasom-Aktivität bewirkte. Interessanterweise verursachte EGb 761 eine Abmilderung der pathologisch-induzierten verminderten Proteasom-Aktivität, in dem die EGb 761-Behandlung der Zellen zu einer erhöhten Proteasom-Aktivität, einem verbesserten proteasomalen Proteinabbau, sowie zu einer erhöhten Transkription proteasomaler Gene führte. Da diese EGb 761-Effekte unabhängig von der Expression aberranter polyQ-Proteine waren, demonstrierten diese Ergebnisse eine allgemeine EGb 761-Wirkungen auf die Proteasom-Aktivität. Anhand dieser Ergebnisse sollten anschließend weitere Untersuchungen mit zellulären Modellen der HD die genau Wirkung von EGb 761 auf die Degradation von abnormal verlängerten polyQ-Proteinen sowie auf die Bildung von polyQ-Aggregaten klären. rnHier konnte gezeigt werden, dass die Expression aberranter polyQ-Proteinen zu einer Akkumulation von SDS-resistenten bzw. SDS-unlöslichen, aggregierten polyQ-Proteinen führte, sowie die Bildung von sichtbaren polyQ-Aggregaten in Zellen bewirkte. Hierbei verursachte eine EGb 761-Behandlung der Zellen eine signifikante Verminderung im Gehalt an SDS-resistenten polyQ-Proteinen sowie eine Reduzierung von Aggregat-tragenden Zellen. Zudem konnte gezeigt werden, dass eine pharmakologische Inhibition des Proteasoms in EGb 761-behandelten Zellen, den Gehalt an SDS-unlöslichen polyQ-Proteinaggregate wieder erhöhte und somit den Effekt von EGb 761 aufhob. Folglich zeigten diese Ergebnisse, dass die EGb 761-induzierte Reduzierung der polyQ-Proteinaggregate durch einen effizienteren proteasomalen Abbau von fehlgefalteten, aberranten polyQ-Proteinen bewirkte wurde. rnAufbauend auf diesen Ergebnissen wurde eine experimentell-therapeutische Anwendung von EGb 761 in Modellen der HD in vitro und in vivo überprüft und hierzu primäre humane Fibroblasten sowie transgene C. elegans Würmer mit Expressionen aberranter polyQ-Proteine untersucht. Interessanterweise konnte in vitro und in vivo gezeigt werden, dass die EGb 761-Behandlung auch hier eine Reduzierung von SDS-unlöslichen polyQ-Proteinen bewirkte und zudem eine Reduzierung des pathologisch erhöhten Gehalts an Polyubiquitin-Proteinen bewirkte. Folglich wurde auch hier vermutet, dass EGb 761 einen verbesserten proteasomalen Abbau von polyQ-Proteinen induzierte und dies eine Verminderung der polyQ-Proteinaggregate verursachte. Darüber hinaus führte die EGb 761-Behandlung von seneszenten Fibroblasten zur Reduzierung von altersabhängig erhöhten Mengen von polyQ-Aggregaten, wodurch ein therapeutischer Effekt auf den proteasomalen Abbau der polyQ-Proteine verdeutlicht wurde. Zusätzlich konnte in polyQ-transgenen C. elegans demonstriert werden, dass eine EGb 761-Behandlung die Abmilderung eines typischen pathologischen Phänotyps bewirkte, indem eine polyQ-induzierte verminderte Motilität der Nematoden verbessert wurde und hierdurch eine positive EGb 761-Wirkung auf die Pathologie der HD in vivo dargestellt wurde. rnZusammenfassend konnten in dieser Arbeit neue Wirkungen von EGb 761 in der HD demonstriert werden. Hierbei wurde gezeigt, dass EGb 761 die Aggregation von pathogenen aberranten polyQ-Proteinen in vitro und in vivo reduziert, indem eine effizientere Degradation von polyQ-Proteinen erfolgt. Somit könnte diese Wirkungen von EGb 761 eine potentiell therapeutische Anwendung in der HD und ähnliche neurodegenerativen Erkrankungen darstellen.

Analyse der intrazellulären Freisetzung von Wirkstoffmodellen via konfokaler Laser-Raster-Mikroskopie

In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, wie man das Potential nanopartikulärer Systeme, die vorwiegend via Miniemulsion hergestellt wurden, im Hinblick auf „Drug Delivery“ ausnutzen könnte, indem ein Wirkstoffmodell auf unterschiedliche Art und Weise intrazellulär freigesetzt wurde. Dies wurde hauptsächlich mittels konfokaler Laser-Raster-Mikrokopie (CLSM) in Kombination mit dem Bildbearbeitungsprogramm Volocity® analysiert.rnPBCA-Nanokapseln eigneten sich besonders, um hydrophile Substanzen wie etwa Oligonukleotide zu verkapseln und sie so auf ihrem Transportweg in die Zellen vor einem etwaigen Abbau zu schützen. Es konnte eine Freisetzung der Oligonukleotide in den Zellen aufgrund der elektrostatischen Anziehung des mitochondrialen Membranpotentials nachgewiesen werden. Dabei war die Kombination aus Oligonukleotid und angebundenem Cyanin-Farbstoff (Cy5) an der 5‘-Position der Oligonukleotid-Sequenz ausschlaggebend. Durch quantitative Analysen mittels Volocity® konnte die vollständige Kolokalisation der freigesetzten Oligonukleotide an Mitochondrien bewiesen werden, was anhand der Kolokalisationskoeffizienten „Manders‘ Coefficients“ M1 und M2 diskutiert wurde. Es konnte ebenfalls aufgrund von FRET-Studien doppelt markierter Oligos gezeigt werden, dass die Oligonukleotide weder beim Transport noch bei der Freisetzung abgebaut wurden. Außerdem wurde aufgeklärt, dass nur der Inhalt der Nanokapseln, d. h. die Oligonukleotide, an Mitochondrien akkumulierte, das Kapselmaterial selbst jedoch in anderen intrazellulären Bereichen aufzufinden war. Eine Kombination aus Cyanin-Farbstoffen wie Cy5 mit einer Nukleotidsequenz oder einem Wirkstoff könnte also die Basis für einen gezielten Wirkstofftransport zu Mitochondrien liefern bzw. die Grundlage schaffen, eine Freisetzung aus Kapseln ins Zytoplasma zu gewährleisten.rnDer vielseitige Einsatz der Miniemulsion gestattete es, nicht nur Kapseln sondern auch Nanopartikel herzustellen, in welchen hydrophobe Substanzen im Partikelkern eingeschlossen werden konnten. Diese auf hydrophobe Wechselwirkungen beruhende „Verkapselung“ eines Wirkstoffmodells, in diesem Fall PMI, wurde bei PDLLA- bzw. PS-Nanopartikeln ausgenutzt, welche durch ein HPMA-basiertes Block-Copolymer stabilisiert wurden. Dabei konnte gezeigt werden, dass das hydrophobe Wirkstoffmodell PMI innerhalb kürzester Zeit in die Zellen freigesetzt wurde und sich in sogenannte „Lipid Droplets“ einlagerte, ohne dass die Nanopartikel selbst aufgenommen werden mussten. Daneben war ein intrazelluläres Ablösen des stabilisierenden Block-Copolymers zu verzeichnen, welches rn8 h nach Partikelaufnahme erfolgte und ebenfalls durch Analysen mittels Volocity® untermauert wurde. Dies hatte jedoch keinen Einfluss auf die eigentliche Partikelaufnahme oder die Freisetzung des Wirkstoffmodells. Ein großer Vorteil in der Verwendung des HPMA-basierten Block-Copolymers liegt darin begründet, dass auf zeitaufwendige Waschschritte wie etwa Dialyse nach der Partikelherstellung verzichtet werden konnte, da P(HPMA) ein biokompatibles Polymer ist. Auf der anderen Seite hat man aufgrund der Syntheseroute dieses Block-Copolymers vielfältige Möglichkeiten, Funktionalitäten wie etwa Fluoreszenzmarker einzubringen. Eine kovalente Anbindung eines Wirkstoffs ist ebenfalls denkbar, welcher intrazellulär z. B. aufgrund von enzymatischen Abbauprozessen langsam freigesetzt werden könnte. Somit bietet sich die Möglichkeit mit Nanopartikeln, die durch HPMA-basierte Block-Copolymere stabilisiert wurden, gleichzeitig zwei unterschiedliche Wirkstoffe in die Zellen zu bringen, wobei der eine schnell und der zweite über einen längeren Zeitraum hinweg (kontrolliert) freigesetzt werden könnte.rnNeben Nanokapseln sowie –partikeln, die durch inverse bzw. direkte Miniemulsion dargestellt wurden, sind auch Nanohydrogelpartikel untersucht worden, die sich aufgrund von Selbstorganisation eines amphiphilen Bock-Copolymers bildeten. Diese Nanohydrogelpartikel dienten der Komplexierung von siRNA und wurden hinsichtlich ihrer Anreicherung in Lysosomen untersucht. Aufgrund der Knockdown-Studien von Lutz Nuhn konnte ein Unterschied in der Knockdown-Effizienz festgestellt werden, je nach dem, ob 100 nm oder 40 nm große Nanohydrogelpartikel verwendet wurden. Es sollte festgestellt werden, ob eine größenbedingte, unterschiedlich schnelle Anreicherung dieser beiden Partikel in Lysosomen erfolgte, was die unterschiedliche Knockdown-Effizienz erklären könnte. CLSM-Studien und quantitative Kolokalisationsstudien gaben einen ersten Hinweis auf diese Größenabhängigkeit. rnBei allen verwendeten nanopartikulären Systemen konnte eine Freisetzung ihres Inhalts gezeigt werden. Somit bieten sie ein großes Potential als Wirkstoffträger für biomedizinische Anwendungen.rn

Enzyme tRNA interaction and (t)RNA conformation probed via environmentally sensitive cyanine dyes

Nukleosidmodifikationen beeinflussen Dynamik und Konformation von RNArnund sind epigenetisch wirksam. Wenig verstanden sind konformationelle Dynamik und enzymatische Erkennung von tRNA, sowie der Einfluss des mutmaßlichen kovalenten Inhibitors 5-Fluorouridine (5FU) auf Y Synthasen, die Pseudouridin (Y) erzeugen. Frühere Arbeiten nutzten mit den Fluorophoren Cy3 und Cy5rnmarkierte tRNA, um diese Fragen zu adressieren.rnDie vorliegende Arbeit weitet Cy3-Cy5-Markierung auf Hefe tRNArnPhernaus undrnnutzt Thermophorese und fortschrittliche Fluoreszenzspektroskopie. In der Thermophorese zeigte sich eine hohe Toleranz gegenüber Fluoreszenzmarkierung beirngleichzeitiger Erhöhung der Cy5 Fluoreszenz durch Enzymbindung. Zudem konnte die Konformation verschiedener Mutanten human mitochondrialer tRNArnLysrnund die Bindung von SAM durch SAM-I Riboswitch RNA untersucht werden.rnUm etwaige Unterschiede in der Interaktion von Y55 Synthase TruB mit Cy5-gelabelter U55- bzw. 5FU55-tRNA aufzudecken, wurde eine Kombination ausrnThermophorese, zeit- und polarisationsaufgelöster Fluoreszenzspektroskopie undrn’gel shift’ Experimenten genutzt. Alle Ergebnisse zeigten übereinstimmend einernreversible Bindung ähnlicher Affinität für beide tRNAs und widersprechen somit einer kovalenten Inhibition durch 5FU. Folgerichtig wurde der SDS-stabilernKomplex von TruB mit 5FU-tRNA neu evaluiert, da er bisher als kovalent interpretiert wurde. Es erfolgte eine schnelle Komplexbildung in hoher Ausbeute auchrnfür schlechte Substrate, außerdem ließ sich die Komplexausbeute nicht durch andere Reaktionsbedingungen beeinflussen. Somit kann der SDS stabile Komplexrnnur den ersten, nicht-kovalenten Kontakt von Enzym und 5FU55-tRNA darstellen und repräsentiert kein kovalentes Addukt späterer Katalyse.

Synthese und Charakterisierung von Polymer-Wirkstoff-Antikörper-Konjugaten zur Anwendung in der Krebsimmuntherapie

Polymere Wirkstoffsysteme gewinnen im Bereich der biomedizinischen Forschung immer größeres Interesse. Vielversprechende Systeme für die Entwicklung von neuartigen Krebs-immun¬therapien stellen insbesondere Polymer-Konjugate dar. Das ideale Polymer-Konjugat besitzt eine Größe zwischen 10 nm und 100 nm, ist nicht zytotoxisch und zeigt keine Aggregation in humanem Blutserum. In der vorliegenden Arbeit wurde die Synthese und Charakterisierung von Polymer-Wirkstoff-Konjugaten zur Anwendung in der Krebsimmuntherapie behandelt. Erstes Ziel der Arbeit war es, geeignete polymere Trägersysteme für die in vivo Anwendung zu finden. Hierzu wurde zunächst die Stabilität verschiedener potentieller polymerer Träger-systeme (Nanohydrogele, Succinyliertes-Poly-L-Lysin (Bürste), ELP-Bürsten und Poly(2-oxazolin)bürsten) in humanem Serum untersucht. Weiterhin wurde die unspezifische Zellaufnahme in murinen dendritischen Zellen (DCs) analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass vor allem neutrale bzw. zwitterionische Partikel eine hohe Serumstabilität sowie keine unspezifische Zellaufnahme zeigen. Um eine gezielte Adressierung der DCs des Immunsystems zu erreichen und dadurch eine Immunantwort gegenüber einem bestimmten Krebs Zelltyp zu induzieren, wurden Biokonjugate - auf Basis der Succinylierten-Poly-L-Lysin-(Bürste) sowie der Azid-funktionalisierten Poly(2-oxazolin)bürste (POx) – entwickelt, da diese Polymerbürsten keine bzw. kaum unspezifische Aufnahme in DCs zeigen. Hierbei diente der Antikörper aDEC205 der gezielten Adressierung von CD8+ DCs. Die weiteren bioaktiven Komponenten waren das tumorassoziierte Antigen (TAA) mit der Kernsequenz SIINFEKL zur Induktion einer spezifischen Immunantwort sowie der immunaktivierende TLR9 Ligand, CpG1826. Die Komponenten wurden nacheinander an die Fluoreszenz-markierten Polymere kon¬jugiert. Die Konjugation des Antikörpers erfolgte nach vorangegangener DIBO-Modifizierung über kupferfreie Click-Chemie. Mit einer optimierten Aufarbeitungsmethodik gelang es, aggregat-freie, unimere DIBO-modifizierte aDEC205 Antikörper zu isolieren. Für die succinylierten Poly-L-Lysine konnten keine eindeutigen sowie reproduzierbaren Ergebnisse erhalten werden, sodass sich im weiteren Verlauf der Arbeit auf die POx konzentriert wurde. Die Konjugation von aDEC205 an POx wurde mittels verschiedener physiko-chemischer Methoden (UV-VIS, SDS-PAGE, FCS, GPC, CLSM und FACS) gezeigt. Mit Hilfe von „Specific-Hybridization-Internalisation-Sensor“ Experimenten konnte eine spezifische Aufnahme des Konjugats in CD8+ DCs nachgewiesen werden. rnDie Konjugation von Antigen und CpG erfolgte ebenso nach entsprechender Modifizierung über kupferfreie Click-Chemie. SDS-PAGE, UV-VIS und FCS bestätigten eine erfolgreiche Kopplung. T-Zell-Proliferationsversuche ergaben für Antigen enthaltende Polymer-Konjugate eine CD8+ T-Zell-Aktivierung. Des Weiteren zeigten die POx keine bemerkenswerte Toxizität und deren Konjugate keine Aggregation in humanem Serum. rnrnDarüber hinaus wurde der Einfluss verschiedener Polymertopologien auf ihre Biodistribution sowie Blutzirkulation untersucht. Für die nach GPC-Fraktionierung erhaltenen verschiedenen Polymerfraktionen - hochmolekulare wurmartige Polymerbürsten, ellipsoidartige Polymer-bürsten und niedermolekulare kugelförmige Moleküle - konnten vielversprechende Ergebnisse erhalten werden.