Die Rolle von GABA- und Glyzinrezeptoren während der radialen Migration kortikaler Neurone in der pränatalen Maus

Für die Entwicklung des zerebralen Kortex ist die radiale Migration von Neuronen von elementarer Bedeutung. Für diese radiale Migration sind extrazelluläre Signale, die mit den Neuronen interagieren und eine Umgestaltung des Zytoskeletts vermitteln, notwendig. Zu den extrazellulären Signalen gehört auch der Neurotransmitter GABA, der über Depolarisation der Neurone einen Ca2+-Einstrom vermittelt und dadurch die Modulation der Migration über Ca2+-abhängige Signalwege ermöglicht. Auch von Taurin ist bekannt, dass es die neuronale Migration beeinflusst. Frühere Studien zeigten, dass die Depolarisation von GABAA-Rezeptoren durch GABA zu einem Migrationsstop führt, wohingegen Picrotoxin-sensitive Rezeptoren die Migration von der Ventrikulären Zone in die Intermediäre Zone des pränatalen Kortex vermitteln. Obwohl zu den Picrotoxin-sensitiven Rezeptoren GABAA-, GABAC- und bestimmte Glyzinrezeptoren gehören, wurde die Rolle von GABAC- und Glyzinrezeptoren während der radialen Migration nie überprüft. Ziel dieser Dissertation war deshalb, den Einfluss von GABAC- und Glyzinrezeptoren auf die radiale Migration zu untersuchen. Unter Verwendung von Migrationsanalysen, Fluoreszenzmessungen, molekularbiologischen und histologischen Methoden wurde gezeigt, dass GABAC-Rezeptoren im unteren Bereiche des präfrontalen Kortex exprimiert werden, ihre Aktivierung durch GABA in der Intermediären Zone zu einer Depolarisation führt, dass GABAC-Rezeptoren die Migration fördern und dieser Effekt über den migrationsstoppenden Effekt der GABAA-Rezeptoren dominiert. Durch Aktivierung der Glyzinrezeptoren fördert Taurin die Migration.

Lernen mit einer Hybride aus Lernendem Klassifizierendem System und Selbstorganisierender Karte

Im Forschungsgebiet der Künstlichen Intelligenz, insbesondere im Bereich des maschinellen Lernens, hat sich eine ganze Reihe von Verfahren etabliert, die von biologischen Vorbildern inspiriert sind. Die prominentesten Vertreter derartiger Verfahren sind zum einen Evolutionäre Algorithmen, zum anderen Künstliche Neuronale Netze. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Entwicklung eines Systems zum maschinellen Lernen, das Charakteristika beider Paradigmen in sich vereint: Das Hybride Lernende Klassifizierende System (HCS) wird basierend auf dem reellwertig kodierten eXtended Learning Classifier System (XCS), das als Lernmechanismus einen Genetischen Algorithmus enthält, und dem Wachsenden Neuralen Gas (GNG) entwickelt. Wie das XCS evolviert auch das HCS mit Hilfe eines Genetischen Algorithmus eine Population von Klassifizierern - das sind Regeln der Form [WENN Bedingung DANN Aktion], wobei die Bedingung angibt, in welchem Bereich des Zustandsraumes eines Lernproblems ein Klassifizierer anwendbar ist. Beim XCS spezifiziert die Bedingung in der Regel einen achsenparallelen Hyperquader, was oftmals keine angemessene Unterteilung des Zustandsraumes erlaubt. Beim HCS hingegen werden die Bedingungen der Klassifizierer durch Gewichtsvektoren beschrieben, wie die Neuronen des GNG sie besitzen. Jeder Klassifizierer ist anwendbar in seiner Zelle der durch die Population des HCS induzierten Voronoizerlegung des Zustandsraumes, dieser kann also flexibler unterteilt werden als beim XCS. Die Verwendung von Gewichtsvektoren ermöglicht ferner, einen vom Neuronenadaptationsverfahren des GNG abgeleiteten Mechanismus als zweites Lernverfahren neben dem Genetischen Algorithmus einzusetzen. Während das Lernen beim XCS rein evolutionär erfolgt, also nur durch Erzeugen neuer Klassifizierer, ermöglicht dies dem HCS, bereits vorhandene Klassifizierer anzupassen und zu verbessern. Zur Evaluation des HCS werden mit diesem verschiedene Lern-Experimente durchgeführt. Die Leistungsfähigkeit des Ansatzes wird in einer Reihe von Lernproblemen aus den Bereichen der Klassifikation, der Funktionsapproximation und des Lernens von Aktionen in einer interaktiven Lernumgebung unter Beweis gestellt.

Komparative Analyse der humanen Chromosomenregion 11p15.3 um die Gene LMO1,TUB und der orthologen Region in der Maus

Ziel der vorliegenden Arbeit war die vergleichende Sequenzierung und nachfolgende Analyse des syntänen chromosomalen Abschnitts auf dem kurzen Arm des humanen Chromosoms 11 in der Region 11p15.3 mit den Genen LMO1, TUB und dem orthologen Genomabschnitt der Maus auf Chromosom 7 F2. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführte Kartierung dieser beiden chromosomalen Bereiche ermöglichte die Komplettierung einer genomischen Karte auf insgesamt über eine Megabase, die im Kooperationssequenzierprojekt der Universitäts-Kinderklinik und dem Institut für Molekulargenetik in Mainz erstellt wurde. Mit Hilfe von 28 PAC- und Cosmid-Klonen konnten in dieser Arbeit 383 kb an genomischer DNA des Menschen und mit sechs BAC- und PAC-Klonen 412 kb an genomischer DNA der Maus dargestellt werden. Dies ermöglichte erstmals die exakte Festlegung der Reihenfolge der in diesem chromosomalen Abschnitt enthaltenen Gene und die genaue Kartierung von acht STS-Markern des Menschen, bzw. vier STS-Sonden der Maus. Es zeigte sich dabei, dass die chromosomale Orientierung telomer-/centromerwärts des orthologen Bereichs in der Maus im Vergleich zum Menschen in invertierter Ausrichtung vorliegt. Die Sequenzierung von drei humanen Klonen ermöglichte die Bestimmung von 319.119 bp an zusammenhängender genomischer DNA. Dadurch konnte die genaue Lokalisation und Strukturaufklärung der Gene LMO1, ein putatives Tumorsuppressorgen, das mit der Entstehung von Leukämien assoziiert ist, und TUB, ein Transkriptionsmodulator, der in die Fettstoffwechselregulation involviert ist, vorgenommen werden. Für das murine Genom wurden 412.827 bp an neuer DNA-Sequenz durch Sequenzierung von ebenfalls drei Klonen generiert. Der im Vergleich zum Menschen ca. 100 kb größere Genombereich beinhaltete zudem die neuen Gene Stk33 und Eif3. Es handelte sich dabei um zwei Gene, die erst im Rahmen dieser Arbeit entdeckt und charakterisiert wurden. Die parallele Bearbeitung beider Genombereiche ermöglichte eine umfassende komparative Analyse nach kodierenden, funktionellen und strukturgebenden Sequenzabschnitten in beiden Spezies. Es konnten dabei für beide Organismen die Exon-Intron-Strukturen der Gene LMO1/Lmo1 und TUB/Tub geklärt. Zudem konnten vier neue Exons und zwei neue speziesspezifischer Spleißvarianten für TUB/Tub beschrieben werden. Die Identifizierung dieser neuen Spleißvarianten offenbart neue Möglichkeiten für alternative Regulation und Funktion, oder für eine veränderte Proteinstruktur, die weitere Erklärungsansätze für die Entstehung der mit diesen Genen assoziierten Erkrankungen zulässt. In der sequenzierten, größeren Genomsequenz der Maus konnte in den flankierenden, nicht mit der sequenzierten Humansequenz überlappenden Bereich das neue Gen Eif3 in seiner Exon-Intron-Struktur und die beiden letzten Exons 11 und 12 des Gens Stk33 kartiert und charakterisiert werden. Die umfangreiche Sequenzanalyse beider sequenzierter Genombereiche ergab für den Abschnitt des Menschen insgesamt 229 potentielle Exonsequenzen und für den Bereich der Maus 527 mögliche Exonbereiche. Davon konnten beim Menschen explizit 21 Exons und bei der Maus 31 Exons als exprimierte Bereiche identifiziert und experimentell mittels RT-PCR, bzw. durch cDNA-Sequenzierung verifiziert werden. Diese Abschnitte beschrieben nicht nur die Exonbereiche der oben genannten vier Gene, sondern konnten auch neuen nicht weiter definierten EST-Sequenzen zugeordnet werden. Mittels des Interspeziesvergleiches war darüber hinaus auch die Analyse der nichtkodierenden Intergen-Bereiche möglich. So konnten beispielsweise im ersten Intron des LMO1/Lmo1 sieben Sequenzbereiche mit Konservierungen von ca. 90% bestimmt werden. Auch die Charakterisierung von Promotor- und putativ regulatorischen Sequenzabschnitten konnte mit Hilfe unterschiedlicher bioinformatischer Analyse-Tools durchgeführt werden. Die konservierten Sequenzbereiche der DNA zeigen im Durchschnitt eine Homologie von mehr als 65% auf. Auch die Betrachtung der Genomorganisation zeigte Gemeinsamkeiten, die sich meist nur in ihrer graduellen Ausprägung unterschieden. So weist ein knapp 80 kb großer Bereich proximal zum humanen TUB-Gen einen deutlich erhöhten AT-Gehalt auf, der ebenso im murinen Genom nur in verkürzter Version und schwächer ausgeprägt in Erscheinung tritt. Die zusätzliche Vergleichsanalyse mit einer weiteren Spezies, den orthologen Genomabschnitten von Fugu, zeigte, dass es sich bei den untersuchten Genen LMO1 und TUB um sehr konservierte und evolutiv alte Gene handelt, deren genomisches Organisationsmuster sich auch bei den paralogen Genfamilienmitglieder innerhalb derselben Spezies wiederfindet. Insgesamt konnte durch die Kartierung, Sequenzierung und Analyse eine umfassende Datenbasis für die betrachtete Genomregion und die beschriebenen Gene generiert werden, die für zukünftige Untersuchungen und Fragestellungen wertvolle Informationen bereithält.

Motorisches Lernen in Drosophila melanogaster

In der vorliegenden Arbeit wurden die durch Training induzierten motorischen Gedächtnisleistungen der Taufliege Drosophila melanogaster beim Überklettern von acht symmetrisch verteilten Lücken auf einem rotierenden Ring untersucht. Durch den auf sie einwirkenden optischen Fluss der vorbeiziehenden äußeren Umgebung wurden die Fliegen angeregt, diesem optomotorischen Reiz entgegenzuwirken und die Lücken laufend zu überqueren. Durch Training verbessert und langfristig gelernt wird die kompensatorische Lückenüberquerung X+ gegen die Rotation. In der aus diesem Training erhaltenen Lernkurve war eine überdurchschnittlich hohe Leistungsverbesserung nach einem einzigen Trainingslauf mit einem zeitlichen Bestand von ca. 40 Minuten abzulesen, um danach vom motorischen Gedächtnisspeicher trainierter Fliegen nicht mehr abgerufen werden zu können. Nach einer Ruhephase von einem bis mehreren Tagen wurden die Fliegen auf mögliche Langzeitlernleistungen untersucht und diese für verschiedene Intervalle nachgewiesen. Sowohl die Leistungsverbesserung während des Trainings, als auch der Lerneffekt nach 24h bleiben in mutanten rutabaga2080 sowie rut1 Fliegen aus. Betroffen ist das Gen der Adenylylzyklase I, ein Schlüsselprotein der cAMP-Signalkaskade, die u.a. im olfaktorischen und visuellen Lernen gebraucht wird. Damit ergab sich die Möglichkeit die motorischen Gedächtnisformen durch partielle Rettung zu kartieren. Die motorische Gedächtniskonsolidierung ist schlafabhängig. Wie sich herausstellte, benötigen WTB Fliegen nur eine Dunkelphase von 10h zwischen einem ersten Trainingslauf und einem Testlauf um signifikante Leistungssteigerungen zu erzielen. In weiterführenden Versuchen wurden die Fliegen nachts sowie tagsüber mit einer LED-Lampe oder in einer Dunkelkammer, mit einem Kreisschüttler oder einer Laborwippe depriviert, mit dem Ergebnis, dass nur jene Fliegen ihre Leistung signifikant gegenüber einem ersten Trainingslauf verbessern konnten, welche entweder ausschließlich der Dunkelheit ausgesetzt waren oder welchen die Möglichkeit gegeben wurde, ein Gedächtnis zunächst in einer natürlichen Schlafphase zu konsolidieren (21Uhr bis 7Uhr MEZ). In weiteren Experimenten wurden die experimentellen Bedingungen entweder während des Trainings oder des Tests auf eine Fliege und damit verbunden auf eine erst durch das Training mögliche motorische Gedächtniskonsolidierung einwirken zu können, untersucht. Dazu wurden die Experimentparameter Lückenweite, Rotationsrichtung des Lückenringes, Geschwindigkeit des Lückenringes sowie die Verteilung der acht Lücken auf dem Ring (symmetrisch, asymmetrisch) im Training oder beim Gedächtnisabruf im Testlauf verändert. Aus den Ergebnissen kann geschlussfolgert werden, dass die Lückenweite langzeitkonsolidiert wird, die Rotationsrichtung kurzzeitig abgespeichert wird und die Drehgeschwindigkeit motivierend auf die Fliegen wirkt. Die symmetrische Verteilung der Lücken auf dem Ring dient der Langzeitkonsolidierung und ist als Trainingseingang von hoher Wichtigkeit. Mit Hilfe verschiedener Paradigmen konnten die Leistungsverbesserungen der Fliegen bei Abruf eines Kurz- bzw. Langzeitgedächtnisses hochauflösend betrachtet werden (Transfer). Die Konzentration, mit der eine WTB Fliege eine motorische Aufgabe - die Überquerung von Lücken entgegengesetzt der Rotationsrichtung - durchführt, konnte mit Hilfe von Distraktoreizen bestimmt werden. Wie sich herausstellte, haben Distraktoren einen Einfluss auf die Erfolgsquote einer Überquerung, d.h. mit zunehmender Distraktionsstärke nahm die Wahrscheinlichkeit einer Lückenüberquerung ab. Die Ablenkungsreize wirkten sich weiterhin auf die Vermessung einer Lücke aus, in dem entweder "peering"-artigen Bewegungen im Training durchgeführt wurden oder je nach Reizstärke ausschließlich nur jene Lücken vermessen wurden, welche auch überquert werden sollten.

Neuronale Netzwerke des Zentralkomplexes und ein räumliches Arbeitsgedächtnis von Drosophila melanogaster

Zielgerichtete Orientierung ermöglicht es Lebewesen, überlebenswichtige Aufgaben, wie die Suche nach Ressourcen, Fortpflanzungspartnern und sicheren Plätzen zu bewältigen. Dafür ist es essentiell, die Umgebung sensorisch wahrzunehmen, frühere Erfahrungen zu speichern und wiederabzurufen und diese Informationen zu integrieren und in motorische Aktionen umzusetzen.rnWelche Neuronengruppen vermitteln zielgerichtete Orientierung im Gehirn einer Fliege? Welche sensorischen Informationen sind in einem gegebenen Kontext relevant und wie werden diese Informationen sowie gespeichertes Vorwissen in motorische Aktionen übersetzt? Wo findet im Gehirn der Übergang von der sensorischen Verarbeitung zur motorischen Kontrolle statt? rnDer Zentralkomplex, ein Verbund von vier Neuropilen des Zentralhirns von Drosophila melanogaster, fungiert als Übergang zwischen in den optischen Loben vorverarbeiteten visuellen Informationen und prämotorischem Ausgang. Die Neuropile sind die Protocerebralbrücke, der Fächerförmige Körper, der Ellipsoidkörper und die Noduli. rnIn der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass Fruchtfliegen ein räumliches Arbeitsgedächtnis besitzen. Dieses Gedächtnis kann aktuelle visuelle Information ersetzen, wenn die Sicht auf das Zielobjekt verloren geht. Dies erfordert die sensorische Wahrnehmung von Zielobjekten, die Speicherung der Position, die kontinuierliche Integration von Eigen-und Objektposition, sowie die Umsetzung der sensorischen Information in zielgerichtete Bewegung. Durch konditionale Expression von Tetanus Toxin mittels des GAL4/UAS/GAL80ts Systems konnte gezeigt werden, dass die Ringneurone, welche in den Ellipsoidkörper projizieren, für das Orientierungsgedächtnis notwendig sind. Außerdem konnte gezeigt werden, dass Fliegen, denen die ribosomale Serinkinase S6KII fehlt, die Richtung verlieren, sobald keine Objekte mehr sichtbar sind und, dass die partielle Rettung dieser Kinase ausschließlich in den Ringneuronenklassen R3 und R4d hinreichend ist, um das Gedächtnis wieder herzustellen. Bei dieser Gedächtnisleistung scheint es sich um eine idiothetische Form der Orientierung zu handeln. rn Während das räumliche Arbeitsgedächtnis nach Verschwinden von Objekten relevant ist, wurde in der vorliegende Arbeit auch die Vermittlung zielgerichteter Bewegung auf sichtbare Objekte untersucht. Dabei wurde die zentrale Frage bearbeitet, welche Neuronengruppen visuelle Orientierung vermitteln. Anhand von Gehirnstrukturmutanten konnte gezeigt werden, dass eine intakte Protocerebralbrücke notwendig ist, um Laufgeschwindigkeit, Laufaktivität und Zielgenauigkeit bei der Ansteuerung visueller Stimuli korrekt zu vermitteln. Dabei scheint das Horizontale Fasersystem, welches von der Protocerebralbrücke über den Fächerförmigen Körper auf den Zentralkomplex assoziierte Neuropile, die Ventralkörper, projiziert, notwendig für die lokomotorische Kontrolle und die zielgenaue Bewegung zu sein. Letzeres konnte zum einen durch Blockade der synaptischen Transmission anhand konditionaler Tetanus Toxin Expression mittels des GAL4/UAS/GAL80ts Systems im Horizontalen Fasersystem gezeigt werden;. zum anderen auch durch partielle Rettung der in den Strukturmutanten betroffenen Gene. rn Den aktuellen Ergebnissen und früheren Studien folgend, ergibt sich dabei ein Modell, wie zielgerichtete Bewegung auf visuelle Stimuli neuronal vermittelt werden könnte. Nach diesem Modell bildet die Protocerebralbrücke die Azimuthpositionen von Objekten ab und das Horizontale Fasersystem vermittelt die entsprechende lokomotorische Wo-Information für zielgerichtete Bewegungen. Die Eigenposition in Relation zum Zielobjekt wird über die Ringneurone und den Ellipsoidkörper vermittelt. Wenn das Objekt aus der Sicht verschwindet, kann die Relativposition ideothetisch ermittelt werden und integriert werden mit Vorinformation über das Zielobjekt, die im Fächerförmigen Körper abgelegt ist (Was-Information). Die resultierenden Informationen könnten dann über das Horizontale Fasersystem in den Ventralkörpern auf absteigende Neurone gelangen und in den Thorax zu den motorischen Zentren weitergeleitet werden.rn

Ein räumliches Orientierungsgedächtnis im Zentralkomplex von Drosophila melanogaster und die spezifische Rolle von ellipsoid-body-open

In der vorliegenden Arbeit wurden zwei Strukturmutationslinien von Drosophila melanogaster, grf und ebo, hinsichtlich ihres Lauf- und Orientierungsverhaltens im Buridanschen sowie im Detour-Paradigma untersucht. Als Kernthema der Arbeit entwickelte sich rasch die molekulare Analyse von ebo in Bezug auf das räumliche Orientierungsgedächtnis, da ebo-mutante Fliegen Letzteres nicht zeigen. Durch Wiederherstellen der EBO-Funktion kann der Verhaltensphänotyp der ebo-Mutante in jeder Ringneuronengruppe des Ellipsoidkörpers gerettet werden, jedoch nicht der Strukturdefekt. Zudem wird zur Ausbildung des Orientierungsgedächtnisses EBO nicht während der Entwicklung, sondern akut benötigt. Aufgrund der Tatsache, dass ebo für das nukleäre Protein Exportin6 codiert, und selbiges für den Export von Aktin-Profilin-Komplexen aus dem Zellkern verantwortlich ist (STÜVEN ET AL., 2003), zeigen ebo-Tiere nukleäre Aktin-Akkumulationen sowohl während der Entwicklung in Speicheldrüsen als auch im adulten Gehirn, was mittels Expression eines Actin::GFP-Fusionsproteins gezeigt wurde. Die genetischen Interaktionsexperimente zeigen, dass der anatomische Defekt von ebo durch eine reduzierte Aktin-Polymerisation erfolgt, für den Verhaltensphänotyp jedoch die Aktin-Anreicherung in den Zellkernen von Ringneuronen des Ellipsoidkörpers ursächlich ist. Die erstaunliche Redundanz der Ringneurone in Bezug auf die Rettung des Verhaltensphänotyps legt nahe, dass diffusible Faktoren eine wichtige Rolle für die Ausbildung eines Orientierungsgedächtnisses spielen. Bezüglich dieser Hypothese konnte nachgeweisen werden, dass durch FMRFamid-RNAi in R2- und R4-Ringneuronen des Ellipsoidkörpers das Orientierungsgedächtnis zerstört wird. Eine daraufhin durchgeführte Antikörperfärbung gegen pro-FMRFa in wildtypischen und ebo-mutanten Gehirnen ergab jedoch keine Verschiedenheit die Menge oder Lokalisation betreffend. Die bei ebo vorhandene Anreicherung von Aktin im Zellkern bewirkt, dass die Aktin-Monomere im Nucleus an den Cofaktor dMRTF (Mrtf) binden und diesen somit inaktivieren. Dadurch kann der Transkriptionsfaktor dSRF (bs) nicht mehr durch dMRTF aktiviert werden, was den Orientierungsgedächtnis-Verlust bewirkt. Da es jedoch unwahrscheinlich ist, dass ein Gedächtnis, welches nur wenige Sekunden andauert, von Transkriptionsregulation abhängt, könnte dSRF auch die Genexpression von Molekülen, die schnelle Veränderungen synaptischer Transmission der Ringneurone vermitteln, modulieren. Für die Zukunft wäre es demnach von enormer Bedeutung, weitere Zielgene von dSRF aufzuklären und zu analysieren.

Der Einfluss des Angiotensin-II-Typ-2-Agonisten Compound 21 auf den neuronalen Schaden bei der Maus nach traumatischer Hirnläsion mittels Controlled Cortical Impact

Die Beeinflussung des sekundären Hirnschadens nach SHT ist Hauptansatzpunkt der klinischen Therapie. Gleichzeitig sind die zugrunde liegenden Mechanismen zum Großteil unklar und Gegenstand aktueller Forschung. In verschiedenen Studien scheint sich das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System als Teil der Pathophysiologie bei der Entstehung des sekundären Hirnschadens und der neuronalen Inflammation nach SHT herauszukristallisieren. Der Fokus richtet sich mitunter auf den AT2- Rezeptor, dessen protektive Wirkung in verschiedensten Ischämiemodellen und Geweben gezeigt werden konnte.rnIn der vorliegenden Promotionsarbeit wurde erstmalig die Wirkung einer AT2- Stimulation auf histologische, inflammatorische und neuromotorische Parameter nach CCI untersucht. Eine neuroprotektive Wirkung der AT2-Stimulation konnte dabei nicht nachgewiesen werden. Es kam weder zu einer Beeinflussung histologischer noch neuromotorischer Parameter, allerdings scheint der AT2-Agonist C21 bei einer Dosierung von 0,03 mg/kg KG zu einer Stimulation der inflammatorischen Reaktion zu führen.

Mechanismen der Aktivierung und Detoxifizierung von Aflatoxin B 1 in verschiedenen Leberzelltypen von Ratten, Mäusen und Waldmurmeltieren

Zusammenfassung: Die Applikation des Mykotoxins Aflatoxin B1 (AFB1) führt in der Ratte zu Lebertumoren hepatozellulären Ursprungs, während bisher keine transformierende Wirkung dieses Mykotoxins auf Kupffer- und Endothelzellen (Nichtparenchymzellen, NPC) nachgewiesen werden konnte. Diese Resistenzmechanismen der NPC gegenüber AFB1 wurden im ersten Teil dieser Arbeit untersucht. AFB1 ist per se inaktiv, wird jedoch durch Verstoffwechselung in den chemisch reaktiven, an DNA bindenden Metaboliten AFB1-8,9-Epoxid überführt. Daneben stellt die enzymatische Hydroxylierung von AFB1 am Kohlenstoff-9a zum Aflatoxin M1 eine Detoxifizierung dar. Durch HPLC-Analyse der AFB1-Metabolite konnte gezeigt werden, daß in Nichtparenchymzellen (NPC) das Verhältnis von 9a-Hydroxylierung zu 8,9-Epoxidierung höher als in Parenchymzellen (PC) ist. Die AFB1-9a-hydroxylase fördert insbesondere in den NPC der Leber die Bildung des weniger gentoxischen Metaboliten AFM1 und konkurriert daher um die Aktivierung von AFB1 zum mutagenen und kanzerogenen 8,9-Epoxid. Dieser metabolische Unterschied scheint also einen Beitrag zur Resistenz der NPC der Leber gegenüber der hepatokanzerogenen Wirkung von AFB1 zu leisten. Da ein Synergismus zwischen der AFB1-Exposition und einer Infektion mit dem Hepatitis B-Virus (HBV) beim Menschen bezüglich des Auftretens von hepatozellulären Karzinomen zu bestehen scheint, wurde im zweiten Teil dieser Arbeit untersucht, ob die metabolische Aktivierung von AFB1 durch eine HBV-Infektion verstärkt wird. In einem Vergleich der Biotransformation von AFB1 mit mikrosomalen Leberfraktionen von transgenen HBV-Mäusen und Kontrollmäusen wurde keine signifikanten Unterschiede festgestellt. Dagegen wurde bei Virus-infizierten Waldmurmeltieren eine deutlich reduzierte Bildung des AFB1-8,9-Epoxids beobachtet. Es konnte z.T. ein Zusammenhang zwischen den verschiedenen Stadien der Leberschädigung und den Metabolismusraten festgestellt werden, wobei die metabolische Aktivierung mit zunehmender Leberschädigung abzunehmen scheint. Auch hinsichtlich der Aktivitäten verschiedener Cytochrom P450 abhängiger Monooxygenasen wurde eine weitgehende Übereinstimmung mit den durch HPLC ermittelten Metabolitenprofilen des AFB1 beobachtet. Diese Studien mit subzellulären Leberfraktion der transgenen HBV-Mäusen und der Waldmurmeltieren zeigen, daß die Interaktion zwischen Hepatitis und AFB1 nicht mit der verstärkten metabolischer Aktivierung von AFB1 zu erklären ist. TGF-ß1, aus der Gruppe der Cytokine, wird als Mediator bei Entzündungsprozessen in der Leber so z.B. im Verlauf einer Virushepatitis freigesetzt. Aufgrund der besonderen Bedeutung des murinen CYP2A5 (ortholog zum humanen CYP2A6) bei der Aktivierung von AFB1 wurde der Einfluß von TGF-ß1 auf CYP2A5 in Primärkulturen von Maushepatozyten untersucht. Durch Messung der Aktivität der Cumarin-7-hydroxylase sowie durch Bestimmung der Proteinmenge von CYP2A5 mittels Western Blotting konnte zunächst die Induzierbarkeit des CYP2A5-Isoenzyms durch Phenobarbital in kultivierten Hepatozyten der Maus gezeigt werden. Nur bei einer niedrigen TGF-ß1-Konzentration wurde eine leicht erhöhte Expression von CYP2A5 festgestellt, ansonsten führte die Behandlung der kultivierten Maushepatozyten mit TGF-ß1 zu einer dosisabhängigen Verminderung der Expression von CYP2A5.

Generierung und Transduktion wachstumsnegativer Signale durch den Contactinhibin-Rezeptor

Generierung und Transduktion wachstumsnegativer Signale durch den Contactinhibin-RezeptorDie kontaktabhängige Wachstumshemmung, Kontaktinhibition, basierend auf der Interaktion von Contactinhibin (Ci) und seinem Rezeptor (CiR), reguliert das Zellwachstum. Ziel dieser Arbeit war die Aufklärung der Signalweiterleitung über den CiR.Der transformierende Wachstumsfaktor TGF-beta führt in den meisten Zelltypen wie die Kontaktinhibition zum Zellzyklusstopp in der G1-Phase. Um mögliche Interaktionen der beiden Signalkaskaden zu untersuchen, wurden humane Keratinozyten (HaCaT) mit einem dominant-negativen TGF-beta-Rezeptor Typ II stabil transfiziert. Das Ausschalten des TGF-beta-Signalweges resultierte in einer erhöhten Sättigungsdichte und Aufhebung der Kontaktinhibition. Die durch Kontaktinhibition induzierte Zunahme der Expression der TGF-beta-mRNA bestätigte die mögliche Interaktion der beiden Signalwege.In einem weiteren Ansatz sollte die Proteinkinase C (PKC) als möglicher Second Messenger der Kontaktinhibition untersucht werden. Die Herunterregulierung der PKC-Isoformen alpha, delta, epsilon und mu nach Langzeit-Behandlung mit 12-O-Tetradecanoylphorbol-13-acetat führte in humanen Fibroblasten (FH109) zu einer Reduktion der Kontaktinhibition. Nur durch Inkubation mit dem spezifischen Inhibitor der delta-Isoform Rottlerin konnte die Kontaktinhibition vollständig aufgehoben werden. Eine Beteiligung der PKC-delta in die Kontaktinhibition wurde dadurch bestätigt, daß sowohl die Stärke ihrer Proteinexpression als auch ihre intrazelluläre Verteilung über Zell-Zellkontakte reguliert wurde. Außerdem führte die transiente Transfektion von Maus-Fibroblasten, NIH3T3, mit einer dominant-negativen Mutante der PKC-delta zu einem transformierten Phänotyp.

Molekulargenetische Untersuchungen von Komponenten des Knorpel-, Knochengewebes

Die Skelettentwicklung wird von zahlreichen genetischen Faktoren gesteuert, die bei Fehlfunktion Ursache unterschiedlichster Erkrankungen des Knorpel-/Knochengewebes sein können. Die Untersuchung von bekannten Kandidatengenen (FGFR3) sowie der Versuch der Identifizierung und Charakterisierung neuer Kandidatengene, ist Inhalt der vorliegenden Arbeit. Das humane FGFR3-Gen stellt ein bekanntes Kandidatengen dar, das bei Veränderungen zu einem Spektrum an Erkrankungen führt (Skelettentwicklungsstörungen, Kleinwuchsformen, nicht-syndromatische Kraniosynostosen, Tumorerkrankungen). Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte die vollständige genomische Struktur des FGFR3-Gens aufgeklärt wurde. Hierdurch konnte ein Set von Primern generiert werden, mit dem die genomische Mutationsanalyse des kompletten FGFR3-Gens möglich war. Die Anwendung dieser umfassenden FGFR3-Diagnostik erbrachte den ersten Nachweis einer HCH-Mutation bei einer Patientin mit Hypochondroplasie (HCH) in der extrazellulären Domäne des FGFR3-Gens. Durch Computer-simulierte Strukturanalyse konnte gezeigt werden, dass die Sekundär- bzw. Tertiärstruktur dieses FGF-Rezeptors durch die Mutation mit großer Wahrscheinlichkeit nicht krankheitsverursachend verändert wird. Die Mutation betrifft jedoch eine mögliche funktionell wichtige N-Glykosylierungsstelle des Rezeptors, was den phänotypischen Effekt der Mutation erklären könnte. In der vorliegenden Arbeit wurde außerdem das Expressionsmuster der zwei bekannten Spleißvarianten (IIIb und IIIc) des Ffgfr3-Gens detailliert untersucht. Anhand von Mausschnitten unterschiedlicher Entwicklungsstadien konnte nachgewiesen werden, dass die IIIc-Variante bei der Maus in erster Linie in Knorpel-/Knochengewebe exprimiert wird, während sich die IIIb-Variante ausschließlich auf epitheliale Strukturen beschränkt. Zur Evaluierung systematischer Ansätze zur Isolation neuer knorpelspezifischer Gene wurden in einer ersten umfassenden Serie - ausgehend von einer humanen fetalen Chondrozyten-cDNA-Bank - die Möglichkeiten eines Knorpel-/Knochen-EST-Projekts untersucht und beurteilt. Die ermittelten Ergebnisse zeigen, dass 5% der untersuchten EST-Klone neue, möglicherweise knorpelspezifische Gene darstellen. Die Ergebnisse sind ein deutlicher Hinweis darauf, dass die verwendete cDNA-Bank zur Isolierung neuer, möglicherweise knorpelspezifischer Gene geeignet ist. Diese Einschätzung wurde dadurch unterstützt, dass ein Klon isoliert und charakterisiert wurde, der im Verlauf der Arbeit als Msx2-interagierender Faktor (MINT) publiziert wurde und in der Knorpel-/Knochen-Entwicklung eine wichtige Rolle spielt.In einem zweiten Versuchsansatz wurde die von Velculescu et al. (1995) veröffentliche SAGE ('serial analysis of gene expression')-Methode - ausgehend von RNA einer humanen Chondrosarkom-Zelllinie - etabliert. Die relativ aufwendige Technik konnte erfolgreich durchgeführt werden. Die Auswertung ergab, dass auch die bei dieser Versuchsreihe verwendete Strategie die Möglichkeit eröffnet, systematisch gewebsspezifische Gene zu isolieren.

Molekulare Untersuchung des Wolf-Hirschhorn-Syndroms

Das Wolf-Hirschhorn-Syndrom (WHS) ist ein komplexes und variables Fehlbildungs- Retardierungssyndrom, das durch Deletion in der distalen Chromosomenregion 4p16.3 hervorgerufen wird und dessen Ätiologie und Pathogenese bisher weitgehend unverstanden sind. Die Zielsetzung in der vorliegenden Arbeit bestand in der Identifizierung und vorläufigen Charakterisierung neuer Gene, die an der Entstehung des Syndroms beteiligt sein könnten. Die Wolf-Hirschhorn-Syndrom-kritische Region (WHSCR) konnte zu Beginn der vorliegenden Arbeit auf einen ca. 2 Mb großen Bereich zwischen den Markern D4S43 und D4S142 eingegrenzt werden. Für die Identifizierung neuer Gene wurden zunächst drei größere genomische Cosmid-/PAC-Contigs (I-III) im Bereich der Marker D4S114 bis D4S142 erstellt und mittels Exonamplifikation auf transkribierte Bereiche (Exons) untersucht. Es konnten insgesamt 67 putative 'Exons' isoliert werden, von denen einige bereits bekannten Genen (ZNF141, PDEB, MYL5, GAK, DAGK4 und FGFR3) entsprechen. Zwei dieser Gene konnten im Rahmen dieser Arbeit erstmals (DAGK4) bzw. genauer (GAK) in die distale Region 4p16.3 kartiert werden. Die restlichen Exons können aufgrund von Homologievergleichen und/oder EST-cDNA-Homologien vermutlich neuen Genen oder auch Pseudogenen (z. B. YWEE1hu) zugeordnet werden. Durch die im Verlaufe der vorliegenden Arbeit publizierte weitere Eingrenzung der WHSCR auf einen 165 Kb-großen Bereich proximal des FGFR3-Gens konzentrierten sich weitere Untersuchungen auf die detaillierte Analyse der WHSCR zwischen dem Marker D4S43 und FGFR3. Mit Hilfe von Exonamplifikation bzw. computergestützter Auswertung vorliegender Sequenzdaten aus diesem Bereich ('GRAIL', 'GENSCAN' und Homologievergleiche in den EST-Datenbanken des NCBI) konnten mehrere neue Gene identifiziert werden. In distaler-proximaler Reihenfolge handelt es sich dabei um die Gene LETM1, 51, 43, 45, 57 und POL4P. LETM1 kodiert für ein putatives Transmembran-Protein mit einem Leucin-Zipper- und zwei EF-Hand-Motiven und könnte aufgrund seiner möglichen Beteiligung an der Ca2+-Homeostase und/oder der Signal-transduktion zu Merkmalen des WHS (Krampfanfällen, mentale Retardierung und muskuläre Hypotonie) beitragen. Das Gen 51 entspricht einem in etwa zeitgleich durch Stec et al. (1998) und Chesi et al. (1998) als WHSC1 bzw. MMSET bezeichnetem Gen und wurde daher nicht weiter charakterisiert. Es wird genauso wie das Gen 43, das zeitgleich von Wright et al. (1999b) als WHSC2 beschrieben werden konnte und eine mögliche Rolle bei der Transkriptionselongation spielt, ubiquitär exprimiert. Das in der vorliegenden Arbeit identifizierte Gen 45 zeigt demgegenüber ein ausgesprochen spezifisches Expressionsmuster (in Nervenzellen des Gehirns sowie in Spermatiden). Dies stellt zusammen mit der strukturellen Ähnlichkeit des putativen Genprodukts zu Signalmolekülen einen interessanten Zusammenhang zu Merkmalen des WHS (beispielsweise Kryptorchismus, Uterusfehlbildungen oder auch neurologische Defekte) her. Demgegenüber handelt es sich bei dem Gen 57 möglicherweise um ein trunkiertes Pseudogen des eRFS-Gens auf Chromosom 6q24 (Wallrapp et al., 1998). Das POL4P-Gen schließlich stellt allein aufgrund seiner genomischen Lokalisation sowie seiner möglichen Funktion (als DNA-Polymerase-ähnliches Gen) kein gutes Kandidatengen für spezifische Merkmale des Syndroms dar und wurde daher nicht im Detail charakterisiert. Um die Beteiligung der Gene an der Ätiologie und Pathogenese des Syndroms zu verstehen, ist die Entwicklung eines Mausmodells (über das Einfügen gezielter Deletionen in das Mausgenom) geplant. Um dies zu ermöglichen, wurde in der vorliegenden Arbeit die Charakterisierung der orthologen Region bei der Maus vorgenommen. Zunächst wurden die orthologen Gene der Maus (Letm1, Whsc1, Gen 43 (Whsc2h), Gen 45 und Pol4p) identifiziert. Durch die Erstellung sowie die genaue Kartierung eines murinen genomischen P1/PAC-Klon-Contigs konnte gezeigt werden, daß die murinen Gene Fgfr3, Letm1, Whsc1, Gen 43 (Whsc2h), Gen 45 und Pol4p sowie einige weitere der überprüften EST-cDNA-Klone der Maus in einem durchgehenden Syntänieblock zwischen Mensch (POL4P bis FGFR3) und Maus (Mmu 5.20) enthalten sind, der in seiner genomischen Ausdehnung in etwa den Verhältnissen beim Menschen (zwischen POL4P und FGFR3) entspricht.

Ansatz zur Etablierung von konditional/reversiblen knock-out Mäusen für das zellspezifische T-Zell Onkogen SCL

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, ein innovatives System zur Herstellung einer konditional/reversiblen SCL-knock-out Maus zu etablieren. Es wurde deshalb ein neuer knock-in/knock-out Ansatz mit Hilfe des Tet-Systems gewählt. Im Rahmen dieser Arbeit war es möglich für die Generierung der konditionalen SCL-knock-out Maus essentielle Effektor- und Respondermauslinien zu etablieren und zu charakterisieren. Durch knock-in der rtTA-cDNA in den SCL-Lokus wurde eine Effektormauslinie hergestellt, welche in allen untersuchten hämatopoietischen Geweben rtTA exprimierte.Die zur Generierung der SCL-knock-out Maus notwendigen transgenen Responderlinien wurden ebenfalls generiert. Diese Linien wurden in einem Funktionsassay auf ihre Regulierbarkeit rekombinanter SCL-Expression untersucht. Dabei wurde eine Linie identifiziert, welche stringent/exogen regulierbar war.Effektor- und Responderlinie konnten etabliert und durch adäquate Kreuzung eine heterozygote Effektor/Responderlinie generiert werden. Die Rückkreuzung dieser Linie bei gleichzeitiger Gabe von DOX sollte in der konditionalen/reversiblen SCL-knock-out Maus resultieren. Bei Ende dieser Arbeit wurde allerdings in keinem Fall ein Rescue des letalen SCL Nullhintergrunds durch die rtTA-vermittelte rekombinante SCL-Expression beobachtet. Die in dieser Arbeit bereits hergestellten und verbesserten neuen Effektorkonstrukte sowie das Zurückgreifen auf alle vorhandenen SCL-Respondermäuse können in Zukunft zur erfolgreichen Etablierung eines exogen regulierbaren konditional/reversiblen SCL knock-out führen.

Wiederherstellung einer physiologischen Blutzuckerregelung durch Xenotransplantation mikroenkapsulierter Langerhans-Inseln in zwei diabetische Mausmodelle

Wiederherstellung einer physiologischen Blutzuckerregelung durch Xenotransplantation mikroenkapsulierter Langerhans-Inseln in zwei diabetische Maus-modelle. Die Inseltransplantation ist ein vielversprechendes Verfahren zur Behandlung des Typ 1 Diabetes. Das Verfah-ren ist nicht invasiv, erfordert jedoch eine lebenslange Immunsuppression der Patienten. Zudem sind nur be-grenzte Spenderorgane verfügbar. Es wäre ein großer Fortschritt, wenn man transplantierte Inseln im Empfänger von dessen Immunsystem abschirmen könnte. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass es möglich ist, funktionsfähige Inseln von Ratten in Alginatkügelchen (Beads) einzuschließen und in dieser Form in diabetische Mäuse zu trans-plantieren. Mit dem ultrahochviskosem Alginat stand erstmals ein speziell für die klinische Anwendung konzipiertes und hergestelltes Alginat zur Verfügung. Im Gegensatz zu den kommerziell erhältlichen Alginaten konnte dieses Al-ginat in hoher Reinheit reproduzierbar produziert werden. Zudem war es erstmals möglich, durch eine interne Kapselstabilisierung auf die bislang benötigte, äußere Stützmembran zu verzichten. Ziel der Arbeit war es, das ultrahochviskose Alginat und das neue „thermodynamisch-stabilisierte“ Verkapse-lungssystem für die Transplantation der Langerhans-Inseln zu optimieren. In der anschließenden Studie sollten verkapselte Inseln von Ratten in zwei Typen diabetische Mäuse transplantiert werden und Tauglichkeit des Ver-fahren in vivo geprüft werden. In vitro wurden die Parameter (insbesondere die Alginatkonzentration) zur Verkapselung der Langerhans-Inseln optimiert. Die Vitalität (Überleben der Inseln) und die Funktionalität (Sekretion von Insulin) des enkapsulierten Gewebes dienten zur Bewertung der Verkapselungsmethode. Die Zugabe von humanem Serumalbumin führte sowohl zur Langzeitstabilisierung der Alginatbeads als auch zur Verbesserung der Nährstoffversorgung des enkapsulierten Gewebes. Durch Transplantationen von Leerkapseln mit verschiedenen Albumin-Konzentrationen wurde die benötigte Albumin-Supplementation bestimmt. Als Empfänger dienten Streptozotozin-diabetische Balb/c- und spontan diabetische NOD-Mäuse. Die intraperitoneale Transplantation von 1.800 mikroenkapsulierten, adulten Ratteninseln bewirkten in Streptozotozin-diabetischen Balb/c-Mäusen eine langanhaltende (>30 Wochen) Normalisierung des Blutzuckerspiegels. Die Glucose-Clearance-Raten des intraperitonealen-Glucose-Toleranz-Tests in der 3., 9. und 16. Woche zeigten aber einen sukzes-siven Verlust der Transplantatfunktion, der aber in den „non fasting“ Blutzuckerwerten nicht evident wurde. Der Diabetes der NOD-Maus wird durch eine autoimmunogene Zerstörung der ß-Zellen durch ein hyperkompe-tentes Immunsystem ausgelöst, da die NOD-Tiere schon auf ß-zellspezifische Antigene konditioniert waren. Auch hier führte die Alginatkapsel zu einem deutlich verlängerten Überleben des Transplantates im Vergleich zu den unverkapselten Kontrollzellen. Jedoch trat dann nach 4-5 Wochen ein spontanes Transplantatversagen auf. Konventionell polymerisierte Kapseln zeigten inhomogene Vernetzungen des Alginates. Dies führte mit zunehmender Transplantationsdauer zu Instabilitäten der Alginatbeads, so dass schließlich Inselgewebe oder ß-Zell-spezifische Antigene frei wurden. Diese Antigene induzierten im hyperkompetenten Immunsystem der NOD-Mäuse eine massive Abwehrreaktion mit rascher Zerstörung der transplantierten Inseln. Im Rahmen der Weiterentwicklung der Verkapselungstechnik konnte mit Hilfe der neuen „Crystal Gun Verkap-selung“ erstmals eine homogene Vernetzung des gesamten Alginatbeads sichergestellt werden. Gegen Ende die-ser Arbeit konnte bei einer dreiwöchigen Kultur in vitro gezeigt werden, dass das „Crystal Gun Verfahren“ zur Mikroenkapsulierung von Langerhans-Inseln geeignet ist. Daher ist zu erwarten, dass mit Hilfe des „Crystal Gun Verfahrens“ auch ein Durchbruch bei der Transplantation von Inseln in NOD-Mäusen zu erreichen sein wird.

Comparative genomic sequencing analysis of a region in human chromosome 11p15.3, mouse chromosome 7 and analysis of the novel STK33, Stk33 gene

The comparative genomic sequence analysis of a region in human chromosome 11p15.3 and its homologous segment in mouse chromosome 7 between ST5 and LMO1 genes has been performed. 158,201 bases were sequenced in the mouse and compared with the syntenic region in human, partially available in the public databases. The analysed region exhibits the typical eukaryotic genomic structure and compared with the close neighbouring regions, strikingly reflexes the mosaic pattern distribution of (G+C) and repeats content despites its relative short size. Within this region the novel gene STK33 was discovered (Stk33 in the mouse), that codes for a serine/threonine kinase. The finding of this gene constitutes an excellent example of the strength of the comparative sequencing approach. Poor gene-predictions in the mouse genomic sequence were corrected and improved by the comparison with the unordered data from the human genomic sequence publicly available. Phylogenetical analysis suggests that STK33 belongs to the calcium/calmodulin-dependent protein kinases group and seems to be a novelty in the chordate lineage. The gene, as a whole, seems to evolve under purifying selection whereas some regions appear to be under strong positive selection. Both human and mouse versions of serine/threonine kinase 33, consists of seventeen exons highly conserved in the coding regions, particularly in those coding for the core protein kinase domain. Also the exon/intron structure in the coding regions of the gene is conserved between human and mouse. The existence and functionality of the gene is supported by the presence of entries in the EST databases and was in vivo fully confirmed by isolating specific transcripts from human uterus total RNA and from several mouse tissues. Strong evidence for alternative splicing was found, which may result in tissue-specific starting points of transcription and in some extent, different protein N-termini. RT-PCR and hybridisation experiments suggest that STK33/Stk33 is differentially expressed in a few tissues and in relative low levels. STK33 has been shown to be reproducibly down-regulated in tumor tissues, particularly in ovarian tumors. RNA in-situ hybridisation experiments using mouse Stk33-specific probes showed expression in dividing cells from lung and germinal epithelium and possibly also in macrophages from kidney and lungs. Preliminary experimentation with antibodies designed in this work, performed in parallel to the preparation of this manuscript, seems to confirm this expression pattern. The fact that the chromosomal region 11p15 in which STK33 is located may be associated with several human diseases including tumor development, suggest further investigation is necessary to establish the role of STK33 in human health.

Genomische Struktur und Promotorcharakterisierung des humanen ADAM10-Gens

Das ADAM10-Gen kodiert für eine membrangebundene Disintegrin-Metalloproteinase, die das Amyloidvorläuferprotein spaltet. Im Mausmodell konnte bewiesen werden, dass die Überexpression von ADAM10 die Plaquebildung vermindern und das Langzeitgedächtnis verbessert. Aus diesem Grund ist es für einen möglichen Therapieansatz für die Alzheimer’sche Erkrankung erforderlich, die Organisation des humanen ADAM10-Gens und seines Promotors aufzuklären. Beim Vergleich der genomischen Sequenzen von humanem und murinem ADAM10 zeigte sich eine hohe Übereinstimmung. Beide Gene umfassen 160 kbp und bestehen aus 16 Exons. Die ersten 500 bp stromaufwärts vom Translationsstartpunkt zwischen dem Menschen, der Maus und der Ratte sind hoch konserviert. Diese Region beinhaltet spezifische regulatorische Elemente, die die ADAM10-Transkription modulieren. In den ersten 2179 bp stromaufwärts vom humanen ADAM10-Translationsstartpunkt fanden sich einige potentiellen Transkriptionsfaktor-bindungsstellen (Brn-2, SREBP, Oct-1, Creb1/cJun, USF, Maz, MZF-1, NFkB und CDPCR3HD). Es wurde eine charakteristische GC-Box und eine CAAT-Box, aber keine TATA-Box identifiziert. Nach Klonierung dieser 2179 bp großen Region wurde eine starke Promotoraktivität, insbesondere in neuronalen Zelllinien, gefunden. Bei der Analyse von Deletionskonstrukten wurde die Region zwischen -508 und -300 als essentiell für die Transkriptionsaktivierung bestimmt. Die Promotoraktivität wird zudem streng herunterreguliert, wenn in die Region 317 bp stromaufwärts vom Startpunkt der Translation eine Punktmutation eingeführt wird. Diese per Computeranalyse als USF-Bindungsstelle deklarierte Region spielt eine zentrale Rolle bei der ADAM10-Transkription. Im EMSA wurde eine Protein-DNA-Interaktion für diese Region gezeigt. Durch transienten Transfektionen in Schneider Drosophila Insektenzellen konnte nachgewiesen werden, dass die Überexpression von Sp1 und USp3 für die ADAM10-Promotoraktivität entscheidend ist. In EMSA-Studien bestätigte sich eine Protein-DNA-Interaktion für die Region -366 bp stromaufwärts vom Translationsstartpunkt. Die Punktmutation in der CAAT-Box veränderte die die Promotoraktivität nicht. Da weiterhin für diese potentielle Bindungsstelle kein Bindungsfaktor vorausgesagt wurde, scheint die CAAT-Box keine Bedeutung bei der Promotorregulation zu spielen. Schließlich fand sich im EMSA eine Protein-DNA-Interaktion für die Bindungsstelle 203 bp stromaufwärts vom Translationsstartpunkt. Diese in Computeranalysen als RXR-Bindungsstelle identifizierte Region ist ebenfalls von Bedeutung in der Promotorregulation. Auf der Suche nach Substanzen, die die ADAM10-Promotoraktivität beeinflussen, wurde ein negativer Effekt durch die apoptoseauslösende Substanz Camptothecin und ein positiver Effekt durch die zelldifferenzierungsauslösende Substanz all-trans Retinsäure festgestellt. Mit dieser Arbeit wurde die genomische Organisation des ADAM10-Gens zusammen mit dem zugehörigen Promotor aufgeklärt und ein neuer Regulationsmechanismus für die Hochregulation der Expression der alpha-Sekretase ADAM10 gefunden. Im Weiteren sollen nun die genauen Mechanismen bei der Hochregulation der alpha-Sekretase ADAM10 durch Retinsäure untersucht und durch Mikroarray-Analysen an RNA-Proben transgener Mäuse, welche ADAM10 überexpremieren, neue therapeutische Ansätze zur Behandlung der Alzheimer´schen Erkrankung identifiziert werden.