Biofunktionalisierung oxidischer Titanoberflächen über eine spezifische Anbindung von biotinyliertem Fibronektin für die medizinische Anwendung

In der hier vorliegenden Dissertation wird die Entwicklung und Charakterisierung einer biomimetischen Beschichtung für Titanimplantatoberflächen, insbesondere Dentalimplantate, beschrieben. Ziel war es, die Adhäsion und Aktivität von Osteoblasten auf Titanoberflächen zu steigern und so eine Beschleunigung der Implantatintegration in das Knochengewebe zu erreichen. Hierfür wurde eine spezielle Art der biomimetischen Beschichtung entwickelt, bei der biotinyliertes Fibronektin (bFn) über Streptavidin auf eine biotinylierte TiOX-Modelloberfläche immobilisiert wurde. Die Biotinmodifizierung der TiOX-Oberfläche erfolgte hierbei über einen „Self-Assembly-Prozess“ durch sequenzielle Chemiesorption von N-(6-aminohexyl)aminopropyltrimethoxysilan sowie verschiedenen Sulfo-NHS-Biotin-Derivaten, welche den Aufbau einer Streptavidin-Monolage ermöglichten. Als ein wichtiges Resultat zeigte sich, dass die Streptavidin-Monolage effektiv die unspezifische Adsorption von Proteinen an die TiOX-Oberfläche unterbindet und hierdurch die Adhäsion von Osteoblasten auf dieser unterdrückt. Dies hat den Vorteil, dass auf eine antiadhäsive Basisbeschichtung, welche für eine spezifische Zellreaktion wichtig ist, verzichtet werden kann. Dieses osteoblastere Adhäsionsverhalten änderte sich signifikant nach Anbindung von bFn an die Streptavidin-Monolage, mit dem Ergebnis, einer drastischen Steigerung der Osteoblastenadhäsion. Weiterhin besaßen Osteoblasten auf diesen Oberflächen ein Proteinexpressionsmuster, das auf eine erhöhte Osteoinduktion schließen lässt. Es zeigte sich darüber hinaus eine verstärkte Zelladhäsion sowie eine Steigerung des osteoinduktiven Effekts auf Substraten, bei denen bFn über eine Streptavidin-Monolage immobilisiert wurde, gegenüber mit nativem Fibronektin (Fn) modifizierten TiOX-Oberflächen. Ein wesentlicher Schwerpunkt bestand daher in der Analyse der Zusammensetzung und Struktur der biomimetischen Beschichtung über „Surface Plasmon Spectroscopy“ und „Atomic Force Microscopy“. Diese ergab, dass bFn und natives Fn auf den jeweiligen Oberflächen eine unterschiedliche Konformation einnimmt. Im Gegensatz zu nativem Fn, das bei der Adsorption unter physiologischen Bedingungen auf TiOX-Oberflächen eine kompakte Konformation besitzt, nimmt bFn auf einer Streptavidin-Monolage eine entfaltete Konformation ein. Bei letzterer handelt es sich um dieselbe, welche Fn in vivo innerhalb der extrazellulären Matrix besitzt. Sie unterscheidet sich von der kompakten Fn-Konformation dahingehend, dass entlang der Fn-Achse weitere Proteinbindestellen zugänglich werden und hierdurch die Zellaffinität von Fn gesteigert wird. Die nachgewiesene Konformationsänderung kann somit als Grund für die gesteigerte Osteoblasten-Adhäsion und Aktivität auf Oberflächen mit bFn angenommen werden. Diese Kenntnisse konnten weiterhin für die Optimierung des biomimetischen Schichtsystems genutzt werden. So war es möglich, durch alternierendes Inkubieren der Biotin-aktivierten Oberfläche mit Streptavidin und bFn, ein Multilayersystem gezielt aufzubauen. Der Vorteil dieses Multilayersystems gegenüber einer einfachen Monolage aus bFn besteht in einer erhöhten Stabilität der biomimetischen Beschichtung, wodurch eine Anwendung in der Praxis erleichtert würde.

Modifizierungen des Enzyms Silicatein alpha zur direkten Immobilisierung auf verschiedenen Oberflächen : neuartige Herstellung von Kompositmaterialien unter physiologischen Bedingungen

Das Silicatein α ist ein 24 kDa großes Enzym, welches im Schwamm Suberites domuncula für die Synthese von Biosilikat verantwortlich ist. Vorhergehende Studien haben gezeigt, dass Silicatein auch die Synthese anderer Metalloxide wie Titandioxid, Galliumoxid und Zirkoniumdioxid katalysieren kann. Diese Fähigkeiten machen das Silicatein α für biomedizinische und biotechnologische Anwendungen interessant, da die Synthese unter nahezu physiologischen Bedingungen ablaufen kann, was die Herstellung neuartiger Kompositmaterialien mit einzigartigen Eigenschaften erleichtern würde. Zur Immobilisierung des Silicatein α auf verschiedenen Oberflächen wurde bislang ein Nickel-NTA-Kopolymer eingesetzt. Diese Art der Immobilisierung bietet eine Reihe von Möglichkeiten in der Nanobiotechnologie, stößt aber in der Biomedizin an ihre Grenzen, da sich nicht alle Oberflächen für ein solches Coating eignen. Zudem können die zur Aktivierung des Polymers nötigen Lösungsmittel und die über die Zeit freigesetzten Monomere aus dem Polymergerüst toxische oder mutagene Wirkung auf das umliegende Gewebe haben. Deshalb wurde das Silicatein α in dieser Arbeit mit zwei Affinitäts-Tags so modifiziert, dass es an verschiedene Oberflächen immobilisiert werden kann und dabei seine Aktivität beibehält. Zuerst wurde das Silicatein mit einem Glu-tag am N-terminalen Ende modifiziert. Dadurch gelang die direkte Immobilisierung an Hydroxyapatit und die folgende, enzymkatalysierte Synthese von Biosilikat-Beschichtungen auf diesem Träger. Die Eigenschaften eines solchen HA-Kompositmaterials können zum Beispiel zu einem verbesserten, schnelleren und stabileren Einwachsen von Knochenimplantaten führen, da Biosilikat die Reifung und Differenzierung von Osteoblasten beschleunigt. rnMit dem an Hydroxyapatit-Plättchen immobilisierten Glu-tag-Silicatein wurde ein modifizierter Pull-down Assay etabliert, wodurch bekannte, aber auch bis dahin noch unbekannte Protein-Interaktionspartner identifiziert werden konnten. rnUm zu zeigen, dass der entwickelte Glu-tag an präformierte, calciumhaltige Oberflächen binden kann, wurden die Nadeln des Kalkschwammes Paraleucilla magna als Modellorganismus verwendet. Die Nadeln konnten durch das immobilisierte Silicatein mit einer Titandioxid-Schicht überzogen werden und unter Verwendung des Interaktionspartners Silintaphin-1 konnte diese Beschichtung noch verstärkt werden. Solche CaCO3-Kompositmaterialien könnten sowohl in der Biomedizin als auch in der Biotechnologie zum Einsatz kommen. Neben den erwähnten calciumhaltigen Materialien finden auch andere Stoffe wie TiO2-Nanodrähte Verwendung in der Forschung. In weiterführenden Experimenten konnte gezeigt werden, dass der entwickelte Glu-tag auch Affinität zu Titandioxid-Oberflächen vermittelt. Auch hier konnte durch das oberflächenimmobilisierte Enzym eine Biosilikatbeschichtung synthetisiert werden. rnMit der zweiten Modifikation - einem Cys-tag - konnte Silicatein direkt auf Goldoberflächen immobilisiert werden. Durch die Verwendung eines Polydimethylsiloxan (PDMS)-Stempels wurde das Cys-getaggte Silicatein in einem linienförmigen Muster auf das Gold übertragen und die Synthese von Titandioxid dort nachgewiesen.rnDie Experimente und Ergebnisse dieser Arbeit haben gezeigt, dass Silicatein α durch einfache Modifikationen an verschiedene Oberflächen immobilisiert werden kann und dabei immer noch seine Aktivität behält. rnHierdurch ergibt sich die Möglichkeit, unter Normalbedingungen verschiedenste Kompositmaterialien herzustellen.rn

Entwicklung eines Pikoliter-Tropfengenerators für die Massenspektrometrische Spuren- und Speziesanalytik

Die Dissertationsschrift beschäftigt sich mit der Entwicklung und Anwendung einer alternativen Probenzuführungstechnik für flüssige Proben in der Massenspektrometrie. Obwohl bereits einige Anstrengungen zur Verbesserung unternommen wurden, weisen konventionelle pneumatische Zerstäuber- und Sprühkammersysteme, die in der Elementspurenanalytik mittels induktiv gekoppeltem Plasma (ICP) standardmäßig verwendet werden, eine geringe Gesamteffizienz auf. Pneumatisch erzeugtes Aerosol ist durch eine breite Tropfengrößenverteilung gekennzeichnet, was den Einsatz einer Sprühkammer bedingt, um die Aerosolcharakteristik an die Betriebsbedingungen des ICPs anzupassen.. Die Erzeugung von Tropfen mit einer sehr engen Tropfengrößenverteilung oder sogar monodispersen Tropfen könnte die Effizienz des Probeneintrags verbessern. Ein Ziel dieser Arbeit ist daher, Tropfen, die mittels des thermischen Tintenstrahldruckverfahrens erzeugt werden, zum Probeneintrag in der Elementmassenspektrometrie einzusetzen. Das thermische Tintenstrahldruckverfahren konnte in der analytischen Chemie im Bereich der Oberflächenanalytik mittels TXRF oder Laserablation bisher zur gezielten, reproduzierbaren Deposition von Tropfen auf Oberflächen eingesetzt werden. Um eine kontinuierliche Tropfenerzeugung zu ermöglichen, wurde ein elektronischer Mikrokontroller entwickelt, der eine Dosiereinheit unabhängig von der Hard- und Software des Druckers steuern kann. Dabei sind alle zur Tropfenerzeugung relevanten Parameter (Frequenz, Heizpulsenergie) unabhängig voneinander einstellbar. Die Dosiereinheit, der "drop-on-demand" Aerosolgenerator (DOD), wurde auf eine Aerosoltransportkammer montiert, welche die erzeugten Tropfen in die Ionisationsquelle befördert. Im Bereich der anorganischen Spurenanalytik konnten durch die Kombination des DOD mit einem automatischen Probengeber 53 Elemente untersucht und die erzielbare Empfindlichkeiten sowie exemplarisch für 15 Elemente die Nachweisgrenzen und die Untergrundäquivalentkonzentrationen ermittelt werden. Damit die Vorteile komfortabel genutzt werden können, wurde eine Kopplung des DOD-Systems mit der miniaturisierten Fließinjektionsanalyse (FIA) sowie miniaturisierten Trenntechniken wie der µHPLC entwickelt. Die Fließinjektionsmethode wurde mit einem zertifizierten Referenzmaterial validiert, wobei für Vanadium und Cadmium die zertifizierten Werte gut reproduziert werden konnten. Transiente Signale konnten bei der Kopplung des Dosiersystems in Verbindung mit der ICP-MS an eine µHPLC abgebildet werden. Die Modifikation der Dosiereinheit zum Ankoppeln an einen kontinuierlichen Probenfluss bedarf noch einer weiteren Reduzierung des verbleibenden Totvolumens. Dazu ist die Unabhängigkeit von den bisher verwendeten, kommerziell erhältlichen Druckerpatronen anzustreben, indem die Dosiereinheit selbst gefertigt wird. Die Vielseitigkeit des Dosiersystems wurde mit der Kopplung an eine kürzlich neu entwickelte Atmosphärendruck-Ionisationsmethode, die "flowing atmospheric-pressure afterglow" Desorptions/Ionisations Ionenquelle (FAPA), aufgezeigt. Ein direkter Eintrag von flüssigen Proben in diese Quelle war bislang nicht möglich, es konnte lediglich eine Desorption von eingetrockneten Rückständen oder direkt von der Flüssigkeitsoberfläche erfolgen. Die Präzision der Analyse ist dabei durch die variable Probenposition eingeschränkt. Mit dem Einsatz des DOD-Systems können flüssige Proben nun direkt in die FAPA eingetragen, was ebenfalls das Kalibrieren bei quantitativen Analysen organischer Verbindungen ermöglicht. Neben illegalen Drogen und deren Metaboliten konnten auch frei verkäufliche Medikamente und ein Sprengstoffanalogon in entsprechend präpariertem reinem Lösungsmittel nachgewiesen werden. Ebenso gelang dies in Urinproben, die mit Drogen und Drogenmetaboliten versetzt wurden. Dabei ist hervorzuheben, dass keinerlei Probenvorbereitung notwendig war und zur Ermittlung der NWG der einzelnen Spezies keine interne oder isotopenmarkierte Standards verwendet wurden. Dennoch sind die ermittelten NWG deutlich niedriger, als die mit der bisherigen Prozedur zur Analyse flüssiger Proben erreichbaren. Um im Vergleich zu der bisher verwendeten "pin-to-plate" Geometrie der FAPA die Lösungsmittelverdampfung zu beschleunigen, wurde eine alternative Elektrodenanordnung entwickelt, bei der die Probe länger in Kontakt mit der "afterglow"-Zone steht. Diese Glimmentladungsquelle ist ringförmig und erlaubt einen Probeneintrag mittels eines zentralen Gasflusses. Wegen der ringförmigen Entladung wird der Name "halo-FAPA" (h-FAPA) für diese Entladungsgeometrie verwendet. Eine grundlegende physikalische und spektroskopische Charakterisierung zeigte, dass es sich tatsächlich um eine FAPA Desorptions/Ionisationsquelle handelt.

Monodromy calculations for some differential equations

In vielen Teilgebieten der Mathematik ist es w"{u}nschenswert, die Monodromiegruppe einer homogenen linearen Differenzialgleichung zu verstehen. Es sind nur wenige analytische Methoden zur Berechnung dieser Gruppe bekannt, daher entwickeln wir im ersten Teil dieser Arbeit eine numerische Methode zur Approximation ihrer Erzeuger.rnIm zweiten Abschnitt fassen wir die Grundlagen der Theorie der Uniformisierung Riemannscher Fl"achen und die der arithmetischen Fuchsschen Gruppen zusammen. Auss erdem erkl"aren wir, wie unsere numerische Methode bei der Bestimmung von uniformisierenden Differenzialgleichungen dienlich sein kann. F"ur arithmetische Fuchssche Gruppen mit zwei Erzeugern erhalten wir lokale Daten und freie Parameter von Lam'{e} Gleichungen, welche die zugeh"origen Riemannschen Fl"achen uniformisieren. rnIm dritten Teil geben wir einen kurzen Abriss zur homologischen Spiegelsymmetrie und f"uhren die $widehat{Gamma}$-Klasse ein. Wir erkl"aren wie diese genutzt werden kann, um eine Hodge-theoretische Version der Spiegelsymmetrie f"ur torische Varit"aten zu beweisen. Daraus gewinnen wir Vermutungen "uber die Monodromiegruppe $M$ von Picard-Fuchs Gleichungen von gewissen Familien $f:mathcal{X}rightarrow bbp^1$ von $n$-dimensionalen Calabi-Yau Variet"aten. Diese besagen erstens, dass bez"uglich einer nat"urlichen Basis die Monodromiematrizen in $M$ Eintr"age aus dem K"orper $bbq(zeta(2j+1)/(2 pi i)^{2j+1},j=1,ldots,lfloor (n-1)/2 rfloor)$ haben. Und zweitens, dass sich topologische Invarianten des Spiegelpartners einer generischen Faser von $f:mathcal{X}rightarrow bbp^1$ aus einem speziellen Element von $M$ rekonstruieren lassen. Schliess lich benutzen wir die im ersten Teil entwickelten Methoden zur Verifizierung dieser Vermutungen, vornehmlich in Hinblick auf Dimension drei. Dar"uber hinaus erstellen wir eine Liste von Kandidaten topologischer Invarianten von vermutlich existierenden dreidimensionalen Calabi-Yau Variet"aten mit $h^{1,1}=1$.

Evolutionäre Veränderungen in der Nutzung redox-aktiver Aminosäuren und ihre Ursachen

Gewebe, Zellen und speziell Zellkompartimente unterscheiden sich in ihrer Sauerstoffkonzentration, Stoffwechselrate und in der Konzentration an gebildeten reaktiven Sauerstoffspezies. Um eine mögliche Änderung in der Aminosäurennutzung durch den Einfluss von Sauerstoff und seinen reaktiven Spezies untersuchen zu können wurden, Bereiche bzw. Kompartimente der menschlichen Zelle definiert, die einen Referenzrahmen bildeten und bekannt dafür sind, einen relativ hohen Grad an reaktiven Sauerstoffspezies aufzuweisen. Aus dem Vergleich wurde deutlich, dass vor allem die beiden redox-aktiven und schwefeltragenden Aminosäuren Cystein und Methionin durch eine besondere Verteilung und Nutzung charakterisiert sind. Cystein ist hierbei diejenige Aminosäure mit den deutlichsten Änderungen in den fünf untersuchten Modellen der oxidativen Belastung. In all diesen Modellen war die Nutzung von Cystein deutlich reduziert, wohingegen Methionin in Proteinen des Mitochondriums und der Elektronentransportkette angereichert war. Dieser auf den ersten Blick paradoxe Unterschied zwischen Cystein und Methionin wurde näher untersucht, indem die differenzierte Methioninnutzung in verschiedenen Zellkompartimenten von Homo sapiens charakterisiert wurde.rnDie sehr leicht zu oxidierende Aminosäure Methionin zeigt ein ungewöhnliches Verteilungsmuster in ihrer Nutzungshäufigkeit. Entgegen mancher Erwartung wird Methionin in zellulären Bereichen hoher oxidativer Belastung und starker Radikalproduktion intensiv verwendet. Dieses Verteilungsmuster findet man sowohl im intrazellulären Vergleich, als auch im Vergleich verschiedener Spezies untereinander, was daraufhin deutet, dass es einen lokalen Bedarf an redox-aktiven Aminosäuren gibt, der einen sehr starken Effekt auf die Nutzungshäufigkeit von Methionin ausübt. Eine hohe Stoffwechselrate, die im Allgemeinen mit einer erhöhten Produktion von Oxidantien assoziiert wird, scheint ein maßgeblicher Faktor der Akkumulation von Methionin in Proteinen der Atmungskette zu sein. Die Notwendigkeit, oxidiertes Antioxidans wieder zu reduzieren, findet auch bei Methionin Anwendung, denn zu Methioninsulfoxid oxidiertes Methionin wird durch die Methioninsulfoxidreduktase wieder zu Methionin reduziert. Daher kann die spezifische Akkumulation von Methionin in Proteinen, die verstärkt reaktiven Sauerstoffspezies ausgesetzt sind, als eine systematische Strategie angesehen werden, um andere labile Strukturen vor ungewollter Oxidation zu schützen. rnDa Cystein in allen untersuchten Modellen der oxidativen Belastung und im Besonderen in Membranproteinen der inneren Mitochondrienmembran lebensspannenabhängig depletiert war, wurde dieses Merkmal näher untersucht. Deshalb wurde die Hypothese getestet, ob ein besonderer Redox-Mechanismus der Thiolfunktion für diese selektive Depletion einer im Allgemeinen als harmlos oder antioxidativ geltenden Aminosäure verantwortlich ist. Um den Effekt von Cysteinresten in Membranen nachzustellen, wurden primäre humane Lungenfibroblasten (IMR90) mit diversen Modellsubstanzen behandelt. Geringe Konzentrationen der lipophilen Substanz Dodecanthiol verursachten eine signifikante Toxizität in IMR90-Zellen, die von einer schnellen Zunahme an polyubiquitinierten Proteinen und anderen Indikatoren des proteotoxischen Stresses, wie Sequestosom 1 (P62), HSP70 und HSP90 begleitet wurde. Dieser Effekt konnte spezifisch der Chemie der Thiolfunktion in Membranen zugeordnet werden, da Dodecanol (DOH), Dodecylmethylsulfid (DMS), Butanthiol oder wasserlösliche Thiole weder eine cytotoxische Wirkung noch eine Polyubiquitinierung von Proteinen verursachten. Die Ergebnisse stimmen mit der Hypothese überein, dass Thiole innerhalb von biologischen Membranen als radikalische Kettentransferagentien wirken. Diese Eigenschaft wird in der Polymerchemie durch Nutzung von lipophilen Thiolen in hydrophoben Milieus technisch für die Produktion von Polymeren benutzt. Da die Thiylradikal-spezifische Reaktion von cis-Fettsäuren zu trans-Fettsäuren in 12SH behandelten Zellen verstärkt ablief, kann gefolgert werden, dass 12SH zellulär radikalisiert wurde. In lebenden Organismen kann demnach die Oxidation von Cystein die Schädigung von Membranen beschleunigen und damit Einfallstore für die laterale Radikalisierung von integralen Membranproteinen schaffen, welche möglicherweise der Langlebigkeit abträglich ist, zumindest, wenn sie in der inneren Mitochondrienmembran auftritt.