Untersuchungen zur Wechselbeziehung zwischen Proteom, Energiestoffwechsel, Redoxstatus und Radiosensibilität von Tumorzellen in vitro und in vivo

Zielsetzung der vorliegenden Arbeit war die Erforschung ursächlicher Unterschiede im Energiestoffwechsel von hoch- und niedrig-glykolytischen Tumorzelllinien. Darüber hinaus wurde die Hypothese überprüft, wonach eine hohe glykolytische Aktivität in Tumorzellen zu einer Anreicherung von antioxidativen Metaboliten führt und infolgedessen eine Therapieresistenz gegen Gammabestrahlung hervorruft. Abschließend sollte durch biochemische und gentechnische Manipulationen des Energie- bzw. Glukosestoffwechsels die Strahlenresistenz von Tumorzellen verändert und somit neue therapeutische Interventionen eröffnet werden.rnDie zur Klärung dieser Fragestellung erforderlichen molekularbiologischen Experimente erfolgten an jeweils zwei Ovarialkarzinomzelllinien (OC316 und IGROV-1) und zwei Plattenepithelkarzinomzelllinien der Kopf- und Halsregion (SAS und FaDu) sowie den entsprechenden Experimentaltumoren.rnUnabhängig von der Tumorentität und dem Tumormodell konnte gezeigt werden, dass eine erhöhte Expression Stoffwechsel-assoziierter Proteine mit einem gesteigerten Energiestoffwechsel einhergeht. Der Transfer der Ovarial- und Plattenepithelkarzinomzelllinien in das Mausmodell führte zu keiner grundsätzlichen Änderung des Tumormikromilieus. So wies die hoch-metabolische Linie OC316 in vitro und in vivo eine stark erhöhte MCT-4 Expression auf, deren gentechnische Inhibition jedoch zu keiner Reduktion der Glykolyserate führte.rnDie Hypothese, dass die Laktatproduktion als prädiktiver Marker für die Strahlenresistenz einer Tumorzelllinie fungiert, konnte nicht bestätigt werden. Jedoch führte die Manipulation der intrazellulären Laktatbildung und des Energiestoffwechsels mit nicht zelltoxischen Konzentrationen von 2-Deoxy-D-glukose (2DG) und Rotenon (ROT) bei den Ovarialkarzinomzelllinien zu einer Erhöhung der intrazellulären O2--Anionen, einer Zunahme der Strahlenempfindlichkeit sowie zur Steigerung der initialen und residualen DNA-Doppelstrangbrüche nach Gammabestrahlung.rnHierbei wirken 2DG und ROT synergistisch durch die Inhibierung antioxidativer Systeme sowie durch die Erhöhung des zellulären Radikal-Status. Die Anwendung von Stoffwechselmanipulatoren zur Optimierung und Unterstützung vorhandener Radikal-erzeugender Therapieformen wird aktuell in klinischen Studien überprüft. Translational könnte die durch 2DG und ROT beschriebene Erhöhung der Strahlenempfindlichkeit bei Ovarialkarzinomzelllinien z. B. in Kombination mit intensitätsmodulierten Strahlentherapien neue Behandlungsmöglichkeiten eröffnen, was in weiterführenden in vivo Studien zu überprüfen ist.rn

Regulation of Nox4 expression by histone deacetylases in human endothelial cells : involvement of epigenetic mechanisms

Nox4 is a member of the NADPH oxidase family, which represents a major source of reactive oxygen species (ROS) in the vascular wall. Nox4-mediated ROS production mainly depends on the expression levels of the enzyme. The aim of my study was to investigate the mechanisms of Nox4 transcription regulation by histone deacetylases (HDAC). Treatment of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) and HUVEC-derived EA.hy926 cells with the pan-HDAC inhibitor scriptaid led to a marked decrease in Nox4 mRNA expression. A similar down-regulation of Nox4 mRNA expression was observed by siRNA-mediated knockdown of HDAC3. HDAC inhibition in endothelial cells was associated with enhanced histone acetylation, increased chromatin accessibility in the human Nox4 promoter region, with no significant changes in DNA methylation. In addition, the present study provided evidence that c-Jun played an important role in controlling Nox4 transcription. Knockdown of c-Jun with siRNA led to a down-regulation of Nox4 mRNA expression. In response to scriptaid treatment, the binding of c-Jun to the Nox4 promoter region was reduced despite the open chromatin structure. In parallel, the binding of RNA polymerase IIa to the Nox4 promoter was significantly inhibited as well, which may explain the reduction in Nox4 transcription. In conclusion, HDAC inhibition decreases Nox4 transcription in human endothelial cells by preventing the binding of transcription factor(s) and polymerase(s) to the Nox4 promoter, most likely because of a hyperacetylation-mediated steric inhibition. In addition, HDAC inhibition-induced Nox4 downregulation may also involves microRNA-mediated mRNA destabilization, because the effect of the scriptaid could be partially blocked by DICER1 knockdown or by transcription inhibition.

Die Bedeutung von molekularem Sauerstoff für die Evolution des genetischen Codes

Die Entstehung und Evolution des genetischen Codes, der die Nukleotidsequenz der mRNA in die Aminosäuresequenz der Proteine übersetzt, zählen zu den größten Rätseln der Biologie. Die ersten Organismen, die vor etwa 3,8 Milliarden Jahren auf der Erde auftraten, nutzten einen ursprünglichen genetischen Code, der vermutlich ausschließlich abiotisch verfügbare Aminosäuren terrestrischer oder extraterrestrischer Herkunft umfasste. Neue Aminosäuren wurden sukzessive biosynthetisiert und selektiv in den Code aufgenommen, welcher in der modernen Form aus bis zu 22 Aminosäuren besteht. Die Ursachen für die Selektion und die Chronologie ihrer Aufnahme sind bis heute unbekannt und sollten im Rahmen der vorliegenden Arbeit erforscht werden. Auf Grundlage quanten-chemischer Berechnungen konnte in dieser Arbeit zunächst ein Zusammenhang zwischen der HOMO-LUMO-Energiedifferenz (H-L-Distanz), die ein inverses quanten-chemisches Korrelat für allgemeine chemische Reaktivität darstellt, und der chronologischen Aufnahme der Aminosäuren in den genetischen Code aufgezeigt werden. Demnach sind ursprüngliche Aminosäuren durch große H-L-Distanzen und neue Aminosäuren durch kleine H-L-Distanzen gekennzeichnet. Bei einer Analyse des Metabolismus von Tyrosin und Tryptophan, bei denen es sich um die beiden jüngsten Standard-Aminosäuren handelt, wurde ihre Bedeutung als Vorläufer von Strukturen ersichtlich, die sich durch eine hohe Redox-Aktivität auszeichnen und deren Synthese gleichzeitig molekularen Sauerstoff erfordert. Aus diesem Grund wurden die Redox-Aktivitäten der 20 Standard-Aminosäuren gegenüber Peroxylradikalen und weiteren Radikalen getestet. Die Untersuchungen ergaben eine Korrelation zwischen evolutionärem Auftreten und chemischer Reaktivität der jeweiligen Aminosäure, die sich insbesondere in der effizienten Reaktion zwischen Tryptophan bzw. Tyrosin und Peroxylradikalen widerspiegelte. Dies indizierte eine potentielle Bedeutung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) bei der Konstituierung des genetischen Codes. Signifikante Mengen an ROS wurden erst zu Beginn der Oxygenierung der Geobiosphäre, die als Great Oxidation Event (GOE) bezeichnet wird und vor circa 2,3 Milliarden Jahren begann, gebildet und müssen zur oxidativen Schädigung vulnerabler, zellulärer Strukturen geführt haben. Aus diesem Grund wurde das antioxidative Potential von Aminosäuren beim Prozess der Lipidperoxidation untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass lipophile Derivate von Tryptophan und Tyrosin befähigt sind, die Peroxidation von Rattenhirnmembranen zu verhindern und humane Fibroblasten vor oxidativem Zelltod zu schützen. Daraus gründete sich das in dieser Arbeit aufgestellte Postulat eines Selektionsvorteils primordialer Organismen während des GOEs, die Tryptophan und Tyrosin als redox-aktive Aminosäuren in Membranproteine einbauen konnten und somit vor Oxidationsprozessen geschützt waren. Demzufolge wurde die biochemische Reaktivität als Selektionsparameter sowie oxidativer Stress als prägender Faktor der Evolution des genetischen Codes identifiziert.

Evolutionäre Veränderungen in der Nutzung redox-aktiver Aminosäuren und ihre Ursachen

Gewebe, Zellen und speziell Zellkompartimente unterscheiden sich in ihrer Sauerstoffkonzentration, Stoffwechselrate und in der Konzentration an gebildeten reaktiven Sauerstoffspezies. Um eine mögliche Änderung in der Aminosäurennutzung durch den Einfluss von Sauerstoff und seinen reaktiven Spezies untersuchen zu können wurden, Bereiche bzw. Kompartimente der menschlichen Zelle definiert, die einen Referenzrahmen bildeten und bekannt dafür sind, einen relativ hohen Grad an reaktiven Sauerstoffspezies aufzuweisen. Aus dem Vergleich wurde deutlich, dass vor allem die beiden redox-aktiven und schwefeltragenden Aminosäuren Cystein und Methionin durch eine besondere Verteilung und Nutzung charakterisiert sind. Cystein ist hierbei diejenige Aminosäure mit den deutlichsten Änderungen in den fünf untersuchten Modellen der oxidativen Belastung. In all diesen Modellen war die Nutzung von Cystein deutlich reduziert, wohingegen Methionin in Proteinen des Mitochondriums und der Elektronentransportkette angereichert war. Dieser auf den ersten Blick paradoxe Unterschied zwischen Cystein und Methionin wurde näher untersucht, indem die differenzierte Methioninnutzung in verschiedenen Zellkompartimenten von Homo sapiens charakterisiert wurde.rnDie sehr leicht zu oxidierende Aminosäure Methionin zeigt ein ungewöhnliches Verteilungsmuster in ihrer Nutzungshäufigkeit. Entgegen mancher Erwartung wird Methionin in zellulären Bereichen hoher oxidativer Belastung und starker Radikalproduktion intensiv verwendet. Dieses Verteilungsmuster findet man sowohl im intrazellulären Vergleich, als auch im Vergleich verschiedener Spezies untereinander, was daraufhin deutet, dass es einen lokalen Bedarf an redox-aktiven Aminosäuren gibt, der einen sehr starken Effekt auf die Nutzungshäufigkeit von Methionin ausübt. Eine hohe Stoffwechselrate, die im Allgemeinen mit einer erhöhten Produktion von Oxidantien assoziiert wird, scheint ein maßgeblicher Faktor der Akkumulation von Methionin in Proteinen der Atmungskette zu sein. Die Notwendigkeit, oxidiertes Antioxidans wieder zu reduzieren, findet auch bei Methionin Anwendung, denn zu Methioninsulfoxid oxidiertes Methionin wird durch die Methioninsulfoxidreduktase wieder zu Methionin reduziert. Daher kann die spezifische Akkumulation von Methionin in Proteinen, die verstärkt reaktiven Sauerstoffspezies ausgesetzt sind, als eine systematische Strategie angesehen werden, um andere labile Strukturen vor ungewollter Oxidation zu schützen. rnDa Cystein in allen untersuchten Modellen der oxidativen Belastung und im Besonderen in Membranproteinen der inneren Mitochondrienmembran lebensspannenabhängig depletiert war, wurde dieses Merkmal näher untersucht. Deshalb wurde die Hypothese getestet, ob ein besonderer Redox-Mechanismus der Thiolfunktion für diese selektive Depletion einer im Allgemeinen als harmlos oder antioxidativ geltenden Aminosäure verantwortlich ist. Um den Effekt von Cysteinresten in Membranen nachzustellen, wurden primäre humane Lungenfibroblasten (IMR90) mit diversen Modellsubstanzen behandelt. Geringe Konzentrationen der lipophilen Substanz Dodecanthiol verursachten eine signifikante Toxizität in IMR90-Zellen, die von einer schnellen Zunahme an polyubiquitinierten Proteinen und anderen Indikatoren des proteotoxischen Stresses, wie Sequestosom 1 (P62), HSP70 und HSP90 begleitet wurde. Dieser Effekt konnte spezifisch der Chemie der Thiolfunktion in Membranen zugeordnet werden, da Dodecanol (DOH), Dodecylmethylsulfid (DMS), Butanthiol oder wasserlösliche Thiole weder eine cytotoxische Wirkung noch eine Polyubiquitinierung von Proteinen verursachten. Die Ergebnisse stimmen mit der Hypothese überein, dass Thiole innerhalb von biologischen Membranen als radikalische Kettentransferagentien wirken. Diese Eigenschaft wird in der Polymerchemie durch Nutzung von lipophilen Thiolen in hydrophoben Milieus technisch für die Produktion von Polymeren benutzt. Da die Thiylradikal-spezifische Reaktion von cis-Fettsäuren zu trans-Fettsäuren in 12SH behandelten Zellen verstärkt ablief, kann gefolgert werden, dass 12SH zellulär radikalisiert wurde. In lebenden Organismen kann demnach die Oxidation von Cystein die Schädigung von Membranen beschleunigen und damit Einfallstore für die laterale Radikalisierung von integralen Membranproteinen schaffen, welche möglicherweise der Langlebigkeit abträglich ist, zumindest, wenn sie in der inneren Mitochondrienmembran auftritt.

Untersuchung zur endogenen Bildung von oxidativen DNA-Schäden in vivo und in vitro

In dieser Arbeit sollte der Einfluss einer Überproduktion von humaner Superoxiddismutase 1 (hSOD1) auf die Spiegel der DNA-Schäden in verschiedenen Geweben von transgenen Mäusen untersucht werden. Tiere die eine Defizienz des Ogg1- und Csb- Proteins aufweisen und deshalb oxidative Purinmodifikationen nicht oder nur schwer reparieren können, akkumulieren 8-oxoG im Laufe ihres Lebens (Osterod, et al. 2001). Aus diesem Grund sind diese ein gutes Modell, um protektive Eigenschaften von Antioxidantien wie z.B. Substanzen oder Enzymen zu untersuchen. Fusser, et al. 2011 konnten beispielsweise zeigen, dass das pflanzliche Polyphenol Resveratrol die endogenen Spiegel an 8-oxoG sowie die spontanen Mutatiosraten im Lac I - Gen senken kann. Um den Einfluss von hSOD1 in vivo zu untersuchen, wurden in zwei Zuchtschritten 4 Mausgenotypen generiert, nämlich (Csb -/- Ogg1 -/- und Csb +/- Ogg1 +/- Mäuse jeweils mit ohne hSOD1 Überexpression). Diese wurden in verschiedenen Altersstufen auf die Basalspiegel an oxidativen Schäden (Einzelstrangbrüche und Fpg-sensitive Läsionen) in der Leber, der Niere und der Milz untersucht. Die Genotypen wurden zunächst charakterisiert und die hSOD1-Überexpression mittels qRT-PCR, Western Blot und Enzymaktivitätsbestimmung verifiziert. Es konnte an diesen Tieren erstmalig gezeigt werden, dass SOD die Generierung von DNA-Schäden in vivo mit zunehmendem Alter der Tiere senkt und dass deshalb Superoxid eine der reaktiven Sauerstoffspezies ist, die unter physiologischen Bedingungen für die DNA-Schäden verantwortlich ist. Außerdem kann ein möglicher toxischer Effekt der Überproduktion von SOD ausgeschlossen werden. Erhöhte Spiegel an oxidativen DNA-Schäden durch womöglich erhöhte Spiegel an H2O2 konnten in dieser Studie nicht beobachtet werden. Eine Messung der Genexpression anderer antioxidativer Enzyme wie Katalase, SOD2 und SOD3, GPX oder HO1 sind an diesem Effekt nicht beteiligt. Auch konnte kein Einfluss des redoxsensitiven Transkriptionsfaktors Nrf2 gezeigt werden. rnUm mögliche Quellen der für die oxidativ gebildeten DNA-Schäden verantwortlichen ROS zu identifizieren, wurde der Einfluss des Dopaminstoffwechsels untersucht. Während des Dopaminmetabolismus werden intrazellulär Reaktive Sauerstoffspezies (H2O2 und O2.-) gebildet und tragen sehr wahrscheinlich zur Entstehung von neurodegenerativen Erkrankungen wie Parkinson bei. In dem gängigen Parkinson-Zellkulturmodell SH-SY5Y konnte keine Erhöhung von oxidativen Schäden in nukleärer DNA nach Dopaminbehandlung nachgewiesen werden. Eine Überexpression der Dopaminmetabolisierenden Enzyme MAO-A und MAO-B zeigen bei niedrigen Dosen Dopamin eine leichte jedoch nicht signifikante Erhöhung der Fpg-sensitiven Modifikationen. Die Überproduktion des Dopamintransporters zeigte keinen Effekt nach Dopaminzugabe. Es kann geschlussfolgert werden, dass durch erhöhte MAO-A und MAO-B endogen ROS gebildet werden, die die Bildung Fpg-sensitiver Läsionen hervorrufen. Bei hohen Dosen und langer Inkubationszeit steht die Dopaminautoxidation, anschließende Neuromelaninbildung und als Konsequenz Apoptose im Vordergrund.rn

Analysis of zinc oxide nanoparticles as a potential mutagen of respiratory epithelia

Metallische Nanopartikel und ihre Oxide (z.B. ZnO NP, TiO2 NP und Fe2O3 NP) werden aufgrund ihrer chemischen und physikalischen Eigenschaften häufig als Additive in der Reifenproduktion, in Katalysatoren, Lebensmitteln, Arzneimitteln und Kosmetikprodukten verwendet. Künftig wird ein kontinuierlicher Anstieg der industriellen Anwendung (~ 1663 Tonnen im Jahr 2025) mit gesteigerter Freisetzung in die Umwelt erwartet, was zwangsläufig zu einer vermehrten Aufnahme über das respiratorische Epithel führt. Metalldampffieber ist als gesundheitsschädigender Effekt von Metalloxid-haltigen Aerosolen (z.B. ZnO) nach Inhalation bekannt. Immunreaktionen, wie beispielsweise Entzündungen, werden häufig mit der Entstehung von Sauerstoffradikalen (ROS) in Verbindung gebracht, die wiederum zu DNA-Schäden führen können. Drei mögliche Ursachen der Genotoxität werden angenommen: direkte Interaktion von Nanopartikeln mit intrazellulären Strukturen, Interaktion von Ionen dissoziierter Partikel mit intrazellulären Strukturen sowie die Entstehung von ROS initiiert durch Partikel oder Ionen.rnDie vorliegende Studie befasst sich mit den Mechanismen der Genotoxizität von ZnO Nanopartikeln (ZnO NP), als Beispiel für metallische Nanopartikel, im respiratorischen Epithel. In der Studie wurde gezielt die intrazelluläre Aufnahme und Verteilung von ZnO NP, deren Toxizität, deren DNA schädigendes Potential sowie die Aktivierung der DNA damage response (DDR) analysiert.rnEs konnten kaum internalisierte ZnO NP mittels TEM detektiert werden. Innerhalb der ersten Sekunden nach Behandlung mit ZnO NP wurde spektrofluorometrisch ein starker Anstieg der intrazellulären Zn2+ Konzentration gemessen. In unbehandelten Zellen war Zn2+ in granulären Strukturen lokalisiert. Die Behandlung mit ZnO NP führte zu einer Akkumulation von Zn2+ in diesen Strukturen. Im zeitlichen Verlauf verlagerten sich die Zn2+-Ionen in das Zytoplasma, sowie in Zellkerne und Mitochondrien. Es wurde keine Kolokalisation von Zn2+ mit den frühen Endosomen und dem endoplasmatischen Retikulum beobachtet. Die Vorbehandlung der Zellen mit Diethylen-triaminpentaessigsäure (DTPA), als extrazellulärem Komplexbildner, verhinderte den intrazellulären Anstieg von Zn2+ nach Behandlung mit den Partikeln.rnDie Behandlung mit ZnO NP resultierte in einer zeit- und dosisabhängigen Reduktion der zellulären Viabilität, während die intrazelluläre ROS-Konzentrationen in den ersten 30 min leicht und anschließend kontinuierlich bis zum Ende der Messung anstiegen. Außerdem verringerte sich das mitochondriale Membranpotential, während sich die Anzahl der frühapoptotischen Zellen in einer zeitabhängigen Weise erhöhte. rnDNA Doppelstrangbrüche (DNA DSB) wurden mittels Immunfluoreszenz-Färbung der γH2A.X foci sichtbar gemacht und konnten nach Behandlung mit ZnO NP detektiert werden. Die Vorbehandlung mit dem Radikalfänger N-Acetyl-L-Cytein (NAC) resultierte in stark reduzierten intrazellulären ROS-Konzentrationen sowie wenigen DNA DSB. Die DNA Schädigung wurde durch Vorbehandlung mit DTPA ganz verhindert.rnDie Aktivierung der DDR wurde durch die Analyse von ATM, ATR, Chk1, Chk2, p53 und p21 mittels Western Blot und ELISA nach Behandlung mit ZnO NP überprüft. Der ATR/Chk1 Signalweg wurde durch ZnO NP nicht aktiviert. Die Komplexierung von Zn2+ resultierte in einer verminderten ATM/Chk2 Signalwegaktivierung. Es zeigte sich, dass das Abfangen von ROS keinen Effekt auf die ATM/Chk2 Signalwegaktivierung hatte.rnZusammengefasst wurde festgestellt, dass die Exposition mit ZnO NP in der Entstehung von ROS, reduzierter Viabilität und vermindertem mitochondrialem Membranpotential resultiert, sowie zeitabhängig eine frühe Apoptose initiiert. ZnO NP dissoziierten extrazellulär und wurden schnell als Zn2+ über unbekannte Mechanismen internalisiert. Die Zn2+-Ionen wurden im Zytoplasma, sowie besonders in den Mitochondrien und dem Zellkern, akkumuliert. Die DDR Signalgebung wurde durch ZnO NP aktiviert, jedoch nicht durch NAC inhibiert. Es wurde gezeigt, dass DTPA die DDR Aktivierung komplett inhibierte. Die Behandlung mit ZnO NP induzierte DNA DSB. Die Inhibition von ROS reduzierte die DNA DSB und die Komplexierung der Zn2+ verhinderte die Entstehung von DNA DSB.rnDiese Daten sprechen für die Dissoziation der Partikel und die hierbei freigesetzten Zn2+ als Hauptmediator der Genotoxizität metallischer Nanopartikel. rn