Vakzinierung gegen die murine kutane Leishmaniose mit TAT-LACK transduzierten dendritischen Zellen

In der murinen kutanen Leishmaniose ist die Ausheilung der Infektion mit dem Auftreten von schützenden CD4+ Th1- sowie CD8+ Tc1-Immunantworten assoziiert. Daher sollte eine wirksame Vakzine beide T-Zell-Populationen induzieren. Im Rahmen dieser Dissertation konnte gezeigt werden, daß mit TAT-LACK Fusionsproteinen effektiv gegen eine progressiv verlaufende Infektion mit Leishmania major in empfindlichen BALB/c sowie resistenten C57BL/6 Mäusen vakziniert werden kann. TAT-LACK konnte hierbei sowohl im DC- als auch im proteinbasierten Ansatz protektive Immunität verleihen. Das TAT-Peptid ist in der Lage, Proteine direkt in das Zytosol von DC zu schleusen und so den für die CD8+ T-Zell-Antworten erforderlichen MHC Klasse I Präsentationsweg einzuschlagen. Stammesspezifische Untersuchungen des inflammatorischen Infiltrates in Läsion und Lymphknoten bestätigten die physiologische Relevanz von DC und CD8+ T-Zellen im Verlauf einer etablierten Leishmania-Infektion in beiden Mausstämmen und rechtfertigten somit den Einsatz einer DC basierten Vakzine, die vermehrt CD8+ T-Zellen induzieren sollte. Tatsächlich konnte mit TAT-LACK transduzierten DC in beiden Mausstämmen effektiv gegen eine progressiv verlaufende Leishmania-Infektion vakziniert werden. Der Vakzinierungserfolg ließ sich anhand verringerter Läsionsvolumina, reduzierter Parasitenlasten und einer Verschiebung des Zytokinprofils in Richtung einer Th1 dominierten Immunantwort bestätigen. In allen Ansätzen war die i.d. Vakzinierung mit TAT-LACK transduzierten DC der Injektion von LACK gepulsten DC überlegen. Experimente mit DC aus IL-12p40 defizienten Mäusen belegten die IL-12 Abhängigkeit der Vakzine. Mit Hilfe von in vitro Restimulierungsexperimenten konnte nachgewiesen werden, daß nach Applikation TAT-LACK transduzierter DC in beiden Mausstämmen vermehrt CD8+ T-Zellen induziert werden. Des weiteren waren TAT-LACK transduzierte DC in Restimulationsexperimenten stärkere Aktivatoren der CD8+ T-Zell-Proliferation als LACK gepulste DC. Depletionsexperimente bestätigten die T-Zell-Abhängigkeit der Vakzine. Weitere in vivo Versuche belegten zudem die protektive Wirkung von TAT-LACK Fusionsproteinen im direkten, proteinbasierten Vakzinierungsansatz. Floreszenzmikroskopische Analysen der Epidermis bestätigten hierbei Aktivierung und Auswanderung von LC nach i.d. TAT-LACK Applikation.

Einfluss immunevasiver Strategien des humanen Cytomegalovirus auf die MHC-Klasse-I-Präsentation der viralen Antigene pp65 und IE1

Das Humane Cytomegalovirus (HCMV) stellt eine große Bedrohung für Patienten mit geschwächtem oder unausgereiftem Immunsystem dar. Bei immunkompetenten Personen hingegen werden schwere Erkrankungen insbesondere durch die Wirkung antiviraler zytotoxischer CD8+-T-Lymphozyten (CTL) weitgehend verhindert. Aus Zellkultur-Systemen war bekannt, dass virale Glykoproteine, welche in der US2-US11-Region des HCMV-Genoms kodiert werden, inhibitorisch in den MHC-Klasse-I-Präsentationsweg eingreifen und somit die entsprechende Präsentation durch infizierte Zellen behindern. Über die Bedeutung dieser US2-US11-vermittelten Immunevasion für die Präsentation viraler Antigene im Kontext der Virusinfektion war jedoch nichts bekannt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte daher der Einfluss der Immunevasion auf die MHC-Klasse-I-Präsentation der beiden wichtigsten CTL-Zielstrukturen von HCMV, dem Tegumentprotein pp65 und dem regulatorischen immediate early Protein IE1, untersucht werden. In Ergänzung dazu sollte das immunevasive Potential eines durch HCMV kodierten Homologs des immunmodulatorischen Zytokins Interleukin-10 (cmvIL-10) analysiert werden. Hierzu wurden über Peptidimmunisierung HLA-A2-transgener Mäuse CTL-Klone hergestellt, welche ausgesuchte Peptide aus pp65 und IE1 in Assoziation mit HLA-A2 mit hoher Spezifität und Sensitivität erkannten. Auf diese Weise konnte eine direkte Beeinflussung der MHC-Klasse-I-Präsentation durch cmvIL-10 falsifiziert und somit der Hypothese, dass das von infizierten Zellen freigesetzte Zytokin die MHC-Klasse-I-Präsentation nicht infizierter Nachbarzellen beeinflussen könnte, widersprochen werden. Mit Hilfe einer US2-US11-Deletionsmutante des Virus konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass die Präsentation von sowohl pp65 als auch IE1 durch die Immunevasion beeinträchtigt wird. Dabei war die Präsentation des IE1-Peptids zu jedem untersuchten Zeitpunkt nach Infektion vollständig unterdrückt. Die Präsentation des pp65-Peptids hingegen war noch bis zu 72 Stunden nach Infektion detektierbar. Diese anhaltende Präsentation wurde dabei durch MHC-Klasse-I-Komplexe hervorgerufen, die trotz der Expression der US2-US11-Region an die Zelloberfläche transportiert wurden. Anhand des pp65 konnte somit erstmals gezeigt werden, dass die Immunevasion von HCMV Bildung und Transport bestimmter MHC-Klasse-I-Peptid-Komplexe zwar beeinträchtigen, jedoch nicht vollständig blockieren kann. Weitere Untersuchungen ergaben, dass die Präsentation von IE1-Peptiden durch das Vorhandensein des pp65-Proteins nicht beeinflusst wurde. Damit konnten aus der Literatur bekannte Daten anderer widerlegt werden. Mit Hilfe einer weiteren Virusmutante konnte schließlich gezeigt werden, das die Expression eines der Immunevasine, des gpUS11, hinreichend ist, die IE1-Präsentation vollständig zu unterdrücken, jedoch keinerlei messbaren Einfluss auf die Präsentation von pp65 ausübt. Die vorliegende Arbeit hat wichtige Erkenntnisse erbracht, die die Grundlage für weiterführende Untersuchungen zur Aufklärung der Bedeutung der einzelnen Immunevasionsgene für die Präsentation viraler Antigene im Rahmen der Virusinfektion darstellen.

Eine neue Form der Pyruvatkinase in Säugerspermien

Nach Homogenisation ejakulierter Eberspermien und Zentrifugation des Homogenates blieben mehr als 60% der Aktivität des glykolytischen Enzyms Pyruvatkinase (PK) an Zellfragmenten im Sediment gebunden. Diese strukturgebundene PK wurde als PK-S bezeichnet. Das Detergenz Triton X-100 führte nicht zur Ablösung der PK-S; mit Trypsin konnten jedoch rund 80% der PK-S ohne Verlust an Aktivität von den Strukturen gelöst und durch kombinierte Kationenaustausch- und Hydrophobizitätschromatographie gereinigt werden (spezifische Aktivität: 116,7 U/mg Protein). Die lösliche PK aus Eberspermien konnte ebenfalls durch ein ähnliches Verfahren angereichert werden. Im Gel (SDS-PAGE) zeigten die Untereinheiten der PK-S mit 64.400 eine geringfügig größere relative Molekülmasse als die der PK-M1 aus Kaninchenmuskel (62.000). Die kinetischen Eigenschaften der abgelösten PK-S als auch der noch an Spermienstrukturen gebundenen PK-S und der löslichen PK aus Eberspermien waren sehr ähnlich und entsprachen der M1-Isoform der PK. Antikörper gegen Kaninchenmuskel-PK (Anti-PK-M1) reagierten auch mit der löslichen PK und der PK-S aus Eberspermien. Edman-Abbau der ersten 19 Aminosäuren zeigte, dass die tryptisch abgelöste PK-S am N-Terminus um 5 Aminosäuren gegenüber nativer PK-M1 verlängert ist, während der C-Terminus der erhaltenen PK-S-Sequenz mit einem meist nahe dem N-Terminus gelegenen Sequenzabschnitt der PK-M1 und -M2 übereinstimmt. Die N-terminale Verlängerung der nativen PK-S enthält sicherlich mehr als die nach tryptischer Lyse nachgewiesenen 5 Aminosäuren. Vergleiche der Aminosäure- und übersetzten Nukleotidsequenzen sowie die kinetischen Eigenschaften lassen vermuten, dass die PK-S, wie die PK-M1 und PK-M2, vom PKM-Gen codiert wird. Gegen die gereinigte PK-S wurden Antikörper in Kaninchen produziert. Da das Antiserum nicht ausreichend spezifisch für PK-S war, wurden aus ihm affinitätschromatographisch Antikörper (Anti-PK-S) isoliert, die hohe Affinität zu einem synthetisierten PK-S-Peptid (13 N-terminale Aminosäuren der tryptisch abgelösten PK-S) hatten. Dieses Anti-PK-S-Präparat war spezifisch für PK-S; es reagierte weder mit Kaninchenmuskel-PK noch mit löslicher PK oder anderen Proteinen aus Eberspermien. Anti-PK-S und Anti-PK-M1 wurden zur Lokalisierung von PK-S und löslicher PK in Spermien von Eber, Bulle und Mensch sowie in Schnitten von Eberhoden eingesetzt. Mit Anti-PK-S wurden der Bereich des Akrosoms und das lange flagellare Hauptstück sowie der Übergangsbereich zwischen Kopf und Mittelstück von Eberspermien fluoreszenzmarkiert, wogegen das kurze, die Mitochondrien enthaltende Mittelstück des Flagellums und der postakrosomale Kopfbereich nur mit Anti-PK-M1 markiert wurden. Immunogoldmarkierung in elektronenmikroskopischen Bildern bestätigte die Lokalisierung von PK-S im Akrosombereich. Im Hauptstück banden Anti-PK-M1 und Anti-PK-S an die fibröse Scheide. Glyzerinaldehyd-3-phosphat Dehydrogenase (GAPDH) konnte von mir ebenfalls im Akrosombereich, im Übergangsbereich zwischen Kopf und Mittelstück und an der fibrösen Scheide detektiert werden. Auch an Bullen- und Humanspermien konnte über Immunogoldmarkierung PK und vermutlich GAPDH an der fibrösen Scheide gezeigt werden. Im Akrosombereich dieser Spermien waren die Nachweise von PK und GAPDH jedoch nicht sicher. In Eberhodenschnitten war die PK-S erstmals, oder zumindest vermehrt, in den elongierenden Spermatiden über Fluoreszenzmarkierung nachweisbar, während andere, vermutlich somatische PK vermehrt in den früheren Stadien (Spermatogonien, aber auch in den Spermatozyten und runden Spermatiden) auftrat. Für die GAPDH zeigte sich ein ähnlicher Entwicklungsverlauf. Die Ergebnisse zeigen, dass in Eberspermien zwei Isoformen der PK auftreten: eine N-terminal verlängerte, strukturgebundene Form, die PK-S, und eine lösliche Form, die beide der PK-M1 ähneln. Der ungewöhnliche N-Terminus der PK-S dient vermutlich der spezifischen räumlichen Anordnung der PK-S im Akrosombereich und an der fibrösen Scheide, nicht aber der Modulation kinetischer Eigenschaften. Meine Untersuchungen stützen die Hypothese, dass in bestimmten Kompartimenten von Säugerspermien die Glykolyse durch Verankerung einiger ihrer Enzyme strukturell hochgeordnet ist. Dadurch wird vermutlich die Versorgung der Mitochondrien-freien Regionen mit ATP sichergestellt. Man kann diese Organisation als Anpassung des Stoffwechsels von Spermien deuten, bei denen die Mitochondrien in einem kleinen Bereich (Mittelstück) hinter dem Spermienkopf kompartimentiert sind. Im Hauptstück des Flagellums könnte die Glykolyse ATP für die Spermienmotilität liefern, im Akrosombereich für die Verhinderung einer vorzeitigen Akrosomreaktion. Somit käme der strukturierten Glykolyse eine essentielle Bedeutung für die Befruchtungsfähigkeit von Säugerspermien zu.

Der Einfluss von Apolipoprotein E auf die zellulären Mechanismen der Alzheimer Erkrankung

Die massive Bildung und Ablagerung von aggregiertem Amyloid Beta-Peptid im Gehirn wird allgemein als zentrales Ereignis im Rahmen des Neurodegenerationsprozesses der Alzheimer Demenz betrachtet. Als einer der ursächlichen Risikofaktoren gilt das Vorliegen des ε4-Allels des Apolipoprotein E. Die Alzheimer´sche Krankheit ist dabei in sehr vielfältige Weise mit Apolipoprotein E verknüpft. ApoE begünstigt isoformenabhängig Aβ-Ablagerungen, ApoE-Fragmente kommen im Gehirn und der Cerebrospinalflüssigkeit von Alzheimer Patienten vor und ApoE ist darüber hinaus als Cholesterintransportprotein über den zellulären Cholesterinstoffwechsel mit der Amyloidbildung verknüpft. Mit Hilfe einer Doppeltransfektion von ApoE und ADAM10 in HEK-Zellen und durch Studien mit Inhibitoren der ADAM-Familie an HepG-2-Zellen wurde in vitro gezeigt, dass ApoE nicht durch α-Sekretasen der ADAM-Familie gespalten wird. Weiterhin konnte bewiesen werden, dass ApoE in Astrogliomazellen keinen Einfluss auf die APP-Prozessierung ausübt. Durch in vitro Modulation des Cholesteringehaltes an Astrogliomazellen mit MβCD und seine Cholesterin-Komplexverbindungen ist gezeigt worden, dass die ApoE-Sekretion durch abnehmenden Cholesteringehalt gesenkt wird. Indem Statine alleine oder in Kombination mit Isoprenylierungssubstraten eingesetzt wurden ist der Beweis erbracht worden, dass Statine in vitro die ApoE-Sekretionsinhibition alleine durch Hemmung der Cholesterinbiosynthese bewirken. Bestätigt wurde dies weiterhin durch Experimente mit Isoprenylierungsinhibitoren. Aus dem Wirkmechanismus von Statinen auf die ApoE-Sekretionssenkung leitet sich womöglich der für bestimmte Statine berichtete neuroprotektive Effekt bei Morbus Alzheimer in retrospektiven Humanstudien ab, der sich durch reine Cholesterinsenkung nicht erklären lässt. Im Zusammenhang mit der Cholesterinhomöostase und dem gesteigerten 24(S)-Hydroxycholesterinspiegel bei Morbus Alzheimer, haben die Ergebnisse gezeigt, dass 24(S)-Hydroxycholesterin [24(S)-OH-chol] zur ApoE-Sekretions- und Expressionssteigerung führt. In dieser Arbeit konnte erstmals der Nachweis erbracht werden, dass der stimulatorische Effekt von 24(S)-OH-Chol durch gleichzeitige Lovastatingabe reduziert werden kann. Dies stellt einen möglichen Ansatz im Kampf gegen die Alzheimer Demenz dar. Weiterführend müssen diese Ergebnisse noch in vivo beispielsweise durch Versuche an ApoE-transgenen Mäusen bestätigt werden. Darüber hinaus könnte nach einer Statintherapie der ApoE-Gehalt in humaner, cerebrospinaler Flüssigkeit ermittelt werden.

Computational modeling of surface interactions

Die Wechselwirkung zwischen Proteinen und anorganischen Oberflächen fasziniert sowohl aus angewandter als auch theoretischer Sicht. Sie ist ein wichtiger Aspekt in vielen Anwendungen, unter anderem in chirugischen Implantaten oder Biosensoren. Sie ist außerdem ein Beispiel für theoretische Fragestellungen betreffend die Grenzfläche zwischen harter und weicher Materie. Fest steht, dass Kenntnis der beteiligten Mechanismen erforderlich ist um die Wechselwirkung zwischen Proteinen und Oberflächen zu verstehen, vorherzusagen und zu optimieren. Aktuelle Fortschritte im experimentellen Forschungsbereich ermöglichen die Untersuchung der direkten Peptid-Metall-Bindung. Dadurch ist die Erforschung der theoretischen Grundlagen weiter ins Blickfeld aktueller Forschung gerückt. Eine Möglichkeit die Wechselwirkung zwischen Proteinen und anorganischen Oberflächen zu erforschen ist durch Computersimulationen. Obwohl Simulationen von Metalloberflächen oder Proteinen als Einzelsysteme schon länger verbreitet sind, bringt die Simulation einer Kombination beider Systeme neue Schwierigkeiten mit sich. Diese zu überwinden erfordert ein Mehrskalen-Verfahren: Während Proteine als biologische Systeme ausreichend mit klassischer Molekulardynamik beschrieben werden können, bedarf die Beschreibung delokalisierter Elektronen metallischer Systeme eine quantenmechanische Formulierung. Die wichtigste Voraussetzung eines Mehrskalen-Verfahrens ist eine Übereinstimmung der Simulationen auf den verschiedenen Skalen. In dieser Arbeit wird dies durch die Verknüpfung von Simulationen alternierender Skalen erreicht. Diese Arbeit beginnt mit der Untersuchung der Thermodynamik der Benzol-Hydratation mittels klassischer Molekulardynamik. Dann wird die Wechselwirkung zwischen Wasser und den [111]-Metalloberflächen von Gold und Nickel mittels eines Multiskalen-Verfahrens modelliert. In einem weiteren Schritt wird die Adsorbtion des Benzols an Metalloberflächen in wässriger Umgebung studiert. Abschließend wird die Modellierung erweitert und auch die Aminosäuren Alanin und Phenylalanin einbezogen. Dies eröffnet die Möglichkeit realistische Protein- Metall-Systeme in Computersimulationen zu betrachten und auf theoretischer Basis die Wechselwirkung zwischen Peptiden und Oberflächen für jede Art Peptide und Oberfläche vorauszusagen.

RNA-basierte Impfstoffe zur Induktion optimaler Immunantworten

Antigen-kodierende RNA wird als eine sichere und effiziente Alternative zu traditionellen Impfstoff-Formulierungen, wie Peptid-, Protein-, rekombinanten viralen oder DNA basierten Impfstoffen betrachtet. Der endgültige klinische Nutzen RNA-basierter Impfstoffe wird von der Optimierung verschiedener Parameter abhängig sein, die zur Induktion und effizienten Expansion der humoralen und zellvermittelten Immunantwort beitragen. Vor diesem Hintergrund war die Zielsetzung der vorliegenden Arbeit, die Etablierung pharmakologischer und immunologischer Parameter für die Generierung effektiver Immunantworten durch RNA-Impfstoffe sowie deren Wirksamkeit in vitro und im Mausmodell unter Nutzung von Modellantigenen zu testen. Zur Untersuchung und Optimierung der RNA-Pharmakokinetik, als einem Schlüsselaspekt der klinischen Medikamentenentwicklung, wurde der Einfluss von strukturellen Modifikationen auf die Transkriptstabilität und Translationseffizienz von Reporter-Proteinen in einer zeitabhängigen Kinetik evaluiert. Es wurde gezeigt, dass ein poly(A) Schwanz von 120 Adenosinen, verglichen mit einem kürzeren, ein freies 3´ poly(A) Ende, verglichen mit einem verdeckten und eine doppelte β-globin 3´ UTR, unabhängig voneinander zu einer Erhöhung der IVT-RNA Stabilität und zu einer Verbesserung der Translationseffizienz beitrugen und dadurch insgesamt zu einer erhöhten Proteinexpression führten. Antigen-kodierende IVT-RNA mit diesen molekularen Merkmalen in Kombination führte, im Vergleich zur Standard IVT-RNA, zu einer erhöhten Dichte und Stabilität von Peptid/MHC-Komplexen auf der Zelloberfläche transfizierter DCs und dadurch zu einer verbesserten Stimulation von CD4+ und CD8+ T-Zellen im murinen und humanen System. Mit dem Ziel, die RNA kodierte Antigenform für die Induktion einer verstärkten Antikörperantwort zu modifizieren, wurde im zweiten Teil der Arbeit ein Antigen-IgM Fusionskonstrukt hergestellt und hinsichtlich seiner Eignung als neues Impfstoff-Format untersucht. Die Ausgangshypothese, dass die RNA kodierten Antigen-IgM Fusionsproteine polymerisieren, von transfizierten Zellen sezerniert werden und aufgrund der repetitiven Antigenstruktur im Vergleich mit dem monomeren Antigen zu einer Verstärkung der Antikörperantwort führen, wurde in vitro und in vivo im Mausmodell bestätigt. Die Entwicklung und Evaluierung von Zytokinfusionsproteinen zur selektiven Verstärkung der antigenspezifischen Immunantworten bildeten den dritten Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit. Zur weiteren Verstärkung der Antikörperantwort wurde basierend auf den Resultaten aus dem zweiten Teil ein IL2-IgM Fusionskonstrukt hergestellt. Die Ko-Transfektion von Antigen-IgM und IL2-IgM kodierender IVT-RNA führte zu einer signifikant stärkeren Antikörperantwort als die Ko-Transfektion von Antigen-IgM und IL2. Für die Initiierung einer erfolgreichen anti-Tumor-Immunantwort ist das Priming antigenspezifischer T-Zellen essentiell. Um die Effizienz dieses Prozesses zu steigern, wurde ein bifunktionelles IL2-mCD40L Fusionskonstrukt hergestellt und sein Einfluss auf die Effektorfunktion von DCs in vitro und in vivo untersucht. Es wurde gezeigt, dass ein RNA kodiertes IL2-mCD40L Fusionsprotein als genetisches Adjuvanz zu einer Effizienzsteigerung des Priming zytotoxischer T-Zellen führt. Somit wurden in dieser Arbeit durch die Optimierung der Pharmakokinetik, die Modifikation der Antigenform und die Herstellung und Evaluierung von Zytokinfusionskonstrukten als genetische Adjuvantien, RNA-basierte Impfstoffe für eine optimierte Induktion von antigenspezifischen Immunantworten weiter verbessert.

Untersuchungen zur Induktion von Filopodien durch das Amyloid Precursor Like Protein 1 (APLP1), ein Mitglied der APP-Genfamilie

Die Alzheimer Krankheit ist eine fortschreitendende Demenzerkrankung von der in Deutschland ca. 1,6 Millionen Menschen betroffen sind. Im Gehirn der Patienten finden sich sogenannte amyloide Plaques, deren Hauptbestandteil das Aβ-Protein ist. Dieses Peptid ist ein Spaltprodukt des APP-Proteins (engl. amyloid precursor protein). APP ist das namensgebende Mitglied der APP-Proteinfamilie zu der neben APP die beiden APP-Homologen APLP1 und APLP2 (engl. amyloid precursor like protein) gehören. Obwohl inzwischen über die pathologische Rolle dieser Proteinfamilie bei der Alzheimer Krankheit vieles bekannt ist, bleiben die physiologischen Funktionen dieser Proteine bisher größtenteils ungeklärt. Die vorliegende Arbeit beschreibt erstmals einen APLP1-spezifischen Effekt auf die Ausbildung von Filopodien. Sowohl das humane als auch das murine APLP1 induzierten nach transienter Überexpression die Bildung zahlreicher filopodialer Fortsätze auf der Membran von PC12-Zellen. Vergleichbare Resultate konnten mit beiden APLP1-Proteinen auch auf der Membran von embryonalen (E18.5), cortikalen Neuronen der Ratte gezeigt werden. Dass APLP1 einen derartigen Effekt auf Neuronen und PC12-Zellen zeigt, begründet die Annahme, dass APLP1 in vivo eine Funktion bei der Entwicklung und Differenzierung von Neuronen übernimmt. Anhand von Versuchen mit deletierten APLP1-Proteinen und APLP1/APLP2-Chimärproteinen konnte gezeigt werden, dass die von Exon 5 und Exon 6 codierten Bereiche des APLP1 für die Induktion der Filopodien essentiell sind. Unter Einbeziehung von in ihrer räumlichen Struktur bereits bekannten Domänen und aufgrund von Homologievergleichen der primären Aminosäuresequenz dieser Region mit entsprechenden Bereichen der APP- bzw. APLP2-Proteine wurde die wahrscheinliche Lage der Filopodien-induzierenden Domäne innerhalb des von Exon 6 codierten Bereiches diskutiert. Es konnte ferner gezeigt werden, dass die untersuchte Induktion von Filopodien durch die sogenannte α-Sekretierung moduliert werden kann. Unter den gewählten Versuchsbedingungen war nur membranständiges APLP1, nicht aber sekretiertes APLP1 in der Lage, Filopodien zu induzieren. Abschliessend wurden Ergebnisse gezeigt, die erste Einblicke in Signalkaskaden erlauben, die von APLP1 angesteuert werden und so die Enstehung der Filopodien auslösen. Bezüglich des primären Prozesses der Signalkaskade, der Bindung von APLP1 an einen bisher unbekannten Rezeptor, wurde die Möglichkeit diskutiert, ob APP oder APLP2 oder sogar APLP1 selbst als Rezeptor fungieren könnten. Die beobachteten Prozesse nach Überexpression von APLP1 entsprechen vermutlich einer physiologischen Funktion bei der Differenzierung von Neuronen, die mit der Interaktion einer extrazellulär gelegenen Domäne mit einem Rezeptor beginnt, die Aktivierung einer Signalkaskade zur Akrinreorganisation zu Folge hat und die Entstehung filopodialer Strukturen auslöst.

Identifizierung von T-Zell-erkannten Nierenzellkarzinom-Antigenen

Eine Voraussetzung für die Entwicklung neuer immunmodulatorischer Therapieverfahren ist die Kenntnis immunogener Tumorantigene, die von tumorreaktiven T-Zellen erkannt werden. In der vorliegenden Arbeit wurden tumorreaktive CD8+ zytotoxische T-Lymphozyten (CTL, cytotoxic T-lymphocytes) aus dem Blut eines HLA (human leukocyte antigen)-kompatiblen Fremdspenders generiert. Methodisch wurden hierzu CD8-selektionierte periphere Blutlymphozyten repetitiv mit der klarzelligen Nierenzellkarzinomlinie MZ1851-RCC (RCC, renal cell carcinoma) in einer allogenen gemischten Lymphozyten-Tumorzell Kultur (MLTC, mixed lymphocyte tumor cell culture) stimuliert. Aus den Responderlymphozyten wurden mit Hilfe des Grenzverdünnungsverfahrens klonale zytotoxische T-Zellen generiert und expandiert. Die CTL-Klone wurden anschließend phänotypisch mittels Durchflußzytometrie sowie funktionell mittels HLA-Antikörper-Blockadeexperimenten und Kreuzreaktivitätstests detailliert charakterisiert. Dabei konnte gezeigt werden, daß aus dem Blut eines allogenen gesunden Spenders CD8+ T-Zellen isoliert werden können, welche Reaktivität gegen Nierenzellkarzinome (NZK) aufweisen und über verschiedene HLA-Klasse-I-Allele restringiert sind. Die von den einzelnen CTL-Klonen erkannten Zielstrukturen zeigten entweder ubiquitäre (z.B. HLA-Cw*0704-reaktiver CTL-Klon E77) oder eine tumorspezifische (z.B. HLA-B*0702-restringierter CTL-Klon A4) Gewebeexpression. Zur Identifizierung der natürlich prozessierten Peptidliganden wurden die HLA-B/C-Allele unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers B123.2 aus einem zuvor hergestellten Detergenslysat der Nierenzellkarzinomlinie MZ1851-RCC immunchromatographisch aufgereinigt. Aus den so isolierten HLA-Peptid-Komplexen wurden die tumorassoziierten Peptidliganden nach Säureeluation und Filtration abgespalten und über eine „reverse phase“-HPLC (high performance liquid chromatography) fraktioniert. Die Überprüfung der einzelnen HPLC-Fraktionen auf Bioaktivität erfolgte mit den korrespondierenden CTL-Klonen in 51Cr-Zytotoxizitätstests. Dabei wurde eine HPLC-Fraktion identifiziert, die die lytische Funktion des HLA-B*0702-restringierten CTL-Klons A4 auslösen konnte. Die bioaktive HPLC-Fraktion wurde dazu durch eine zweite (second dimension) Kapillar-Flüssigkeitschromatographie (Cap-LC, capillar liquid chromatography) in Subfraktionen geringerer Komplexität aufgetrennt und die darin enthaltenen Peptidepitope durch das MALDI-TOF/TOF (matrix assisted laser desorption/ionization- time of flight/time of flight)-Analyseverfahren sequenziert. Innerhalb dieser HPLC-Fraktion wurden eine Vielzahl von HLA-B/C-assoziierten Peptidliganden erfolgreich sequenziert, was die Effektivität dieser Verfahrenstechnik zur Identifizierung natürlich prozessierter HLA-Klasse-I-bindender Peptide unter Beweis stellt. Leider war es mit dieser Methode bisher nicht möglich, das von CTL-Klon A4 detektierte Peptidepitop zu sequenzieren. Dies liegt möglicherweise in der unzureichenden Konzentration des Peptidepitops in der bioaktiven HPLC-Fraktion begründet. In Folgearbeiten soll nun mit erhöhter Probenmenge beziehungsweise verbesserter Analytik der erneute Versuch unternommen werden, das Zielantigen des CTL-Klons A4 zu identifizieren. Die Kenntnis von Antigenen, die tumorspezifisch exprimiert und von CD8+ CTL aus gesunden Spendern erkannt werden, eröffnet neue therapeutische Möglichkeiten, das spezifische Immunsystem des Stammzellspenders nach allogener Blutstammzelltransplantation gezielt zur Steigerung von Tumorabstoßungsreaktionen (z.B. durch Vakzinierung oder adoptivem T-Zelltransfer) zu nutzen.

Induktion und Analyse spezifischer Immunantworten nach intranodaler Immunisierung mit RNA im murinen Modell

Die Wirksamkeit einer Vakzine ist von vielen Parametern abhängig. Dazu gehören unter anderen: das ausgewählte Antigen, die Formulation in der das Antigen benutzt wird sowie die Applikationsroute. Antigen-kodierende Ribonukleinsäuren (RNA) gilt heutzutage als eine sichere und effiziente Alternative zu traditionellen Impfstoff-Formulierungen, wie Peptiden, rekombinanten Proteinen, viralen Systemen oder DNA basierten Impfstoffen. Bezüglich des Applikationsortes repräsentiert der Lymphknoten ein optimales Milieu für die Interaktion zwischen antigenpräsentierenden Zellen und T-Zellen. Vor diesem Hintergrund war die Zielsetzung dieser Arbeit, ein auf direktem in vivo Transfer von Antigen-kodierender in vitro transkribierter RNA (IVT-RNA) basierendes Impfverfahren zu entwickeln, zu charakterisieren und auf seine anti-tumorale Wirksamkeit zu testen. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass dendritische Zellen (DCs) in vitro hocheffizient mit IVT-RNA transfiziert werden können und eine hohe stimulatorische Kapazität besitzen. Durch Sequenzmodifikation der IVT-RNA konnten wir die Transkriptstabilität und Translationseffizienz erhöhen was zu einer Steigerung der stimulatorischen Kapazität in vivo führte. Darüber hinaus untersuchten wir die Auswirkung der Insertion eines Signalpeptides 5’ sowie einer C-terminalen transmembran- und zytosolischen-Domäne eines MHC-Klasse-I-Moleküls am 3’ der Antigen-kodierenden Sequenz auf die Effizienz der MHC-Klasse-I und -II Präsentation. Wir konnten in vitro und in vivo nachweisen, dass diese Modifikation zu einer gesteigerten, simultanen Stimulation von antigenspezifischen CD4+ und CD8+ T-Zellen führt. Auf der Basis der optimierten Vektorkassetten etablierten wir die intranodale (i.n.) Transfektion von antigenpräsentierenden Zellen in der Maus. Dazu nutzten wir verschiedene Reportersysteme (eGFP-RNA, fluoreszensmarkierte RNA) und konnten zeigen, dass die intranodale Applikation von IVT-RNA zu selektiven Transfektion und Maturation lymphknotenresidenter DCs führt. Zur Untersuchung der immunologischen Effekte wurden in erster Linie auf Influenza-Hemagglutinin-A und Ovalbumin basierende Modellantigensysteme verwendet. Beide Antigene wurden als Antigen-MHC-Fusionskonstrukte genutzt. Als Responderzellen wurden TCR-transgene Lymphozyten verwendet, die MHC-Klasse-I oder -Klasse-II restringierte Epitope des Influenza-Hemagglutinin-A bzw. des Ovalbumin-Proteins erkennen. Wir konnten in vivo zeigen, dass die intranodale Immunisierung mit IVT-RNA zu einer effizienten Stimulation und Expansion von antigenspezifischen CD4+ und CD8+ T-Zellen in einer dosisabhängigen Weise führt. Funktionell konnte gezeigt werden, dass diese T-Zellen Zytokine sezernieren und zur Zytolyse befähigt sind. Wir waren in der Lage durch repetitive i.n. RNA Immunisierung ein ‚Priming’ CD8+ T-Zellen in naiven Mäusen sowohl gegen virale als auch gegen Tumor assoziierte Antigene zu erreichen. Die geprimten T-Zellen waren befähigt eine zytolytische Aktivität gegen mit spezifischem Peptid beladene Targetzellen zu generieren. Darüber hinaus waren wir in der Lage Gedächtnisszellen expandieren zu können. Abschließend konnten wir in Tumormodellen sowohl in prophylaktischen als auch in therapeutischen Experimenten zeigen dass die i.n. RNA Vakzination die Potenz zur Induktion einer anti-tumoralen Immunität besitzt.

Analysis of the influence of epitope flanking regions on MHC class I restricted antigen presentation

Peptides presented by MHC class I molecules for CTL recognition are derived mainly from cytosolic proteins. For antigen presentation on the cell surface, epitopes require correct processing by cytosolic and ER proteases, efficient TAP transport and MHC class I binding affinity. The efficiency of epitope generation depends not only on the epitope itself, but also on its flanking regions. In this project, the influence of the C-terminal region of the model epitope SIINFEKL (S8L) from chicken ovalbumin (aa 257-264) on antigen processing has been investigated. S8L is a well characterized epitope presented on the murine MHC class I molecule, H-2Kb. The Flp-In 293Kb cell line was transfected with different constructs each enabling the expression of the S8L sequence with different defined C-terminal flanking regions. The constructs differed at the two first C-terminal positions after the S8L epitope, so called P1’ and P2’. At these sites, all 20 amino acids were exchanged consecutively and tested for their influence on H-2Kb/S8L presentation on the cell surface of the Flp-In 293Kb cells. The detection of this complex was performed by immunostaining and flow cytometry. The prevailing assumption is that proteasomal cleavages are exclusively responsible for the generation of the final C-termini of CTL epitopes. Nevertheless, recent publications showed that TPPII (tripeptidyl peptidase II) is required for the generation of the correct C-terminus of the HLA-A3-restricted HIV epitope Nef(73-82). With this background, the dependence of the S8L generation on proteasomal cleavage of the designed constructs was characterized using proteasomal inhibitors. The results obtained indicate that it is crucial for proteasomal cleavage, which amino acid is flanking the C-terminus of an epitope. Furthermore, partially proteasome independent S8L generation from specific S8L-precursor peptides was observed. Hence, the possibility of other existing endo- or carboxy-peptidases in the cytosol that could be involved in the correct trimming of the C-terminus of antigenic peptides for MHC class I presentation was investigated, performing specific knockdowns and using inhibitors against the target peptidases. In parallel, a purification strategy to identify the novel peptidase was established. The purified peaks showing an endopeptidase activity were further analyzed by mass spectrometry and some potential peptidases (like e.g. Lon) were identified, which have to be further characterized.

Die Identifizierung und Charakterisierung von HLA-Klasse-I-restringierten Minorhistokompatibilitätsantigenen und Leukämie-assoziierten Antigenen mittels cDNA-Expressionsklonierung

Die allogene hämatopoetische Stammzelltransplantation (allo-HSCT) bietet bei einem hohen Anteil akuter Leukämien die einzige kurative Behandlungsmöglichkeit. Um die mit ihr assoziierte Morbidität und Mortalität zu senken und ihre Effektivität zu steigern, soll die GvL (graft-versus-leukemia)-Reaktion als eigentliches Therapieziel gegenüber der unerwünschten GvHD (graft-versus-host disease) möglichst selektiv verstärkt werden. Wesentliche Mediatoren beider Effekte sind alloreaktive T-Zellen. Bei HLA-Übereinstimmung zwischen Spender und Empfänger sind so genannte Minorhistokompatibilitätsantigene (mHAgs) und Leukämie-assoziierte Antigene (LAA) die mutmaßlichen Zielstrukturen beider Reaktionen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden in dem Leukämie-Modell der Patientin MZ201 [akute myeloische Leukämie (AML) vom Subtyp FAB M5] mittels T-Zell-basierter cDNA-Expressionsklonierung zwei neue Antigene identifiziert, die von allogenen, AML-reaktiven CD8+ T-Lymphozyten aus Blut eines HLA-passenden gesunden Spenders erkannt wurden. Es handelt sich zum einen um das HLA-B*5601-restringierte mHAg PLAUR-317P, das aus einem Polymorphismus des Gens PLAUR (plasminogen activator, urokinase receptor) resultiert. Das von den T-Zellen am Besten erkannte Peptid enthält die Aminosäuren 316 - 327. PLAUR wird in lymphohämatopoetischen Zellen und in verschiedenen Malignomen überexprimiert und ist dabei mit schlechterer Prognose und vermehrter Gewebeinvasivität assoziiert. Etwa 30% getesteter Individuen tragen das Allel PLAUR-317P. Zum anderen handelt es sich um ein Epitop aus der Signalregion des Chemokins CXCL3 [chemokine (C-X-C motif) ligand 3], das von CD8+ T-Zellen des gleichen Spenders auf Leukämiezellen der Patientin MZ201 in Assoziation mit HLA-A*0201 erkannt wurde. Auch CXCL3 wird vorwiegend in Zellen der Myelopoese exprimiert. Aufgrund ihres Expressionsmusters sind beide Antigene potentielle Zielstrukturen für die Elimination der Empfänger-Hämatopoese unter Einschluss der Leukämieblasten im Rahmen der allo-HSCT. Weiterführende Untersuchungen müssen zeigen, ob diese Antigene tatsächlich in vivo GvL-Reaktionen hervorrufen. Die Kenntnis eines repräsentativen Spektrums solcher Antigene würde verbesserte Spenderselektionen erlauben und neue Wege des adoptiven T-Zelltransfers erschließen helfen.

Identifizierung und Charakterisierung neuer Proteine des Abwehrsystems der Porifera - ein Apoptoseregulator und ein antimikrobielles Protein aus dem Schwamm Suberites domuncula

Aufgrund ihrer Lebensweise und -umgebung sind effiziente Strategien zur Abwehr bedrohender Einflüsse essentiell für die Porifera. Eine dieser Strategien stellen die Apoptose in höheren Metazoen, sowie ein effizientes Immunsystem dar. Diese sichern sowohl das Überleben des Organismus als auch die Entfernung beschädigter, infizierter oder redundanter Zellen. Bei Untersuchungen der Porifera auf Moleküle, die an diesen Prozessen beteiligt sind, konnten in den letzten Jahren beachtliche Erfolge erzielt werden. So konnten das in der Apoptose involvierte Protein GCDD2 (proapoptotisch), die antiapoptotischen GCBHP1 und GCBHP2 Proteine (Wiens et al., 2001), sowie ein LPS induzierbarer TNF (Wiens et al., 2007) und zwei Caspasen (Wiens et al., 2003) in Schwämmen identifiziert werden. Um diese essentiellen Mechanismen besser verstehen zu können, sollte ein möglicher Tumor-Nekrose-Faktor-Rezeptor identifiziert werden. Hierzu wurde die SpongeBase Datenbank nach Proteinen mit Todesdomänen durchsucht und diese unter Anwendung von PCR- und Screening-Techniken in einer cDNA-Bank des marinen Schwammes S. domuncula komplettiert. Im Anschluss an ihre Sequenzierung wurde ein Klon ausgewählt, dessen Todesdomäne größte Homologie zu einem TNFR zeigte. Dieser Klon SD_TNFR-like (Suberites domuncula TNFR-homologes Protein) wurde anschließend diversen Sequenz- und Strukturanalysen unterzogen. Diese offenbarten die Existenz zweier funktional bedeutsamer Domänen (Ubiquitin-like und Todesdomäne). Vor allem die Todesdomäne impliziert eine Beteiligung des Proteins an apoptotischen Prozessen. Über einen „Yeast Two Hybrid Screen“ sollten Proteine identifiziert werden, welche mit dem Ausgangsprotein interagieren. Hierbei wurde ein Protein identifiziert, das Ähnlichkeit mit einem antimikrobiellen Peptid aufweist. Dieses Protein kann analog zu einer Gruppe von antimikrobiellen Peptiden, den α-helikalen kationischen Peptiden, in drei Teile gespalten werden. Das Signalpeptid sowie ein anionisches Propeptid werden abgespalten und es entsteht ein kationisches, antimykotisch wirksames Peptid. Beide Proteine sollten, sofern sie in die Abwehrreaktionen involviert sind, durch Inkubation mit mikrobiellen Strukturen vermehrt exprimiert werden. Eine Überprüfung der Transkription mittels Northern Blot Analysen bestätigte dies für das SD_TNFR-like nach Inkubation mit LPS und TNF- α sowie für SD_Brevinin-like nach Inkubation mit LPS, PAM und Hefe. Mit der Herstellung eines rekombinanten SD_TNFR-like-Proteins wurde die Immunisierung von Kaninchen und die folgende Gewinnung eines polyklonalen SD_TNFR-like-Antikörpers ermöglicht. Dieser gestattete den Nachweis der SD_TNFR-like -Expression mittels Western Blot-Analysen sowie die stressinduzierte erhöhte Expression mittels Dot Blot-Analysen auch auf Proteinebene. Um die Funktion des SD_TNFR-like Proteins zu charakterisierten, wurde ein Test mit RAW-Blue™-Zellen durchgeführt. Die Ergebnisse implizieren, dass das Protein Teil der Immunreaktion analog der der TLR- bzw. NLR- Reaktion ist. Auch die Interaktion mit einem antimikrobiellen Protein, welches für das Überleben des Organismus und die Bekämpfung der Mikroorganismen sorgt, deutet auf eine solche Beteiligung hin. Zusätzlich wird diese These durch ein Ergebnis der Strukturanalysen unterstützt, nämlich die Identifizierung einer TRAF2 Bindestelle. TRAF2 ist ein Adapterprotein der TNFR und aktiviert Überlebensfaktoren über den NF - B-Weg. Immunohistochemische Analysen zeigten, dass das SD_TNFR-like Protein im Organismus vor allem um die Bakteriozysten, um verschiedene Mikroorganismen und am Rand des Schwammes exprimiert wird, was ebenfalls für eine immunologische Funktionsweise spricht. Auch im restlichen Gewebe wird es kontinuierlich, auch ohne vorherige LPS Inkubation exprimiert. Diese Akkumulation zeigt deutlich, dass das Protein in einen Schutzmechanismus gegen äußere Bedrohungen involviert ist. Es scheint dabei direkt an den eindringenden Mikroorganismen zu wirken. Das SD_TNFR-like ist demnach ein potentieller Bestandteil der Immunantwort des Schwammes, welches Apoptose verhindern und Überlebensmechanismen aktivieren kann. Das SD_Brevinin-like Protein besitzt antimykotische Aktivität, wie in einem antimikrobiellen Test gezeigt werden konnte. Weiterhin scheint es für das SD_TNFR-like Protein als positiver bzw. negativer Regulator von Bedeutung zu sein, der eine Reaktion entweder beendet oder die Expression von Überlebensfaktoren verstärkt. Die in dieser Arbeit präsentierten Ergebnisse und Schlussfolgerungen demonstrieren somit die Identifizierung eines neuen Schwammproteins, welches eine Rolle in der Immunantwort spielt, sowie eines neuen antimikrobiellen Peptids, welches die Wirkung des TNFR-like moduliert. Es müssen jedoch noch weitere Funktionsanalysen folgen, um den Mechanismus des SD_TNFR-like Proteins und seine Regulation genauer charakterisieren zu können

Sequence-controlled synthesis of soluble oligo(p-benzamide)s

This work focused on the synthesis of novel monomers for the design of a series of oligo(p-benzamide)s following two approaches: iterative solution synthesis and automated solid phase protocols. These approaches present a useful method to the sequence-controlled synthesis of side-chain and main-chain functionalized oligomers for the preparation of an immense variety of nanoscaffolds. The challenge in the synthesis of such materials was their modification, while maintaining the characteristic properties (physical-chemical properties, shape persistence and anisotropy). The strategy for the preparation of predictable superstructures was devote to the selective control of noncovalent interactions, monodispersity and monomer sequence. In addition to this, the structure-properties correlation of the prepared rod-like soluble materials was pointed. The first approach involved the solution-based aramide synthesis via introduction of 2,4-dimethoxybenzyl N-amide protective group via an iterative synthetic strategy The second approach focused on the implementation of the salicylic acid scaffold to introduce substituents on the aromatic backbone for the stabilization of the OPBA-rotamers. The prepared oligomers were analyzed regarding their solubility and aggregation properties by systematically changing the degree of rotational freedom of the amide bonds, side chain polarity, monomer sequence and degree of oligomerization. The syntheses were performed on a modified commercial peptide synthesizer using a combination of fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) and aramide chemistry. The automated synthesis allowed the preparation of aramides with potential applications as nanoscaffolds in supramolecular chemistry, e.g. comb-like-

Evaluation der Leukämie-Reaktivität von PRAME- und p53-spezifischen T-Zellen bei lymphohämatopoetischen Neoplasien im Rahmen einer adoptiven Immuntherapie

Der Transplantat-gegen-Leukämie (GVL) Effekt als immuntherapeutisches Mittel bei der allogenen hämatopoetischen Stammzell Transplantation (HSZT) ist hauptsächlich durch Spender Lymphozyten vermittelt, welche hämatopoetische Minor-Histokompatibilitäts Antigene bzw. Leukämie-assoziierte Antigene (z. B.: PRAME, p53) erkennen. Der adoptive Transfer von Leukämie-spezifischen T-Zellen kann den GVL-Effekt, ohne ein Auftreten einer Transplantat-gegen-Wirt Erkrankung (GVHD), steigern. Unter Verwendung von HLA-A2 und human CD8 transgenen Mäusen (CD8yCyA2Kb) konnten in dieser Arbeit PRAME spezifische CD8+ zytotoxischen T-Zellen generiert werden. Diese zytotoxischen CD8+ T-Zellen zeigten in Chromfreisetzungsuntersuchungen lytische Aktivität gegen eine Vielzahl von Zelllinien, die PRAME endogen prozessieren sowie gegen das spezifische PRAME-Peptid. Des Weiteren wurden die hier generierten T-Zellen auf ihre zytotoxische Aktivität gegen akute myeloische Leukämie Blasten hin untersucht, und diese Untersuchungen zeigten AML-Reaktivität der PRAME-spezifischen sowie der als Vergleich genutzten p53- und HLA-A2-spezifischen T-Zellen. Das Potenzial der PRAME-spezifischen ZTL die GVL-Immunität in vivo zu erhöhen ohne das Vorkommen einer GVHD wurde in einem Tumor-Protektions-Model unter der Nutzung von NOD/SCIDgcnull Mäusen untersucht. Die PRA100- bzw. p53-ZTL wurden adoptiv in NOD/SCIDgcnull Rezipienten transferiert und gleichzeitig wurden die Tiere mit PRAME-, oder p53-exprimierende Tumorzelllinien inokuliert. Die Reduktion des Tumorwachstums bestätigte die Spezifität der T-Zellen auch in vivo. In weiteren in vivo Experimenten wurden NOD/SCIDgcnull Mäuse mit AML-Blasten rekonstituiert. Durch die Applikation von nur CD34 positiven Zellen aus einer AML-Probe, oder einer CD56 depletierten Probe, konnten Rekonstitutionen in 95 % aller Versuche erfolgreich beendet werden. Wurde eine Rekonstitution mittels PCR- und FACS-Analysen diagnostiziert, so folgten mehrere Applikationen der PRAME- oder p53-spezifischen ZTL. In diesen Untersuchungen konnten wir in einem therapeutischen AML-in vivo-Modell zeigen, dass die in diesen Untersuchungen generierten/verwandten ZTL in der Lage sind AML-Blasten in vivo zu bekämpfen und so die leukämische Last der Tiere im Blut sowie in der Milz auf unter 1 % zu regulieren. Der prozentuale Anteil humaner AML Zellen im Knochenmark konnte deutlich gesenkt werden (< 10 %). Zusammenfassend sind die von uns generierten PRAME-spezifischen T-Zellen in der Lage, in vitro und auch in vivo, endogen prozessiertes Protein auf Zelllinien und AML-Blasten zu erkennen und zu lysieren. Auch die p53-ZTL, welche als eine weitere Antigen-spezifische ZTL-Population in vivo getestet wurden, zeigten GVL-Effekte. Die Kenntnis von Tumor- bzw. Leukämie assoziierten Antigenen und die daraus erwachsene Möglichkeit der Generierung krankheitsspezifischer ZTL bietet die Grundlage für eine spezifische Immuntherapie maligner Erkrankungen.

Charakterisierung der biologischen Funktion der Plasmodium falciparum Calcium-abhängigen Proteinkinase 1

Im Rahmen dieser Arbeit wurden biologische Funktionen einer Proteinkinase des Erregers der Malaria tropica, genauer der „Plasmodium falciparum calcium dependent protein kinase 1“ (PfCDPK1), in parasitären Blutstadien untersucht.rnUm Einblicke in die Funktion der Kinase, die sie in den extrazellulären Kompartimenten des Parasiten übernimmt, zu gewinnen, wurden sechs Proteine untersucht, die dasselbe Translokationsignal wie PfCDPK1 besitzen. Es konnte gezeigt werden, dass fünf der untersuchten Proteine mit der PfCDPK1 im Bereich der parasitophoren Vakuole sowie des tubovesikulären Systems co-lokalisiert sind. Deletionsmutanten, denen das Translokationssignal fehlte, sowie ein Peptid, das lediglich aus diesem bestand, bestätigten, dass die Translokation in die extrazellulären Kompartimente von keinen weiteren Faktoren, außer dem Signalmotiv abhängt. Mit PfCAP und PfRKIP konnten zwei Regulatoren der PfCDPK1 identifiziert werden. PfARM, Pfrab_5b sowie PfGAP45 sind Substrate der PfCDPK1. Mit Hilfe von massenspektrometrischen Messungen wurde der Phosphorylierungsstatus der untersuchten Proteine durch die PfCDPK1 sowie der Autophosphorylierungsstatus der Kinase bestimmt, um Rückschlüsse auf regulatorische Prozesse ziehen zu können.rnDie Phosphorylierung von PfGAP45 durch die PfCDPK1 steht vermutlich mit dem Invasionsprozess des Parasiten in direktem Zusammenhang, da gezeigt wurde, dass eine Hemmung der Kinase mit PP1 einen 90%igen Rückgang an neu infizierten Erythrozyten zur Folge hatte.rnrn