Rolle von NFATc2 in einem murinen Asthmamodell

Nuclear factor of activated T cells (NFAT) ist eine Familie der Transkriptionsfaktoren, welche eine wichtige Rolle bei der Regulation der T-Zellvermittelten Signalkaskade in der Lymphozytenpopulation spielt. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Nuclear Factor of Activated T cells-2 (NFATc2) defiziente M��use einen erh��hten Atemwegswiderstand, einen pathologische Ver��nderung der Lunge und einen erh��hten IgE Spiegel im Vergleich zu den Wildtypen vorweisen. Die NFATc2 Defizienz konnte ebenfalls sowohl mit einer erh��hten Anzahl an Th2 und Th17 Zellen, die eine erh��hte Proliferation vorweisen, als auch einer erniedrigten Anzahl an CD8+ CD122- T-Zellen, die geringere Mengen an IFN-g produzieren, in Verbindung gebracht werden. Die aus den NFATc2(-/-) M��usen isolierten CD4+ T-Zellen zeigen im Vergleich zu denen der Wildtypen neben der erh��hten Proliferation einen vermehrte Aktivierung (CD4higCD44highCD69high). Weiterhin konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass in Anwesenheit eines Allergens, die NFATc2(-/-) M��use eine erh��hte Anzahl an regulatorischen T-Zellen (CD4+CD25+Foxp3+GITR++) in der Lunge vorweisen, die wiederum die Effektorzellen in diesen hemmen. Ein Grund f��r die geringere Freisetzung an IFN-g durch die CD8+ T-Zellen in den NFATc2 defizienten M��usen ist eine erh��hte Subpopulation von CD8+CD122+ (IL-2Rb Kette) CD127hi (IL-7Ra Kette) ���long-lived memory Zellen��� in den NFATc2(-/-) M��usen. Diese besitzen einen regulatorischen Effekt, so dass immundefiziente SCID M��use, die in einem adoptiven Transfer mit OVA-spezifischen CD8+ und CD4+ T-Zellen, welchen aus NFATc2(-/-) M��use isoliert werden, behandelt wurden, eine erh��hten Atemwegswiderstand, eine erh��hte IL-17 und eine erniedrigte IFN-g Produktion vorweisen. Eine Depletion der memory CD8+CD122+IL-7Rhigh T-Zellen hebt dagegen die verringerte IFN-g Produktion der CD8+CD122- T-Zellen auf und f��hrt zu einer Erniedrigung des Atemwegswiderstandes in einem SCID Model Zusammenfassend zeigen unsere Untersuchungen, dass sowohl die IFN-g Produktion der CD8+ Effektor T-Zellen als auch die Anzahl an CD4+CD25+Foxp3+GITR++ regulatorischen T-Zellen die Entwicklung der Th2 und Th17 als auch die H��he des Atemwegswiderstandes unterdr��ckt.

Host immune response in immunodeficient mice against infection with Cryptosporidium parvum

Immunantwort von immundefizienten M��usen gegen��ber Infektionen mit Cryptosporidium parvum. Cryptosporidium parvum ist ein intrazellul��rer, protozoischer Krankheitserreger, der im immunkompromittierten Wirt zu lebensbedrohender Enteritis f��hren kann. CD4+ T-Zellen und Interferon (IFN)-�� spielen wesentliche Rollen bei der Wirtsimmunantwort gegen die Infektion. Dennoch sind die Effektormechanismen, die zur Resistenz f��hren nur wenig verstanden. In dieser Studie wurde die Immunantwort von IFN-��- und Interleukin (IL)-12-Defektm��usen parallel zu Wildtypm��usen analysiert. Die Ergebnisse identifizierten IFN-�� als Schl��sselzytokin bei der nat��rlichen und erworbenen Immunit��t w��hrend der Erst- und Folgeinfektion mit C. parvum. Tumornekrosefaktor (TNF)-�� ist m��glicherweise ein Induktor der fr��hen IFN-��-Antwort in IL-12 Knockout-M��usen. Weiterhin tragen offenbar sowohl Th1- als auch Th2-Zytokine zur ��berwindung der Prim��rinfektion bei, die ersten mehr als die letztgenannten. Zytokingene waren am Ort der Infektion (Ileum) dramatisch ver��ndert, nicht aber in den lokalen Lymphknoten und der Milz. Nach Folgeinfektion ergab sich in Abwesenheit von IFN-�� eine signifikante Erh��hung der Th2-Zytokine IL-5 and IL-13. Die Ergebnisse zeigten weiterhin, dass das Th1-Zytokin IL-18 zur Resistenz gegen��ber C. parvum beitr��gt, m��glicherweise durch verschiedene Immunfunktionen, wie der Regulation von Serum-IFN-�� w��hrend der Infektion und/oder der Erhaltung der Homeostase der Th1/Th2-Zytokine durch Regulation der Th2-Zytokine. Weiterhin zeigten diese Untersuchungen den Transfer von Resistenz gegen��ber C. parvum von infizierten auf na��ve M��use mittels stimulierter intraepithelialer Lymphozyten und CD4+ T-Zellen. Diese Ergebnisse weisen auf die Gegenwart von C. parvum-spezifischen CD4+ T-Zellen in anderen lymphatischen Geweben neben der Darmmukosa hin. Eine Stimulation der Spendertiere durch Infektion war notwendig f��r eine ��bertragbare sch��tzende Immunit��t. Dennoch konnte die ��bertragene Immunit��t nicht die Infektion der Empf��ngertiere vollst��ndig verhindern; eine Verdopplung der Spenderzellen f��hrte zu keinem besseren Ergebnis. Weiterhin ergab der Transfer von CD4+ und CD8+ T-Zellen (Pan-T-Zellen) keinen erh��hten Schutz der naiven Empf��ngertiere als der alleinige Transfer von CD4+ T-Zellen. Dies weist auf die fehlende Bedeutung der CD8+ T-Zellen beim Schutz vor C. parvum-Infektion hin.

Die Rolle CD4 + CD25 + regulatorischer T-Zellen in der Niedrigzonentoleranz gegen��ber Kontaktallergenen

Die allergische Kontaktdermatitis ist eine der h��ufigsten Berufserkrankungen, die durch die Exposition mit hohen Mengen eines Kontaktallergens ausgel��st wird. In Mausmodellen sehen wir, dass mittels einer Niedrigzonentoleranz (NZT) die Bildung einer Kontaktsensibilisierung unterdr��ckt werden kann. Bei der NZT f��hrt die epikutane Applikation von subimmunogenen Dosen zu einer systemischen Toleranzentwicklung, die durch CD8+ Suppressor-T-Zellen Hapten-spezifisch vermittelt wird. F��r die Generierung dieser CD8+ Suppressor-T-Zellen sind IL-10-sezernierende CD4+ regulatorischen T-Zellen (Tregs) notwendig. Aufbauend auf diesen Ergebnissen sollte in dieser Arbeit ��berpr��ft werden, ob nat��rlichen Tregs (nTregs) bei der NZT eine Rolle spielen und die Funktion und Aufgaben dieser Zellen w��hrend der NZT untersucht werden. rnWir konnten keine erh��hte Anzahl von nTregs w��hrend der Niedrigzonentoleranz gegen��ber Kontaktallergenen im Vergleich zur CHS charakterisieren. Weiterhin haben wir gezeigt, dass eine Reduktion der nTregs durch Depletion mittels anti-CD25-Anik��rper oder durch Cyclophosphamid-Gabe die Entstehung der CD8+ Suppressor-T-Zellen der NZT unterdr��ckt und damit die Entwicklung der Toleranzreaktion verhindert wird. Ferner wurde beobachtet, dass eine epikutane NZT Hapten-spezifisch durch CD8+ T-Zellen ��bertragen werden kann, w��hrend CD4+CD25+ T-Zellen eine Hapten-unspezifische Wirkung zeigten.rn

Die Rolle der Ubiquitin-Ligase Smurf2 in T-Lymphozyten bei der Entwicklung von chronisch entz��ndlichen Darmerkrankungen

TGF-beta ist ein Schl��sselmolek��l zellvermittelter Immuntoleranz. So spielt es neben seiner pleiotropen Rolle in Immunzellen auch bei der Tumorentwicklung eine gro��e Rolle. Das TGF-beta hat bei der Tumorentwicklung eine duale Rolle. So dient es in fr��hen Phasen als Tumorsuppressor, w��hrenddessen es in sp��ten Phasen der Entwicklung als Tumorpromotor wirkt. Eine strikte Regulation des TGF-beta Signalweges ist daher f��r ein funktionierendes Immunsystem von essentieller Bedeutung. Die Ubiquitin Ligase Smurf2 ist dabei ein wichtiger negativ Regulator des TGF-beta Signalweges.In der vorliegenden Arbeit konnte eine neue Splei��form des Smurf2 (dE2Smurf2) aus murinen CD4+ T-Zellen isoliert werden, deren Funktion in vitro und in vivo in T-Lymphozyten untersucht worden ist. F��r diese Splei��form konnte zudem eine humane Relevanz nachgewiesen werden. Mit Hilfe von ��berexpressionen in Cos7 Zellen konnte eine ver��nderte Lokalisation der Smurf2 Splei��formen (WT und dE2) festgestellt werden. Dabei konnten lysosomale und endosomale Kompartimente bei der Kolokalisation mit dem dE2Smurf2 Konstrukt beobachtet werden. Das Splei��en des Exons2 f��hrte dabei zu ��nderungen der Topologie der N-terminalen C2-Dom��ne, wodurch sich eine ver��nderte Lokalisation in der Zelle beschreiben lie��. Mit der ver��nderten intrazellul��ren Verteilung erfuhr auch die Funktion der dE2Smurf2 Ubiquitin Ligase eine ��nderung. So konnte ��berraschenderweise eine positive Signalinduktion des TGF-beta Signalweges beobachtet werden, was im Gegensatz zum beschriebenen WTSmurf2 stand. Durch eine ��berexpression des dE2Smurf2 Proteins in T-Lymphozyten wurde der TGF-beta Signalweg in CD4+ und CD8+ Zellen positiv reguliert, dabei wurde der TGFbetaRII vermehrt exprimiert und gleichzeitig fand eine verst��rkte Phosphorylierung der Transkriptionsfaktoren Smad2 und Smad3 nach TGF-beta Stimulation statt. Die transgenen T-Lymphozyten waren somit sensitiver gegen��ber TGF-beta. Dies f��hrte zur Hypothese, die durch Western Blot Analyse best��tigt werden konnte, da�� das dE2Smurf2 nach ��berexpression seine WT-Form bindet und dadurch degradiert. Die Degradation der Ubiquitin Ligase war dabei Smad7 abh��ngig. Zur Analyse des Einflusses der Ubiquitin Ligase dE2Smurf2 auf die Differenzierung von CD4+ T-Zellen, sowie ihre Rolle bei der T-Zell Proliferation, konnte gezeigt werden, da�� durch die h��here Sensitivit��t gegen��ber TGF-beta naive T-Zellen unter Einflu�� von TGF-beta und IL6 vermehrt in TH17 Zellen differenzierten. Zudem konnte gezeigt werden, da�� die Proliferationsrate transgener naiver CD4+ T-Zellen bei geringen Mengen von TGF-beta starkt vermindert war. Weiterhin konnte gezeigt werden, da�� bei einer Differenzierung der naiven CD4+ T-Zellen in TH1 Zellen, diese signifkant weniger das proinflammatorische Zytokin INF�� produzierten.So zeigten in vivo Versuche, da�� die transgenen Tiere in der Entwicklung von Kolorektalen Karzinomen protektiert waren. Sowohl im kolitisassiziierten Tumor Modell als auch bei der spontanen Entwicklung von Tumoren im APCmin Modell. Dies konnte zum einen auf eine deutlich verminderte Entz��ndung (geringere Produktion an Zytokinen durch verminderte Proliferation) des Darms und zum anderen durch eine st��rkere Produktion an zytotoxischen Genen, wie Perforin, INF�� und Granzym B erkl��rt werden. Interessanterweise konnte jedoch im Transfer Kolitis Modell eher eine proinflammatorische Wirkung des dE2Smurf2 Proteins nachgewiesen werden. So wiesen die immundefizienten M��use, in denen die transgenen T-Zellen injiziert wurden, eine signifikant st��rkere Kolitis auf als die Kontrollen. Dies konnte mit einer ��berproduktion an IL17 sezernierenden T-Zellen erkl��rt werden. Klonierungsexperimente f��hrten zudem zur Identifikation einer bisher nicht beschriebenen nicht kodierenden RNA. Diese zeigte in Kombination mit dem dE2Smurf2 Protein in einer Reportergen Analyse eine Hyperaktivierung des Smad3 Promotors. Diese Daten liefern zum einen ein genaueres Modell ��ber die Regulation des TGF-beta Signalweges sowie wichtige Erkenntnisse zur Pathophysiologie chronisch entz��ndlicher Darmerkrankung und daraus resultierende Tumorerkrankungen. So entwickelt sich das dE2Smurf2, Teil des TGF-beta Signalweges, als attraktives Zielprotein f��r die Modulation von chronisch entz��ndlichen Darmerkrankungen und (kolitisassoziierte) Kolonkarzinomen.

Studying MHC I-dependent CD8 + T cell responses in the model of murine cutaneous leishmaniasis

Der Ausheilung von Infektionen mit Leishmania major liegt die Sekretion von IFN-��� von sowohl CD4+ als auch CD8+ T Zellen zugrunde.rnAktuell konnte in der Literatur nur ein Epitop aus dem parasit��ren LACK Protein f��r eine effektive CD4+ T Zell-vermittelte Immunantwort beschrieben werden. Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand daher darin, m��gliche MHC I abh��ngige CD8+ T Zell Antworten zu untersuchen. rnF��r diesen Ansatz wurde als erstes der Effekt einer Vakzinierung mit LACK Protein fusioniert an die Protein-Transduktionsdom��ne des HIV-1 (TAT) analysiert. Die Effektivit��t von TAT-LACK gegen��ber CD8+ T Zellen wurde mittels in vivo Protein-Vakzinierung von resistenten C57BL/6 M��usen in Depletions-Experimenten gezeigt.rnDie Prozessierung von Proteinen vor der Pr��sentation immunogener Peptide gegen��ber T Zellen ist unbedingt erforderlich. Daher wurde in dieser Arbeit die Rolle des IFN-���-induzierbaren Immunoproteasoms bei der Prozessierung von parasit��ren Proteinen und Pr��sentation von Peptiden gebunden an MHC I Molek��le durch in vivo und in vitro Experimente untersucht. Es konnte in dieser Arbeit eine Immunoproteasom-unabh��ngige Prozessierung aufgezeigt werden.rnWeiterhin wurde Parasitenlysat (SLA) von sowohl Promastigoten als auch Amastigoten fraktioniert. In weiterf��hrenden Experimenten k��nnen diese Fraktionen auf immunodominante Proteine/Peptide hin untersucht werden. rnLetztlich wurden Epitop-Vorhersagen f��r CD8+ T Zellen mittels computergest��tzer Software von beiden parasit��ren Lebensformen durchgef��hrt. 300 dieser Epitope wurden synthetisiert und werden in weiterf��hrenden Experimenten zur Charakterisierung immunogener Eigenschaften weiter verwendet. rnIn ihrer Gesamtheit tr��gt die vorliegende Arbeit wesentlich zum Verst��ndnis ��ber die komplexen Mechanismen der Prozessierung und letztendlich zur Identifikation von m��glichen CD8+ T Zell Epitopen bei. Ein detailiertes Verst��ndnis der Prozessierung von CD8+ T Zell Epitopen von Leishmania major ��ber den MHC Klasse I Weg ist von h��chster Bedeutung. Die Charakterisierung sowie die Identifikation dieser Peptide wird einen ma��geblichen Einfluss auf die weiteren Entwicklungen von Vakzinen gegen diesen bedeutenden human-pathogenen Parasiten mit sich bringen. rn

Untersuchungen der Aktivierungs- und Effektorwege von T-Helferzellen in der Pathogenese vaskul��rer inflammatorischer Prozesse

T-Zellen sind an der Induktion und Erhaltung chronischer Entz��ndungen ma��geblich beteiligt. Im Bereich kardiovaskul��rer Erkrankungen konnte eine Beteiligung von T-Zellen an der Entstehung von Ateriosklerose, Bluthochdruck und arterieller Thrombose aufgezeigt werden. Allerdings sind sowohl die Mechanismen ihrer Aktivierung, als auch die f��r die Entstehung und Persistenz vaskul��rer Entz��ndung relevanten Effektorfunktionen weitgehend unbekannt. rnIn der vorliegenden Arbeit konnte erstmals in zwei Mausmodellen gezeigt werden, dass sowohl die dem Bluthochdruck zugrundeliegende Entz��ndung der Arterienw��nde als auch die durch ven��se Thrombose ausgel��ste Entz��ndung der Venenwand zu einer selektiven Einwanderung von CD4+ und CD8+ T-Zellen mit einem Effektor-Ged��chtniszell-Ph��notyp f��hrt. Mit Hilfe von Nur77-GFP-transgenen M��usen konnte gezeigt werden, dass die in die entz��ndeten Gef����w��nde eingewanderten T-Zellen lokal T-Zell-Rezeptor-unabh��ngig aktiviert werden.rnBluthochdruck und ven��se Thrombose sind durch eine verst��rkte Expression eines ��hnlichen Musters an Zytokinen und Chemokinen in den Gef����w��nden begleitet, das in rekombinanter Form in einem Teil der Effektor-T-Ged��chtniszellen die Bildung von IFN-�� ausl��st. Die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse weisen erstmals eine Beteiligung von T-Zellen an der Entz��ndung der Venenwand im Rahmen einer ven��sen Thrombose nach. Des Weiteren konnten erstmals Hinweise darauf gefunden werden, dass T-Zellen Gef����entz��ndungen durch eine Zytokin-induzierte IFN-��-Bildung erhalten und verst��rken.rn

Improving adoptive T cell therapies of cancer by ectopic expression of miR181a to repress inhibitory phosphatases

Adoptive T cell therapy using antigen-specific T lymphocytes is a powerful immunotherapeutic approach against cancer. Nevertheless, many T cells against tumor-antigens exhibit only weak anti-tumoral response. To overcome this barrier it is necessary to improve the potency and anti-tumoral efficacy of these T cells. Activation and activity of T cells are tightly controlled to inhibit unwanted T cell responses and to reduce the risk of autoimmunity. Both are regulated by extrinsic signals and intrinsic mechanisms which suppress T cell activation. The intrinsic mechanisms include the expression of phosphatases that counteract the activation-inducing kinases. Modifying the expression of these phosphatases allows the targeted modulation of T cell reactivity. MicroRNAs (miRNAs) are regulatory small noncoding RNA molecules that control gene expression by targeting messenger RNAs in a sequence specific manner. Gene-specific silencing plays a key role in diverse biological processes, such as development, differentiation, and functionality. miR181a has been shown to be highly expressed in immature T cells that recognize low-affinity antigens.rnThe present study successfully shows that ectopic expression of miR181a is able to enhance the sensitivity of both murine and human T cells. In CD4+ T helper cells as well as in CD8+ cytotoxic T cells the overexpression of miR181a leads to downregulation of multiple phosphatases involved in the T cell receptor signaling pathway. Overexpression of miR181a in human T cells achieves a co-stimulatory independent activation and has an anti-apoptotic effect on CD4+ T helper cells. Additionally, increasing the amount of miR181a enhances the cytolytic activity of murine CD8+ TCRtg T cells in an antigen-specific manner.rnTo test miR181a overexpressing T cells in vivo, a mouse tumor model using a B cell lymphoma cell line (A20-HA) expressing the Influenza hemagglutinin (Infl.-HA) antigen was established. The expression of model antigens in tumor cell lines enables targeted elimination of tumors using TCRtg T cells. The transfer of miR181a overexpressing Infl.-HA TCRtg CD8+ T cells alone has no positive effect neither on tumor control nor on survival of A20-HA tumor-bearing mice. In contrast, the co-transfer of miR181a overexpressing Infl.-HA TCRtg CD8+ and CD4+ T cells leads to improved tumor control and prolongs survival of A20-HA tumor-bearing mice. This effect is characterized by higher amounts of effector T cells and the expansion of Infl.-HA TCRtg CD8+ T cells.rnAll effects were achieved by changes in expression of several genes including molecules involved in T cell differentiation, activation, and regulation, cytotoxic effector molecules, and receptors important for the homing process of T cells in miR181a overexpressing T cells. The present study demonstrates that miR181a is able to enhance the anti-tumoral response of antigen-specific T cells and is a promising candidate for improving adoptive cell therapy.