Genetische Varianten synaptischer Proteine als Risikomechanismus der Alkoholabhängigkeitund Alkohol-bezogener Phänotypen

Die Alkoholabhängigkeit gehört zu den häufigen chronischen Erkrankungen, welche mit einem vorzeitigen Verlust von Gesundheit und Lebensqualität einhergeht. Familien- und Zwillingsuntersuchungen sprechen dafür, dass mehr als 50% der Verhaltensvarianz durch genetische Faktoren zu erklären ist. In der vorliegenden kumulativen Habilitationsarbeit wurden verhaltensgenetische, molekularbiologische, humangenetische und funktionell bildgebende Untersuchungstechniken kombiniert, um ein erweitertes Verständnis der Neurobiologie der Alkoholabhängigkeit zu erzielen. In einer Serie tierexperimenteller Arbeiten konnte u.a. nachgewiesen werden, dass das Gen für das Multiple PDZ Domänen Protein Mpdz ein Kandidatengen des Alkoholentzugs, Barbituratentzugs und der neuronalen Exzitabilität darstellt. In zwei weiteren Untersuchungen wurden Kandidatengene der Alkoholpräferenz untersucht. Hier konnte mit dem Syntaxin binding protein 1 (Stxbp1) ein Kandidatengen der Alkoholpräferenz bestätigt werden. Humangenetische Untersuchungen sprechen dafür, dass molekulare Varianten in der Alpha2 Untereinheit des GABAA Rezeptors zu einem erhöhten Risiko der Entwicklung einer Alkoholabhängigkeit beim Menschen beitragen. Mit einer 18F-Fluorodesoxyglucose Untersuchung konnte nachgewiesen werden, dass Alkohol in vivo das mesolimbische Rewardsystem stimuliert, diese Stimulation jedoch nicht durch Tiagabin, einem GABA-Transporterinhibitor, hemmbar ist. Zusammengefasst sprechen die Untersuchungen dafür, dass molekulare Varianten synaptischer Proteine zu einer veränderten Alkoholempfindlichkeit und dem Risiko zur Entwicklung einer Alkoholabhängigkeit beitragen.

Mechanismen und funktionelle Konsequenzen der Chlorid-Homöostase in unreifen Neuronen des Neocortex

GABA, der wichtigste inhibitorische Neurotransmitter im adulten Gehirn, bewirkt im unreifen Nervensystem eine Membrandepolarisation, vermutlich aufgrund der erhöhten intrazellulären Chloridkonzentration ([Cl-]i) in unreifen Nervenzellen. GABAerge Membrandepolarisationen sind essentiell für die korrekte Entwicklung des zentralen Nervensystems und die Entstehung kortikaler Netzwerkaktivität. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde mit Hilfe elektrophysiologischer und immunohistochemischer Methoden die Regulation der Chlorid-Homöostase in unreifen Neuronen des Neokortex untersucht. Die Experimente wurden an Cajal-Retzius (CR) Zellen, einem transienten Zelltyp der Marginalzone, in akuten Hirnschnittpräparaten neonataler Ratten (P0-P3) durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass CR Zellen eine hohe native [Cl-]i von ~30 mM aufweisen. Die hohe [Cl-]i wurde ausschließlich durch Bumetanid sensitiven und Na+-abhängigen aktiven Cl--Transport aufrechterhalten, was auf eine Cl--Akkumulation durch den Kationen-Chlorid-Cotransporter NKCC1 schließen lässt. Diese pharmakologischen Hinweise konnten durch den Nachweis der Expression von NKCC1 in der gesamten Marginalzone, speziell in CR Zellen, bestätigt werden. Die Transportgeschwindigkeit der NKCC1-abhängigen Cl--Akkumulation war gering, was auf eine limitierte Transportkapazität schließen lässt. In Übereinstimmung mit diesem Befund konnte gezeigt werden, dass die Cl--Leitfähigkeit in CR Zellen äußerst klein ist, so dass die NKCC1-abhängige Cl--Akkumulation ausreichend war, um unter Ruhebedingungen eine hohe [Cl-]i zu gewährleisten. Aufgrund dieser hohen [Cl-]i waren GABAA-Rezeptor vermittelte Antworten in CR Zellen exzitatorisch. Die Kapazität des NKCC1-vermittelten Cl--Transportes in CR Zellen konnte durch höherfrequente Stimulation überschritten werden, was dazu führte, dass die [Cl-]i abnahm und GABAerge Antworten unter diesen Bedingungen inhibitorisch wurden. Die inhibitorische Wirkung von GABA in CR Zellen wurde überwiegend durch die Reduktion des Eingangswiderstandes der Zelle vermittelt und beruhte nicht auf einer Verschiebung der Aktionspotentialschwelle.

In vitro modulation of epileptiform activity in the hippocampal formation of immature rodents by GABAergic antagonists, dopamine and methylxanthines

Während des frühen Lebens stellen epileptische Anfälle schwere neurologische Zustände dar, weil sie ein großer Risikofaktor für die Manifestation der Epilepsie sind und eine hohe pharmakologische Resistenz zeigen. In meiner Doktorarbeit konzentrierte ich mich auf die Frage, wie verschiedene Neurotransmitter-Systeme und klinisch verwendete Medikamente epileptiforme Entladungen im perinatalen Hippocampus beeinflussen. rnIm ersten Teil meines Projektes untersuchte ich die Wirkung von GABA-Antagonisten und Modulatoren, die zwischen phasischen und tonischen GABAergen Strömen differenzieren, auf Feldpotentialaktivität in Hippocampusschnitten. Diese Experimente zeigten, dass im unreifen Hippocampus synaptische GABAerge Aktivität benötigt wird, um die Erregbarkeit zu begrenzen, während tonische GABAerge Ströme die Erregbarkeit verstärken können. Dies könnte darauf hinweisen, dass Antiepileptika mit einer höheren Spezifität für synaptische GABAA-Rezeptoren wirksamer zur Behandlung von epileptischen Anfällen bei Neugeborenen sein können. rnUm den Einfluss von Dopamin auf die Erregbarkeit des unreifen Hippocampus herauszufinden, untersuchte ich im zweiten Teil meiner Arbeit die Wirkung von verschiedenen Dopaminkonzentrationen und spezifische Agonisten und Antagonisten der Dopamin-Rezeptor-Subtypen auf epileptiforme Entladungen. Diese Experimente zeigten, dass niedrige Dopamin Konzentrationen eine antikonvulsive Wirkung haben, welche vom D2-ähnliche-Rezeptor-Agonisten Quinpirol nachgeahmt werden kann, während höhere Dopamin-Konzentrationen eine prokonvulsive Wirkung über Aktivierung von D1-ähnlichen Rezeptoren hervorrufen. Obwohl unsere Untersuchungen eine mögliche Verwendung von D2-ähnlichen Rezeptor-Agonisten zur Kontrolle epileptischer Anfälle in Neugeborenen nahelegen, müssen mögliche negative Auswirkungen von DAergen Agonisten und Antagonisten auf die neuronale Entwicklung berücksichtigt werden.rnIm dritten Teil meiner Arbeit untersuchte ich welche Konzentrationen von Methylxanthinen epileptische Anfälle in Hippocampuspreparationen auslösen die synaptische Übertragungen verändern können. Diese Experimente zeigten, dass sowohl Theophyllin als auch Koffein in höheren Konzentrationen die basale synaptische Übertragungen in der CA1-Region des Hippocampus modifizieren und epileptiforme Entladungen provozieren. Die Auswirkungen auf die postsynaptischen Antworten und spontanen epileptiformen Entladungen durch Koffein waren weniger ausgeprägt, was darauf hindeutet, dass diese Substanz potentiell vorteilhafter für therapeutische Anwendungen bei Frühgeborenen sein kann. rnZusammenfassend bereichern die Ergebnisse meiner Studie erheblich unser Wissen über die zugrunde liegenden Mechanismen epileptiformer Aktivität im unreifen Hippocampus und den therapeutischen Einsatz von Methylxanthinen und Pharmaka, die auf das GABAerge und DArge System einwirken.rnrn

Interplay between BDNF,TrkB signalling and GABAergic inhibition in the visual cortex of mice

Der visuelle Kortex ist eine der attraktivsten Modellsysteme zur Untersuchung der molekularen Mechanismen der synaptischen Plastizität im Gehirn. Es hat sich gezeigt, dass der Wachstumsfaktor brain-derived-neurotrophic-factor (BDNF) und die GABAerge Hemmung während der Entwicklung eine essentielle Funktion in der Regulierung der synaptischen Plastizität im visuellen Kortex besitzen. BDNF bindet u.a. an TrkB Rezeptoren, die das Signal intrazellular an unterschiedliche Effektormoleküle weiter vermitteln. Außer BDNF sind auch andere TrkB-Rezeptor Agonisten in der Literatur beschrieben. Einer davon ist das kürzlich identifizierte Flavonoid 7,8-Dihydroxyflavone (7,8-DHF), welchem eine neurotrophe Wirkung zugeschrieben wird. Im ersten Abschnitt der vorliegenden Doktorarbeit wurde der Effekt dieses Agonisten auf die synaptische Übertragung und intrinsischen Zelleigenschaften im visuellen Kortex der Maus untersucht. Dies wurde mit Hilfe der whole-cell patch clamp Methode durchgeführt, wobei die synaptischen Eingänge der Pyramidalzellen der kortikalen Schicht 2/3 von besonderem Interesse waren.rnEine 30 minütige Inkubationszeit der kortikalen Schnitte mit 7,8 DHF (20µM) erzielte eine signifikante Reduktion der GABAergen Hemmung, während die glutamaterge synaptische Übertragung unverändert blieb. Des weiteren konnte in Gegenwart von 7,8 DHF eine Veränderung der intrinsischen neuronalen Zellmembraneigenschaften beobachtet werden. Dies wurde deutlich in der Erhöhung des Eingangwiderstandes und der Frequenz der induzierten Aktionspotentiale. Die chronische Applikation von 7,8 DHF in vivo bestätigte die selektive Wirkung von 7,8 DHF auf das GABAerge System. rnDie Rolle des BDNF-TrkB-Signalweges in der GABAergen Hemmung nach kortikalen Verletzungen ist bisher wenig verstanden. Eine häufig beschriebene elektrophysiologische Veränderung nach kortikaler Verletzung ist eine Reduktion in der GABAergen Hemmung. Im zweiten Abschnitt dieser Doktorarbeit wurde hierzu die Funktion des BDNF-TrkB-Signalweges auf die GABAerge Hemmung nach kortikaler Verletzung untersucht. Es wurde ein "ex-vivo/in-vitro“ Laser-Läsions Modell verwendet, wobei mittels eines Lasers im visuellen Kortex von WT und heterozygoten BDNF (+/−) Mäusen eine definierte, reproduzierbare Läsion induziert wurde. Nachfolgende elektrophysiologische Messungen ergaben, dass die Auswirkung einer Verletzung des visuellen Kortex auf die GABAerge Funktion signifikant von der basalen BDNF Konzentration im Kortex abhängt. Des weiteren konnte beobachtet werden, dass nach kortikaler Verletzung in WT Mäusen sowohl die Frequenz der basalen inhibitorischen, postsynaptischen Potentiale (mIPSCs) reduziert war, als auch ein erhöhtes Paired-Pulse Verhältnis vorlag. Diese Ergebnisse deuten auf Veränderungen der präsynaptischen Funktion inhibitorischer Synapsen auf Pyramidalneurone hin. Im Gegensatz dazu konnte in BDNF (+/−) mice Mäusen eine erhöhte und gleichzeitig verlängerte mIPSC-Amplitude beobachtet werden, induziert durch Reizung afferenter Nervenfasern. Hieraus lässt sich schließen, dass kortikale Verletzungen in BDNF (+/−) mice Mäusen Auswirkungen auf die Eigenschaften von postsynaptischen GABAA-Rezeptoren haben. Die nachfolgende Gabe eines TrkB-Rezeptor Antagonisten bestätigte diese Ergebnisse für das GABAerge System post-Läsion. Dies zeigt auch, dass die Änderungen der synaptischen Hemmung nicht auf eine Reduktion der BDNF-Konzentration zurückzuführen sind. Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit, dass der BDNF-TrkB Signalweg eine wichtige Rolle in der Reorganisation der GABAergen Hemmung nach kortikalen Verletzungen spielt. So könnte ein TrkB-Rezeptor Agonist, wie das kürzlich entdeckte 7,8-DHF, über eine Modulation der BDNF-TrB Signalkaskade pharmakologisch die funktionelle Reorganisation des Kortex nach einer fokalen Gehirnverletzung fördern. rnrn

Na +-coupled betaine symporters involved in osmotic stress response in prokaryotes and eukaryotes

The betaine/GABA transporter BGT1 is one of the most important osmolyte transporters in the kidney. BGT1 is a member of the neurotransmitter sodium symporter (NSS) family, facilitates Na+/Cl--coupled betaine uptake to cope with hyperosmotic stress. Betaine transport in kidney cells is upregulated under hypertonic conditions by a yet unknown mechanism when increasing amounts of intracellular BGT1 are inserted into the plasma membrane. Re-establishing isotonicity results in ensuing depletion of BGT1 from the membrane. BGT1 phosphorylation on serines and threonines might be a regulation mechanism. In the present study, four potential PKC phosphorylation sites were mutated to alanines and the responses to PKC activators, phorbol 12-myristate acetate (PMA) and dioctanoyl-sn-glycerol (DOG) were determined. GABA-sensitive currents were diminished after 30 min preincubation with these PKC activators. Staurosporine blocked the response to DOG. Three mutants evoked normal GABA-sensitive currents but currents in oocytes expressing the mutant T40A were greatly diminished. [3H]GABA uptake was also determined in HEK-293 cells expressing EGFP-tagged BGT1 with the same mutations. Three mutants showed normal upregulation of GABA uptake after hypertonic stress, and downregulation by PMA was normal compared to EGFP-BGT1. In contrast, GABA uptake by the T40A mutant showed no response to hypertonicity or PMA. Confocal microscopy of the EGFP-BGT1 mutants expressed in MDCK cells, grown on glass or filters, revealed that T40A was present in the cytoplasm after 24 h hypertonic stress while the other mutants and EGFP-BGT1 were predominantely present in the plasma membrane. All four mutants co-migrated with EGFP-BGT1 on Western blots suggesting they are full-length proteins. In conclusion, T235, S428, and S564 are not involved in downregulation of BGT1 due to phosphorylation by PKC. However, T40 near the N-terminus may be part of a hot spot important for normal trafficking or insertion of BGT1 into the plasma membrane. Additionally, a link between substrate transport regulation, insertion of BGT1 into the plasma membrane and N-glycosylation in the extracellular loop 2 (EL2) could be revealed. The functional importance of two predicted N-glycosylation sites, which are conserved in EL2 within the NSS family were investigated for trafficking, transport and regulated plasma membrane insertion by immunogold-labelling, electron microscopy, mutagenesis, two-electrode voltage clamp measurements in Xenopus laevis oocytes and uptake of radioactive-labelled substrate into MDCK cells. Trafficking and plasma membrane insertion of BGT1 was clearly promoted by proper N-glycosylation in both, oocytes and MDCK cells. De-glycosylation with PNGase F or tunicamycin led to a decrease in substrate affinity and transport rate. Mutagenesis studies revealed that in BGT1 N183 is the major N-glycosylation site responsible for full protein activity. Replacement of N183 with aspartate resulted in a mutant, which was not able to bind N-glycans suggesting that N171 is a non-glycosylated site in BGT1. N183D exhibited close to WT transport properties in oocytes. Surprisingly, in MDCK cells plasma membrane insertion of the N183D mutant was no longer regulated by osmotic stress indicating unambiguously that association with N-glycans at this position is linked to osmotic stress-induced transport regulation in BGT1. The molecular transport mechanism of BGT1 remains largely unknown in the absence of a crystal structure. Therefore investigating the structure-function relationship of BGT1 by a combination of structural biology (2D and 3D crystallization) and membrane protein biochemistry (cell culture, substrate transport by radioactive labeled GABA uptake into cells and proteoliposomes) was the aim of this work. While the functional assays are well established, structure determination of eukaryotic membrane transporters is still a challenge. Therefore, a suitable heterologous expression system could be defined, starting with cloning and overexpression of an optimized gene. The achieved expression levels in P. pastoris were high enough to proceed with isolation of BGT1. Furthermore, purification protocols could be established and resulted in pure protein, which could even be reconstituted in an active form. The quality and homogeneity of the protein allowed already 2D and 3D crystallization, in which initial crystals could be obtained. Interestingly, the striking structural similarity of BGT1 to the bacterial betaine transporter BetP, which became a paradigm for osmoregulated betaine transport, provided information on substrate coordination in BGT1. The structure of a BetP mutant that showed activity for GABA was solved to 3.2Å in complex with GABA in an inward facing open state. This structure shed some light into the molecular transport mechanisms in BGT1 and might help in future to design conformationally locked BGT1 to enforce the on-going structure determination.

Targeting neuronal populations by AAV-mediated gene transfer for studying the endocannabinoid system

The cannabinoid type 1 (CB1) receptor is involved in a plethora of physiological functions and heterogeneously expressed on different neuronal populations. Several conditional loss-of-function studies revealed distinct effects of CB1 receptor signaling on glutamatergic and GABAergic neurons, respectively. To gain a comprehensive picture of CB1 receptor-mediated effects, the present study aimed at developing a gain-of-function approach, which complements conditional loss-of-function studies. Therefore, adeno-associated virus (AAV)-mediated gene delivery and Cre-mediated recombination were combined to recreate an innovative method, which ensures region- and cell type-specific transgene expression in the brain. This method was used to overexpress the CB1 receptor in glutamatergic pyramidal neurons of the mouse hippocampus. Enhanced CB1 receptor activity at glutamatergic terminals caused impairment in hippocampus-dependent memory performance. On the other hand, elevated CB1 receptor levels provoked an increased protection against kainic acid-induced seizures and against excitotoxic neuronal cell death. This finding indicates the protective role of CB1 receptor on hippocampal glutamatergic terminals as a molecular stout guard in controlling excessive neuronal network activity. Hence, CB1 receptor on glutamatergic hippocampal neurons may represent a target for novel agents to restrain excitotoxic events and to treat neurodegenerative diseases. Endocannabinoid synthesizing and degrading enzymes tightly regulate endocannabinoid signaling, and thus, represent a promising therapeutic target. To further elucidate the precise function of the 2-AG degrading enzyme monoacylglycerol lipase (MAGL), MAGL was overexpressed specifically in hippocampal pyramidal neurons. This genetic modification resulted in highly increased MAGL activity accompanied by a 50 % decrease in 2-AG levels without affecting the content of arachidonic acid and anandamide. Elevated MAGL protein levels at glutamatergic terminals eliminated depolarization-induced suppression of excitation (DSE), while depolarization-induced suppression of inhibition (DSI) was unchanged. This result indicates that the on-demand availability of the endocannabinoid 2-AG is crucial for short-term plasticity at glutamatergic synapses in the hippocampus. Mice overexpressing MAGL exhibited elevated corticosterone levels under basal conditions and an increase in anxiety-like behavior, but surprisingly, showed no changes in aversive memory formation and in seizure susceptibility. This finding suggests that 2 AG-mediated hippocampal DSE is essential for adapting to aversive situations, but is not required to form aversive memory and to protect against kainic acid-induced seizures. Thus, specific inhibition of MAGL expressed in hippocampal pyramidal neurons may represent a potential treatment strategy for anxiety and stress disorders. Finally, the method of AAV-mediated cell type-specific transgene expression was advanced to allow drug-inducible and reversible transgene expression. Therefore, elements of the tetracycline-controlled gene expression system were incorporated in our “conditional” AAV vector. This approach showed that transgene expression is switched on after drug application and that background activity in the uninduced state was only detectable in scattered cells of the hippocampus. Thus, this AAV vector will proof useful for future research applications and gene therapy approaches.