Anwendungen von Rezeptoren auf Triphenylenketal-Basis

Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Bindung von Koffein und verwandten Oxopurinen in C¬3-symmetrischen Rezeptoren auf der Basis von Triphenylenketalen untersucht. Dabei stand vor allem die Evaluierung für eine spätere Anwendung im Vordergrund. Für die Anwendung als Chemosensor wurden mehrere optische Verfahren getestet. Die Verwendung von UV/Vis-Spektroskopie gelingt nur unter Einsatz eines elektronenarmen Konkurrenzgastes, welcher durch das stärker bindende Koffein unter Entfärbung verdrängt wird. Obwohl dieser Effekt sogar mit bloßem Auge zu erkennen ist und somit eine einfache Untersuchung ermöglichen würde, machen die besondere Reaktivität des Konkurrenzgastes und dessen geringe Affinität zum Rezeptor eine weitere Anwendung als Chemosensor für Koffein unwahrscheinlich. Den entscheidenden Durchbruch lieferte der Wechsel auf Fluoreszenzspektroskopie. Die Bindung von Gästen lässt sich mit dieser Methode direkt beobachten und für quantitative Studien nutzen. Die Signalzunahme bei Zugabe von Koffein liegt bei maximal 30%. Durch Verwendung eines vom Koffein abgeleiteten Konkurrenzgastes können weitere Verbesserungen erzielt werden. So konnte eine maximale Signaldynamik von fast 400% erzielt werden. Durch die Entwicklung eines geeigneten Probenvorbereitungsprotokolls war es möglich, mit dem fluoreszenzbasierten System einen Nachweis von Koffein an kommerziell verfügbaren Getränkeproben durchzuführen. Die Ergebnisse waren in guter Übereinstimmung mit HPLC-Kontrollexperimenten. Die Eignung von Rezeptoren auf Triphenylenketalbasis für die enantiofaciale Differenzierung an Heteroaromaten wurde durch Untersuchung verschiedener Wirt-Gast-Komplexe mittels CD-Spektroskopie und Tieftemperatur-NMR systematisch demonstriert. Rezeptoren mit Menthyl-Substituenten liefern laut NMR die stärkste Seitendifferenzierung. Anhand des CD wird ein vollständiges und schlüssiges Bild über den Zusammenhang zwischen dem Raumbedarf am Gast, der Ausrichtung der chiralen Gruppen am Wirt und dem erhaltenen CD hergestellt. Durch umfangreiche molekulardynamische Simulationen und nachfolgende semiempirische Berechnungen wurden Referenzspektren berechnet, welche die Zuordnung der Stereochemie anhand des CD eindeutig belegen. Die Ergebnisse sind zudem in guter Übereinstimmung mit den Ergebnissen aus röntgenkristallographischen Untersuchungen. (Diese Methode ließ sich erfolgreich auf die helicale Faltung von Alkanen in Kapseln von Rebek, jr. umsetzen.) Obwohl die Energieunterschiede zwischen den diastereomeren Komplexen klein sind, konnte anhand der CD-Spektroskopie somit erstmalig die enantiofaciale Differenzierung an einem heterocyclischen System bei Raumtemperatur beobachtet werden. Die beste enantiofaciale Differenzierung erzielen die Menthyl-abgeleiteten Rezeptoren. Diese sind hinsichtlich einer möglichen Anwendung als chirales „Auxiliar“ ungeeignet, da sie mit den sperrigen Cyclohexylgruppen auch den Raum oberhalb des gebundenen Gastes blockieren. Daher wird für die weitere Entwicklung auf die praktische Einführung chiraler Information in Form des Isocyanats verzichten werden müssen. Stattdessen zielen aktuelle Bemühungen auf den Aufbau chiraler Rückgrate, welche den Raum in der unteren Peripherie des Gastes beeinflussen.

Der Einfluss einer wildtypischen SOD1-Untereinheit auf Konformation und Stabilität mutanter SOD1-Heterodimere

Die Erkrankung Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) ist gekennzeichnet durch eine progressive Degeneration der Motoneurone. Die hierdurch im Patienten hervorgerufene fortschreitende Paralyse kann von wenigen Wochen über Monate bis zu mehreren Jahren variieren. Im Durchschnitt beträgt die Krankheitsdauer 3 - 5 Jahre. Häufig führt respiratorische Insuffizienz letztendlich zum Tod des Patienten. ALS ist bis heute unheilbar. Etwa 10 % aller ALS Fälle zeigen einen familiären Hintergrund. Hiervon werden ~20 % durch Mutationen im Gen des antioxidativen Enzyms CuZnSuperoxiddismutase (SOD1) verursacht. Mehr als 150 Mutationen im Gen der SOD1 wurden bisher als Auslöser der ALS beschrieben. Durch die Mutation erlangen SOD1 Proteine zusätzliche, bisher jedoch unbekannte toxische Eigenschaften. Ein dismutaseaktives SOD1 Enzym setzt sich aus zwei SOD1 Untereinheiten zusammen. Aufgrund der autosomal dominanten Vererbung der Krankheit kann ein SOD1 Dimer im Patienten als wildtypisches Homodimer (SOD1WT‑WT), als mutantes Homodimer (SOD1mut‑mut) oder als Heterodimer (SOD1mut-WT) vorliegen. In dieser Arbeit wurden SOD1 Dimere untersucht, deren Untereinheiten kovalent miteinander verbunden waren. Es konnte gezeigt werden, dass sich die biochemischen und biophysikalischen Eigenschaften mutanter SOD1 Heterodimere von mutanten SOD1 Homodimeren mit der gleichen Mutation unterschieden. Mutante SOD1 Heterodimere wiesen eine höhere Resistenz gegen einen Abbau durch Proteinase K auf als ihre korrespondierenden Homodimere. Des Weiteren verminderte eine wildtypische Untereinheit die Interaktion der Heterodimere mit Antikörpern gegen fehlgefaltete SOD1. Die Sekundärstruktur der mutanten SOD1 Heterodimere unterschied sich hierbei nicht auffällig von der Sekundärstruktur ihrer zugehörigen Homodimere. Eine wildtypische Untereinheit verändert somit möglicherweise die Tertiärstruktur seiner kovalent gebundenen mutanten SOD1 Untereinheit und/oder die Konformation des gesamten Dimerproteins. Durch die Mutation bedingte Missfaltungen werden hierdurch reduziert, die Stabilität des Dimers gegenüber proteolytischem Abbau erhöht. Nach der Aufreinigung der Dimerproteine wies das mutanten SOD1 Heterodimer diese Eigenschaften nicht mehr auf. Ein potentieller Interaktionspartner, der eine verminderte Fehlfaltung des Heterodimers oder eine verstärkte Missfaltung des Homodimers fördert, könnte hierbei während der Aufreinigungsprozedur verlorengegangen sein. Die hier nachgewiesene Konformationsänderung könnte über einen Prionen-ähnlichen Effekt übertragen werden und die erhöhte Stabilität das mutante, toxische Protein vor Degradation schützen. Dies korreliert mit der Beobachtung früherer Studien, in denen nachgewiesen wurde, dass mutante SOD1 Heterodimere potentiell toxischer sind als ihre korrespondierenden Homodimere.

Measurement of the forward-backward asymmetry of Z boson decays in electron-positron pairs with the ATLAS detector in proton-proton collisions at root out s = 7TeV at the LHC

In this thesis the measurement of the effective weak mixing angle wma in proton-proton collisions is described. The results are extracted from the forward-backward asymmetry (AFB) in electron-positron final states at the ATLAS experiment at the LHC. The AFB is defined upon the distribution of the polar angle between the incoming quark and outgoing lepton. The signal process used in this study is the reaction pp to zgamma + X to ee + X taking a total integrated luminosity of 4.8\,fb^(-1) of data into account. The data was recorded at a proton-proton center-of-mass energy of sqrt(s)=7TeV. The weak mixing angle is a central parameter of the electroweak theory of the Standard Model (SM) and relates the neutral current interactions of electromagnetism and weak force. The higher order corrections on wma are related to other SM parameters like the mass of the Higgs boson.rnrnBecause of the symmetric initial state constellation of colliding protons, there is no favoured forward or backward direction in the experimental setup. The reference axis used in the definition of the polar angle is therefore chosen with respect to the longitudinal boost of the electron-positron final state. This leads to events with low absolute rapidity have a higher chance of being assigned to the opposite direction of the reference axis. This effect called dilution is reduced when events at higher rapidities are used. It can be studied including electrons and positrons in the forward regions of the ATLAS calorimeters. Electrons and positrons are further referred to as electrons. To include the electrons from the forward region, the energy calibration for the forward calorimeters had to be redone. This calibration is performed by inter-calibrating the forward electron energy scale using pairs of a central and a forward electron and the previously derived central electron energy calibration. The uncertainty is shown to be dominated by the systematic variations.rnrnThe extraction of wma is performed using chi^2 tests, comparing the measured distribution of AFB in data to a set of template distributions with varied values of wma. The templates are built in a forward folding technique using modified generator level samples and the official fully simulated signal sample with full detector simulation and particle reconstruction and identification. The analysis is performed in two different channels: pairs of central electrons or one central and one forward electron. The results of the two channels are in good agreement and are the first measurements of wma at the Z resonance using electron final states at proton-proton collisions at sqrt(s)=7TeV. The precision of the measurement is already systematically limited mostly by the uncertainties resulting from the knowledge of the parton distribution functions (PDF) and the systematic uncertainties of the energy calibration.rnrnThe extracted results of wma are combined and yield a value of wma_comb = 0.2288 +- 0.0004 (stat.) +- 0.0009 (syst.) = 0.2288 +- 0.0010 (tot.). The measurements are compared to the results of previous measurements at the Z boson resonance. The deviation with respect to the combined result provided by the LEP and SLC experiments is up to 2.7 standard deviations.

Die Regulation der Ubiquitinligase CHIP durch das Cochaperon BAG2 im zellulären System und im Kontext der replikativen Seneszenz

Eine funktionierende Proteinqualitätskontrolle ist essenziell für die Vitalität einer Zelle. Das dynamische Gleichgewicht zwischen Proteinfaltung und -degradation wird von molekularen Chaperonen aufrechterhalten, deren Aktivität wiederum durch die Interaktion mit zahlreichen Cochaperonen moduliert wird. Das Cochaperon CHIP ist ein zentraler Faktor in Proteintriage-Entscheidungsprozessen, da es als Ubiquitinligase Chaperonsubstrate dem Abbau zuführt und somit die Chaperonmaschinerie direkt mit den Systemen der Proteindegradation verbindet. Um Polypeptide vor einem vorzeitigen Abbau zu schützen, wird die destruktive Aktivität von CHIP durch weitere Cochaperone reguliert. rnIn dieser Arbeit konnte die Hemmung der Ligaseaktivität von CHIP durch das Cochaperon BAG2 mechanistisch erstmals in einem zellulären System nachgewiesen werden. Dazu wurde die humane IMR-90 Fibroblasten Zelllinie verwendet. Die Ubiquitinierungsaktivität von CHIP wurde anhand von HSP72 als Modell-CHIP-Substrat untersucht. Durch die verringerte Ubiquitinierung, und damit dem reduzierten Abbau von HSP72, regulierte BAG2 dessen intrazelluläre Proteinspiegel, ohne dabei selbst eine Hitzeschockantwort zu induzieren. Überexprimiertes BAG2 wirkte sich trotz stabilisierter HSP72-Spiegel bei einem appliziertem Hitzestresses negativ auf die Zellvitalität aus, vermutlich da BAG2 durch die Inhibition von CHIP-vermittelter Ubiquitinierung massiv in das Gleichgewicht zwischen Substratfaltung und -degradation eingreift.rnDa sich die Mechanismen der Proteinqualitätskontrolle in der Alterung stark verändern und sich den wandelnden Bedingungen in der Zelle anpassen, wurde in einem zweiten Teil dieser Arbeit mit Hilfe des IMR-90 Zellsystems als etabliertes Modell zellulärer Seneszenz analysiert, inwieweit sich die Aktivität und die Regulation von CHIP durch BAG2 in der zellulären Alterung ändern. In seneszenten Zellen war HSP72 erheblich weniger ubiquitiniert als in jungen Fibroblasten, was auf eine reduzierte CHIP-Aktivität hinweist. Diese blieb jedoch durch BAG2 weiterhin modulierbar. Die Funktion von BAG2 als Inhibitor der Ubiquitinligase CHIP blieb demnach in seneszenten Zellen bestehen. In gealterten Fibroblasten regulierte BAG2 außerdem die Proteinspiegel des CHIP-Substrates und Seneszenzinitiators p53, was BAG2 eine mögliche Rolle in der Etablierung des Seneszenz-Phänotyps zuspricht. Weiterhin unterlagen die Proteinspiegel der beiden funktionell redundanten CHIP-Modulatoren BAG2 und HSPBP1 in der zellulären Alterung einer reziproken Regulation. In gealterten Mäusen trat die gegenläufige Veränderung der beiden Cochaperone gewebsspezifisch in der Lunge auf. Außerdem waren die BAG2-Proteinspiegel im Hippocampus gealterter Tiere signifikant erhöht.rnZusammenfassend konnte anhand der erzielten Ergebnisse die Funktion von BAG2 als Inhibitor von CHIP im zellulären System bestätigt werden. Außerdem durchlaufen die Aktivität und die Regulation von CHIP einen seneszenzspezifischen Adaptationsprozess, welcher für die Erhaltung der Proteostase in der Alterung relevant sein könnte und in welchem die Funktion von BAG2 als CHIP-Modulator möglicherweise eine wichtige Rolle spielt.rnZukünftige Studien könnten die komplexen Mechanismen weiterführend aufklären, mit denen CHIP-Aktivität reguliert wird. Dies kann helfen, der altersbedingten Abnahme an proteostatischer Kontrolle entgegenzuwirken und aberrante Proteinaggregation in altersassoziierten Erkrankungen vorzubeugen.rn

Biochemische Untersuchungen des Lichtsammlerprotein (LHCP) im Komplex mit seinem Chaperon, dem plastidären Signalerkennungspartikel cpSRP

Das Lichtsammlerprotein (light harvesting chlorophyll a/b-binding protein, LHCP) ist das Apoprotein des Haupt-Lichtsammelkomplexes (LHCII) und stellt das häufigste Membranprotein der Erde dar. Nicht nur aufgrund seiner Abundanz, sondern auch wegen seiner speziellen Translokation als stark hydrophobes Membranprotein durch hauptsächlich wässrige Milieus von cytosolischen Ribosomen bis in die Thylakoidmembran der Chloroplasten ist der Biogeneseweg dieses Proteins von besonderem Interesse. LHCP ist kernkodiert und wird nach seinem Import in Chloroplasten als Transitkomplex mit dem stromalen Signalerkennungsprotein (cpSRP) zur Thylakoide geleitet. Der cpSRP-Komplex besteht aus dem cpSRP43 mit Chaperonfunktion für das LHCP sowie dem Co-Chaperon cpSRP54, welches eine entscheidende Rolle in der stromalen Zielführung des Transitkomplexes spielt. Sowohl die Proteinkonformation des LHCP während seiner Biogenese als auch der in vivo Faltungsablauf während der Thylakoidinsertion sind noch völlig unklar. Mithilfe der Elektronen-paramagnetischen Resonanz (EPR-)Spektroskopie sollte in dieser Arbeit der Faltungszustand des LHCP im Transitkomplex mit dem cpSRP oder in Teilkomplexen davon ermittelt werden.rnKopplungen von cpSRP43 und LHCP bestätigten, dass das Chaperon als Minimaleinheit zur quantitativen Solubilisierung des Membranproteins genügt. Gelfiltrationschromatographische (GFC-) Untersuchungen solcher Komplexe wiesen jedoch mit einem apparenten MW von ≥ 600 kDa ein sehr hochmolekulares Laufverhalten auf. Variierende Proteinstöchiometrien im Komplex zeigten in densitometrischen Auswertungen eine undefinierte Aggregation. Zusätze von Agenzien zur Vermeidung unspezifischer Wechselwirkungen wie z.B. Detergentien oder auch Salzzugabe zeigten keinen Einfluss auf die Aggregate. Volllängen-Transitkomplexe dagegen wiesen trotz unterschiedlichem Angebot von Einzelproteinen reproduzierbar definierte Stöchiometrien auf. Diese zeigten eine LHCP:cpSRP43-Stöchiometrie von 1,25. Dennoch hatten diese Komplexe mit einem apparenten MW von > 300 kDa einen mindestens dimeren Assemblierungsgrad. Eine Voraussetzung für eindeutige EPR-spektroskopische Distanzmessungen zwischen definierten Positionen im LHCP ist jedoch dessen monomolekularisiertes Vorliegen im Chaperonkomplex. Die Darstellung von ternären Transitkomplexen mit einem zu erwartenden apparenten MW von ~175 kDa war auch durch Zusatz verschiedener Proteinaggregationshemmer nicht möglich. Transitkomplexe mit einer verkürzten Version des cpSRP54 zeigten schließlich eine definierte 1:1-Komplexstöchiometrie bei gleichzeitiger polydisperser Komplexzusammensetzung. Es konnten ~60% dieser sogenannten 54M-Transitkomplexe nach GFC-Daten und densitometrischer Auswertung als potentiell ternär eingeschätzt werden. Darüber hinaus gelang es solche Ansätze durch GFC-Fraktionierung zusätzlich von oligomerisierten Spezies aufzureinigen. Dennoch zeigten die Präparate vor GFC-Fraktionierung ein (noch) zu hohes Aggregationssignal im Hintergrund und nach Fraktionierung ein zu schwaches Signal, um eine eindeutige Aussage der EPR-Daten zuzulassen. Dennoch bietet dieses ausgearbeitete Komplexbildungsprotoll in Verbindung mit der Verwendung von verkürztem cpSRP54 eine solide Basis, um weitere Versuche zu EPR-Messungen an cpSRP-gebundenem LHCP durchzuführen. rn

Faltung, Assemblierung und Stabilisierung des Transmembranproteins Cytochrom b 6

In dieser Arbeit wurde der Beitrag der interhelikalen Loops zur Faltung, Assemblierung und Stabilität des kofaktortragenden Transmembranproteins Cytochrom b6 in vitro untersucht. Cytochrom b6 ist aus vier Transmembranhelices aufgebaut, die über drei Loops miteinander verbunden sind. Die beiden nicht-kovalent gebundenen Kofaktoren werden spontan in der Häm-Bindespalte zwischen den zwei Cytochrom b6-Hälften gebunden. Die Ergebnisse zeigen, dass die Verlängerung oder Eliminierung des Loops, der die beiden Hälften verbindet, nicht die Faltung und Assemblierung des Proteins beeinflusst. Der Loop ist für eine räumliche Positionierung und Orientierung der Hälften während der Assemblierung nicht essentiell. Weiterhin scheint keiner der drei interhelikalen Loops für die Bindung der Kofaktoren notwendig zu sein. Die Cytochrom b6-Hälfte, bestehend aus den Helices A und B, besitzt eine Konformation, die stabil genug ist um Häm alleine zu binden. Ebenso zeigt Helix B alleine eine α-helikale Struktur und bindet ebenfalls Häm. In vivo wurden bislang keine Faktoren beschrieben, die an der Assemblierung beteiligt sind. Im Rahmen dieser Arbeit wurden strukturelle Merkmale des Häms identifiziert, welche die Spezifität der Häm-Bindung, wenigstens in vitro, ausmachen. Von großer Bedeutung ist dabei das zentrale Eisen-Ion, dessen Eliminierung oder Austausch die Häm-Bindung verhindert. Die Substituenten des Porphyrinrings scheinen hingegen für die Stabilität der Bindung notwendig zu sein.

Mesozoic fold structure of the Otago and Alpine Schist Belt and its implications on the tectonic evolution of South Island, New Zealand

Erneute Untersuchungen der mesozoischen Faltenstruktur des Otago Schiefergürtels, Südinsel, Neuseeland, zeigen, dass diese aus zwei aufeinander folgenden, ähnlichen, asymmetrischen, offenen bis mäßig engen Großfaltengenerationen im km- Größenbereich besteht anstatt aus den vorher angenommenen Decken- oder Halbfalten. Hauptproblem der Großfaltenstruktur sind Zonen von durchgreifender Boudinage, die in der Nähe der Großfaltenscharniere entstanden sind. Vorherige Bearbeiter deuteten diese Zonen als 'starke Verformungszonen' oder Überschiebungszonen. Diese Arbeit zeigt, dass in diesen Zonen nur durch die asymmetrische Faltung die unteren liegenden Schenkel der Großfalten boudiniert und somit häufig die ansonsten typischen Faltenstrukturen des liegenden Schenkels einer symmetrischen Faltung überprägt wurden. Ein weiteres Problem dieser mesozoischen Großfaltenstruktur ist die Überprägung einer Faltengeneration auf eine frühere. Weil die Verkürzungsrichtung der überprägenden Faltengeneration nicht subparallel zur älteren Faltenachse ist, sondern einen Winkel von rund 30 Grad einschließt, ist ein Wechsel von orthogonalen zu koaxialen Interferenzmustern der Kleinfalten beobachtbar. Folglich ist die Orientierung der Scheitellinie einer überprägenden und überprägten Kleinfalte nicht unbedingt subparallel zur Orientierung der Faltenachse der Großfalte trotz zylindrischer Faltung. Im letzten Teil dieser Arbeit wird die Überprägung der mesozoischen Großfaltenstruktur durch das känozoisch entstandene, transpressionale Alpine Störungssystem, das einen zweiseitigen Falten- und Überschiebungsgürtel im Otago und im Nordwesten anschließenden Alpinen Schiefergürtel bildet, beschrieben.