Molecular interaction of the human metalloprotease meprin beta with the amyloid precursor protein, ADAM10, and ADAM17 based on proteomics

Die Zinkendopeptidasen Meprin α und β sind Schlüsselkomponenten in patho(physiologischen) Prozessen wie Entzündung, Kollagenassemblierung und Angiogenese. Nach ihrer Entdeckung in murinen Bürstensaummembranen und humanen Darmepithelien, wurden weitere Expressionsorte identifiziert, z.B. Leukozyten, Krebszellen und die humane Haut. Tiermodelle, Zellkulturen und biochemische Analysen weisen auf Funktionen der Meprine in der Epithelialdifferenzierung, Zellmigration, Matrixmodellierung, Angiogenese, Bindegewebsausbildung und immunologische Prozesse hin. Dennoch sind ihre physiologischen Substrate weitgehend noch unbekannt. Massenspektrometrisch basierte Proteomics-Analysen enthüllten eine einzigartige Spaltspezifität für saure Aminosäurereste in der P1´ Position und identifizierten neue biologische Substratkandidaten. Unter den 269 extrazellulären Proteinen, die in einem Substratscreen identifiziert wurden, stellten sich das amyloid precursor protein (APP) and ADAM10 (a disintegrin and metalloprotease 10) als sehr vielversprechende Kandidaten heraus. Mehrere Schnittstellen innerhalb des APP Proteins, hervorgerufen durch verschiedenen Proteasen, haben unterschiedlichen Auswirkungen zur Folge. Die β-Sekretase BACE (β-site APP cleaving enzyme) prozessiert APP an einer Schnittstelle, welche als initialer Schritt in der Entwicklung der Alzheimer Erkrankung gilt. Toxische Aβ (Amyloid β)-Peptide werden in den extrazellulären Raum freigesetzt und aggregieren dort zu senilen Plaques. Membran verankertes Meprin β hat eine β-Sekretase Aktivität, die in einem Zellkultur-basierten System bestätigt werden konnte. Die proteolytische Effizienz von Meprin β wurde in FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)-Analysen bestimmt und war um den Faktor 104 höher als die von BACE1. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass Meprin β die ersten zwei Aminosäuren prozessiert und somit aminoterminal einen Glutamatrest freisetzt, welcher nachfolgend durch die Glutaminylzyklase in ein Pyroglutamat zykliert werden kann. Trunkierte Aβ-Peptide werden nur in Alzheimer Patienten generiert. Aufgrund einer erhöhten Hydrophobie weisen diese Peptide eine höhere Tendenz zur Aggregation auf und somit eine erhöhte Toxizität. Bis heute wurde keine Protease identifiziert, welche diese Schnittstelle prozessiert. Die Bildung der Meprin vermittelten N-terminalen APP Fragmenten wurde in vitro und in vivo detektiert. Diese N-APP Peptide hatten keine cytotoxischen Auswirkungen auf murine und humane Gehirnzellen, obwohl zuvor N-APP als Ligand für den death receptor (DR) 6 identifiziert wurde, der für axonale Degenerationsprozesse verantwortlich ist. rnIm nicht-amyloidogenen Weg prozessiert ADAM10 APP und entlässt die Ektodomäne von der Zellmembran. Wir konnten das ADAM10 Propeptid als Substrat von Meprin β identifizieren und in FRET Analysen, in vitro und in vivo zeigen, dass die Meprin vermittelte Prozessierung zu einer erhöhten ADAM10 Aktivität führt. Darüber hinaus wurde ADAM10 als Sheddase für Meprin β identifiziert. Shedding konnte durch Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) oder durch das Ionophor A23187 hervorgerufen werden, sowie durch ADAM10 Inhibitoren blockiert werden. rnDiese Arbeit konnte somit ein komplexes proteolytisches Netwerk innerhalb der Neurophysiologie aufdecken, welches für die Entwicklung der Alzheimer Demenz wichtig sein kann.rn

Untersuchungen zum Ectodomain shedding des Receptor for advanced glycation endproducts

Zu den Liganden des Zelloberflächenrezeptors RAGE gehören AGEs, S100-Proteine, HMGB1 und Aβ. RAGE wird daher eine Rolle bei verschiedenen neurologischen Erkrankungen sowie Diabetes, Arteriosklerose und Krebs zugesprochen. Des Weiteren geht eine Verringerung der Menge an sRAGE häufig mit diesen Krankheiten einher. Aus diesen Gründen stellt die pharmakologische Stimulierung der Proteolyse von RAGE eine vielversprechende Therapieform dar. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass eine Steigerung der sRAGE-Bildung über PAC1-, V2- und OT-Rezeptoren möglich ist. Die Untersuchung der PAC1-Signalwege zeigte, dass PKCα/PKCβI, CaMKII, Ca2+-Ionen, PI3-Kinase und der MAP-Kinase-Weg wichtig für die Stimulierung sind und dass der PKA-Weg nicht beteiligt ist. Die dreimonatige Behandlung von Mäusen mit PACAP-38 weist darauf hin, dass eine Stimulierung des Ectodomain Sheddings von RAGE auch in vivo erfolgen kann. Die Untersuchung der Signalwege, ausgehend von den V2- und OT-Rezeptoren, zeigte, dass ebenfalls PKCα/PKCβI, CaMKII, Ca2+-Ionen zur Aktivierung der Proteasen führen, dagegen konnte weder ein Einfluss des PKA- noch des MAP-Kinase-Weges festgestellt werden. Außerdem wurden sowohl MMP-9 als auch ADAM-10 als RAGE-spaltende Proteasen identifiziert. Die nähere Untersuchung der RAGE-Spaltstelle erbrachte, dass keine spezifische Sequenz, sondern vielmehr die Sekundärstruktur eine Rolle bei der Erkennung durch die Proteasen spielt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde weiterhin ein anti-RAGE Antikörper anhand einer neu entwickelten Methode zunächst gereinigt und dann erfolgreich an ein mit dem Fluoreszenzfarbstoff Rhodamin markiertes Polymer gekoppelt. Die Stimulierung der Proteolyse von Meprin β wurde auch untersucht und es konnte ebenfalls eine Beteiligung von ADAM-10 an der Spaltung nachgewiesen werden.

Induction of RAGE shedding by activation of G-protein-coupled receptors

The multiligand Receptor for Advanced Glycation End products (RAGE) is involved in various pathophysiological processes, including diabetic inflammatory conditions and Alzheimers disease. Full-length RAGE, a cell surface-located type I membrane protein, can proteolytically be converted by metalloproteinases ADAM10 and MMP9 into a soluble RAGE form. Moreover, administration of recombinant soluble RAGE suppresses activation of cell surface-located RAGE by trapping RAGE ligands. Therefore stimulation of RAGE shedding might have a therapeutic value regarding inflammatory diseases. We aimed to investigate whether RAGE shedding is inducible via ligand-induced activation of G protein-coupled receptors (GPCRs). We chose three different GPCRs coupled to distinct signaling cascades: the V2 vasopressin receptor (V2R) activating adenylyl cyclase, the oxytocin receptor (OTR) linked to phospholipase Cβ, and the PACAP receptor (subtype PAC1) coupled to adenylyl cyclase, phospholipase Cβ, calcium signaling and MAP kinases. We generated HEK cell lines stably coexpressing an individual GPCR and full-length RAGE and then investigated GPCR ligand-induced activation of RAGE shedding. We found metalloproteinase-mediated RAGE shedding on the cell surface to be inducible via ligand-specific activation of all analyzed GPCRs. By using specific inhibitors we have identified Ca2+ signaling, PKCα/PKCβI, CaMKII, PI3 kinases and MAP kinases to be involved in PAC1 receptor-induced RAGE shedding. We detected an induction of calcium signaling in all our cell lines coexpressing RAGE and different GPCRs after agonist treatment. However, we did not disclose a contribution of adenylyl cyclase in RAGE shedding induction. Furthermore, by using a selective metalloproteinase inhibitor and siRNAmediated knock-down approaches, we show that ADAM10 and/or MMP9 are playing important roles in constitutive and PACAP-induced RAGE shedding. We also found that treatment of mice with PACAP increases the amount of soluble RAGE in the mouse lung. Our findings suggest that pharmacological stimulation of RAGE shedding might open alternative treatment strategies for Alzheimers disease and diabetes-induced inflammation.

Untersuchungen zur Wirkung des Ginkgo-biloba-Extraktes EGb 761 auf die Proteinaggregation in der Huntington-Krankheit

Der Ginkgo biloba-Extrakt EGb 761 besteht aus einer Reihe pharmakologisch wirksamer Substanzen, welche gut beschriebene Wirkungen auf verschiedene potentiell zytoprotektive Signalwege ausüben und u.a. antioxidative Wirksamkeit haben. Folglich wurde EGb 761 bisher als eine natürliche Behandlung bei neurodegenerativen Erkrankungen mit zellulärem oxidativen Stress angewendet, einschließlich der Alzheimer-Krankheit (AD). Aufgrund von vielen gemeinsamen Merkmalen zwischen der AD und der Huntington-Krankheit (HD) wurde vermutet, dass EGb 761 eventuell auch positive Wirksamkeit bei der HD aufweisen könnte. rnDie Neuropathologie der HD wird durch pathologische Verlängerung an Glutamin-Wiederholungen im Huntingtin-Protein (polyQ-Protein) verursacht, wodurch es zu Fehlfaltungen im Protein kommt und hierdurch der proteasomale Abbau aberranter Proteine erschwert wird. Somit sollten in der vorliegenden Arbeit die EGb 761-Wirkungen auf die Proteasom-Aktivität und die Proteinaggregation in zellulären Modellen der HD untersucht werden. rnWie die ersten Untersuchungen in nativen HEK293-Zellen ergaben, bewirkte die Behandlung der Zellen mit EGb 761 eine Steigerung der basalen Proteasom-Aktivität sowie des proteasomalen Proteinabbaus und erhöhte die Transkription proteasomaler Gene. Hieraus ergaben sich Untersuchungen in Zellen mit Expressionen pathologischer Varianten von polyQ-Proteinen als zelluläre Modelle der HD. Hierbei konnte festgestellt werden, dass die Expression aberranter polyQ-Proteine eine verminderte zelluläre Proteasom-Aktivität bewirkte. Interessanterweise verursachte EGb 761 eine Abmilderung der pathologisch-induzierten verminderten Proteasom-Aktivität, in dem die EGb 761-Behandlung der Zellen zu einer erhöhten Proteasom-Aktivität, einem verbesserten proteasomalen Proteinabbau, sowie zu einer erhöhten Transkription proteasomaler Gene führte. Da diese EGb 761-Effekte unabhängig von der Expression aberranter polyQ-Proteine waren, demonstrierten diese Ergebnisse eine allgemeine EGb 761-Wirkungen auf die Proteasom-Aktivität. Anhand dieser Ergebnisse sollten anschließend weitere Untersuchungen mit zellulären Modellen der HD die genau Wirkung von EGb 761 auf die Degradation von abnormal verlängerten polyQ-Proteinen sowie auf die Bildung von polyQ-Aggregaten klären. rnHier konnte gezeigt werden, dass die Expression aberranter polyQ-Proteinen zu einer Akkumulation von SDS-resistenten bzw. SDS-unlöslichen, aggregierten polyQ-Proteinen führte, sowie die Bildung von sichtbaren polyQ-Aggregaten in Zellen bewirkte. Hierbei verursachte eine EGb 761-Behandlung der Zellen eine signifikante Verminderung im Gehalt an SDS-resistenten polyQ-Proteinen sowie eine Reduzierung von Aggregat-tragenden Zellen. Zudem konnte gezeigt werden, dass eine pharmakologische Inhibition des Proteasoms in EGb 761-behandelten Zellen, den Gehalt an SDS-unlöslichen polyQ-Proteinaggregate wieder erhöhte und somit den Effekt von EGb 761 aufhob. Folglich zeigten diese Ergebnisse, dass die EGb 761-induzierte Reduzierung der polyQ-Proteinaggregate durch einen effizienteren proteasomalen Abbau von fehlgefalteten, aberranten polyQ-Proteinen bewirkte wurde. rnAufbauend auf diesen Ergebnissen wurde eine experimentell-therapeutische Anwendung von EGb 761 in Modellen der HD in vitro und in vivo überprüft und hierzu primäre humane Fibroblasten sowie transgene C. elegans Würmer mit Expressionen aberranter polyQ-Proteine untersucht. Interessanterweise konnte in vitro und in vivo gezeigt werden, dass die EGb 761-Behandlung auch hier eine Reduzierung von SDS-unlöslichen polyQ-Proteinen bewirkte und zudem eine Reduzierung des pathologisch erhöhten Gehalts an Polyubiquitin-Proteinen bewirkte. Folglich wurde auch hier vermutet, dass EGb 761 einen verbesserten proteasomalen Abbau von polyQ-Proteinen induzierte und dies eine Verminderung der polyQ-Proteinaggregate verursachte. Darüber hinaus führte die EGb 761-Behandlung von seneszenten Fibroblasten zur Reduzierung von altersabhängig erhöhten Mengen von polyQ-Aggregaten, wodurch ein therapeutischer Effekt auf den proteasomalen Abbau der polyQ-Proteine verdeutlicht wurde. Zusätzlich konnte in polyQ-transgenen C. elegans demonstriert werden, dass eine EGb 761-Behandlung die Abmilderung eines typischen pathologischen Phänotyps bewirkte, indem eine polyQ-induzierte verminderte Motilität der Nematoden verbessert wurde und hierdurch eine positive EGb 761-Wirkung auf die Pathologie der HD in vivo dargestellt wurde. rnZusammenfassend konnten in dieser Arbeit neue Wirkungen von EGb 761 in der HD demonstriert werden. Hierbei wurde gezeigt, dass EGb 761 die Aggregation von pathogenen aberranten polyQ-Proteinen in vitro und in vivo reduziert, indem eine effizientere Degradation von polyQ-Proteinen erfolgt. Somit könnte diese Wirkungen von EGb 761 eine potentiell therapeutische Anwendung in der HD und ähnliche neurodegenerativen Erkrankungen darstellen.

Der Einfluss des Endocannabinoidsystems auf die Alzheimer Pathologie

Die Alzheimer Krankheit ist eine der häufigsten neurodegenerativen Erkrankungen, deren Ursache, abgesehen von einem geringen Prozentsatz vererbter Formen, bisher nicht bekannt ist. Ein wichtiges Ziel der Grundlagenforschung liegt derzeit in der Modulation der APP-spaltenden Enzyme. Durch die Modulation dieser Enzyme könnten weniger schädigende Amyloid β-Peptide entstehen. Die Aktivität des ECS ist in vielen neurodegenerativen Krankheiten verändert. Protektive Eigenschaften der Cannabinoidrezeptoren wurden bei der Alzheimer Krankheit beschrieben. Deshalb sollte in dieser Arbeit der Einfluss des ECS auf die Pathogenese der Alzheimer Erkrankung untersucht werden. In Zellkultursystemen wurde der Einfluss von Cannabinoiden auf die Prozessierung des Amyloid-Vorläuferproteins analysiert. Durch Inkubation der Zellen mit CB1-Rezeptor Agonisten konnte die APP-Prozessierung zugunsten von sAPPα moduliert werden. Gleichzeitig führte die Inkubation mit Cannabinoiden zur reduzierten Amyloid β Menge im Medium der Zellen. In dieser Arbeit konnte die APP-Prozessierung durch die Aktivierung des CB1-Rezeptors zugunsten des nicht-amyloiden Wegs moduliert werden.rnIn einem Tiermodell wurde der Einfluss des CB1-Rezeptors in APP23 transgenen Mäusen untersucht. Der Knockout des CB1-Rezeptors führte in APP23 transgenen Tieren zu weitreichenden biochemischen Veränderungen. APP23/CB1-/--Tiere zeigten eine erhöhte Mortalität und ein sehr geringes Durchschnittsgewicht. Im Vergleich zu APP23/CB1+/+-Tieren führte der CB1-Rezeptor Knockout zur Reduktion der APP-Expression und dessen Prozessierungsprodukten. In den histologischen Untersuchungen wurde eine reduzierte Anzahl an amyloiden Plaques, sowie eine reduzierte Neuroinflammation ermittelt. Biochemische Untersuchungen zeigten, dass der CB1-Rezeptor einen möglichen regulatorischen Einfluss auf die Expression und Prozessierung von APP ausübt. Die Tiere mit der geringsten Plaque-Menge (APP23/CB1-/-) und einer reduzierten Prozessierung von sAPPα- und den CTFs zeigten die schlechteste Lernleistung im Morris Water-Maze. Deshalb müssen andere Faktoren (z.B. die Degradation der Myelinschicht) für die schlechte Lernleistung verantwortlich sein. Mit einem zweiten Tiermodell könnte in CB1-Knockout Mäusen durch den viral-vermittelten Gentransfer eine mögliche Toxizität von Aβ Peptiden untersucht werden. Die in dieser Arbeit ermittelten Ergebnisse zeigen, dass der CB1-Rezeptor an der Regulation der APP-Prozessierung beteiligt ist und zu proteinbiochemischen Veränderungen im Zell- und Tiermodell führt.

Blood-CNS barriers in neurodegenerative diseases

The blood-brain barrier (BBB) and the blood-spinal cord barrier (BSCB) separate the brain and the spinal cord from the circulating blood and are important for the maintenance of the CNS homeostasis. They build a physical barrier thereby protecting the CNS from pathogens and toxic agents, and their disruption plays a crucial role in the pathogenesis of several CNS disorders. In this thesis, the blood-CNS-barriers were studied via in vitro models in two case studies for neurodegenerative disorders, in particular Alzheimer’s disease (AD) and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). The first model evaluates treatment possibilities of AD using nanotechnology-based strategies. Since the toxic amyloid-β42 (Aβ42) peptide plays a crucial role in the pathogenesis of AD, reduced generation or enhanced clearance of Aβ42 peptides are expected to modify the disease course in AD. Therefore, several Aβ42-lowering drugs like flurbiprofen had been tested in clinical trials, but most of them failed due to their low brain penetration. Here, flurbiprofen was embedded in polylactide (PLA) nanoparticles and its transport was examined in an in vitro BBB model. The embedding of flurbiprofen into the nanoparticles disguised its cytotoxic potential and enabled the administration of higher drug concentrations which resulted in a sufficient transport of the drug across an endothelial cell monolayer. These results demonstrate that non-permeable drugs can be transported efficiently via nanoparticles and that these nanotechnology-based strategies are a promising tool to generate novel therapeutic options for AD and other CNS diseases. rnThe focus of the second project was to investigate the impaired integrity of the BSCB in a mouse model for ALS. About 20% of all familial ALS cases are associated with missense mutations or small deletions in the gene that encodes Cu/Zn-superoxide dismutase 1 (SOD1). To date, the molecular mechanisms resulting in ALS are still unknown, but there is evidence that the disruption of the BSCB is one of the primary pathological events. In both familial and sporadic ALS patients, loss of endothelial integrity and endothelial cell damage was observed, and studies with SOD1 transgenic mice demonstrated that the BSCB disruption was found prior to motor neuron degeneration and neurovascular inflammation. Thus, an in vitro model for ALS endothelial cells was generated which exhibited comparable integrity characteristics and tight junction (TJ) protein expression profiles as isolated primary endothelial cells of the BSCB of SOD1 transgenic mice. In this, an alteration of the βcat/AKT/FoxO1 pathway, which regulates the expression of the TJ protein claudin-5, could be observed. These data furthermore indicate that ALS is a neurovascular disease, and understanding of the primary events in ALS pathogenesis will hopefully provide ideas for the development of new therapeutic strategies. rn