18 F-Click-Radiomarkierung polymerer Trägersysteme zur ex vivo- und in vivo-Evaluierung

Die Positronen-Emissions-Tomographie (PET) ist ein leistungsstarkes, nicht-invasives, bildgebendes Verfahren in der Nuklearmedizin und hat darüber hinaus zunehmende Bedeutung in der Arzneistoffentwicklung. Zur Verbesserung des therapeutischen Index von niedermolekularen Pharmaka werden vermehrt Wirkstofftransportsysteme eingesetzt. Eine Klasse dieser Wirkstofftransportsysteme sind Liposomen. Die Weiterentwicklung der klassischen Liposomen sind sogenannte „Stealth“-Liposomen, die eine Polyethylenglykol (PEG)-Korona zur Herabsetzung der Erkennung und Ausscheidung tragen. Zur (Weiter-)Entwicklung und deren in vivo-Evaluierung bietet die PET die Möglichkeit, die Auswirkungen von strukturellen Anpassungen auf die pharmakokinetischen Eigenschaften solcher Transportsysteme zu untersuchen. Zur Evaluierung neuartiger, cholesterolverankerter, linear-hyperverzweigter Polyglycerole (Ch-PEG-hbPG) als sterisch stabilisierende Polymere in Liposomen wurden diese im Rahmen dieser Arbeit mit der prosthetischen Gruppe 18F-TEG-N3 über kupferkatalysierte Alkin-Azid Cycloaddition (CuAAC) in sehr hohen Ausbeuten radiomarkiert. Zum systematischen Vergleich des in vivo-Verhaltens wurde ebenfalls ein cholesterolbasiertes lineares PEG (Ch-PEG) mit CuAAC nahezu quantitativ radiomarkiert. Als drittes Element wurde die Direktmarkierung von Cholesterol mit [18F]F- entwickelt. Diese drei Verbindungen wurden zuerst separat als Einzelkomponenten und anschließend, in Liposomen formuliert, in Tierstudien an Mäusen hinsichtlich ihrer initialen Pharmakokinetik und Biodistribution untersucht. Dabei zeigte sich ein ähnliches Verhalten der neuartigen Ch-PEG-hbPG-Derivate zu den bekannten Ch-PEG, mit dem Vorteil der Multifunktionalität an den hyperverzweigten Strukturen. Die liposomalen Strukturen mit der neuartigen sterischen Stabilisierung wiesen eine erhöhte Blutzirkulationszeit und vorteilhafte Blut-zu-Leber- und Blut-zu-Lunge-Verhältnisse im Vergleich zu den linear stabilisierten Analoga auf.rnEine weitere Klasse von Wirkstofftransportsystemen sind polymere Trägersysteme wie pHPMA. Alkinfunktionalisierte Polymere konnten in zwei verschiedenen Größen (~12 und 60 kDa) mittels CuAAC in sehr hohen Ausbeuten mit der prosthetischen Gruppe 18F-TEG-N3 radiomarkiert werden. Bicyclononinderivate der gleichen Größen konnten ohne Kupferkatalyse über ringspannungsvermittelte Alkin-Azid-Cycloaddition (SPAAC) mikrowellengestützt markiert werden und stehen somit zur in vivo-Untersuchung hinsichtlich des Einflusses der Markierungsart zur Verfügung.

Synthese und Charakterisierung von HPMA-stabilisierten Kolloiden sowie deren Evaluierung in vitro und in vivo

Nanodimensionale Wirkstoff-Trägersysteme sind in der Lage, sowohl die Bioverfügbarkeit als auch das pharmakokinetische Profil von Wirkstoffen drastisch zu verbessern. Hauptgründe dafür sind eine erhöhte Plasma-Halbwertszeit durch die größenbedingte verminderte renale Ausscheidung und eine gesteigerte Anreicherung im Tumorgewebe durch den EPR-Effekt. Diese Arbeit beschreibt die Synthese und Entwicklung neuer kolloidaler Wirkstoff-Trägersysteme, welche biokompatibel, teilweise bioabbaubar und funktionalisierbar sind. Ein Fluoreszenzfarbstoff wurde als hydrophobes Wirkstoffmodell eingekapselt. Wohldefinierte, eng verteilte und funktionalisierbare HPMA-basierte Block- und statistische Copolymere unterschiedlicher Molekulargewichte (10-25 kDa) und hydrophiler/hydrophober Zusammensetzung (10-50 mol%) wurden mittels RAFT- Polymerisation in Kombination mit dem Reaktivesteransatz hergestellt und in Miniemulsionsprozesse eingesetzt, um ihre Stabilisierungseffizienz zu untersuchen. Dabei zeigte sich, dass die kleineren Copolymere (10 kDa) mit einem Einbau von 10 mol% LMA, sowohl im Modellsystem Polystyrol, als auch im bioabbaubaren PDLLA-System, besonders geeignet sind und ergaben monodisperse Kolloide im Größenbereich von 100 bis 300 nm. Die kolloidalen Systeme zeigten keine Wirkung auf die Zellviabilität. In Folge dessen wurde das Aggregationsverhalten in humanem Blutserum mittels DLS untersucht, wobei keine Interaktion mit Blutbestandteilen festgestellt werden konnte. Zellaufnahmestudien wurden an HeLa-Zellen durchgeführt, um das Schicksal der Kolloide in vitro zu untersuchen. Dabei wurden Kernmaterial, Hülle und das hydrophobe Wirkstoffmodell durch unterschiedliche Fluoreszenzmarkierung getrennt betrachtet. Das hydrophobe Wirkstoffmodell wurde allein durch Interaktion der Kolloide mit den Zellen übertragen, was für eine diffusionsbedingte, initiale, aber unspezifische Freisetzung spricht. Eine solche Freisetzungskinetik kann durch Verwendung von Nitroglycerin, als vasodilatierender Wirkstoff mit geringer unspezifischer Wirkung, ausgenutzt werden, um den EPR-Effekt zu unterstützen. Die Aufnahme des Partikels hingegen geschieht zeitverzögert. Das Schicksal der Kolloide (sowohl des Kern- und desrnHüllmaterials) wurde durch doppelte Fluoreszenzmarkierung untersucht. Dabei kam es zu einer intrazellulären Ablösung der stabilisierenden Block-Copolymere zwischen 8 und 24 h. Nach Aufklärung der Aufnahme- und Freisetzungskinetiken wurde nun die Körperverteilung der PS- und PDLLA-Kolloide nach 18F-Markierung mittels PET und ex vivo-Biodistributiosstudien untersucht. Dabei hatte das Kernmaterial einen Einfluss auf die Körperverteilung. PET-Studien in Mäusen zeigten, dass die stabilisierenden Block-Copolymere beider Kolloide ein starkes Signal in der Niere geben, wobei das der PS-Kolloide weiter ausgeprägt war. Darüber hinaus war eine Anreicherung dieser in Lunge, Leber und Milz festzustellen. Die Verdrängung der stabilisierenden Polymere durch die Interaktion mit Blutbestandteilen erklärt dabei das erhöhte Nieren- und Blasensignal der PS- Kolloide. Das Anreicherungsmuster der PDLLA-Kolloide hingegen zeigte neben der Nierenakkumulation eine erhöhte Blutaktivität und somit die gewünschten langzirkulierenden Eigenschaften. Diese Ergebnisse konnten auch mittels ex vivo- Biodistributionsstudien bestätigt werden. Um die Tumoranreicherung weiter zu verbessern wurde die Verwendung von Folat als Erkennungsstruktur am einfachen HPMA-Polymer untersucht. Die Konjugate zeigten eine erhöhte Anreicherung im Vergleich zu den Polymeren ohne Erkennungsstrukturen. Blockadestudien bestätigten die Selektivität der Anreicherung. Diese Daten zeigen das Potential der Folat-Erkennungsstruktur in vivo innerhalb kurzer Zeitfenster, welche nun auf kolloidale Systeme übertragen werden kann.

Einsatz eines Aerosolmassenspektrometers während der CYPHEX-Kampagne und zur Methodenentwicklung einer Echtzeitquantifizierung gasförmiger Amine

Atmosphärische Aerosole haben einen starken Einfluss auf das Klima, der bisher nur grundlegend verstanden ist und weiterer Forschung bedarf. Das atmosphärische Verhalten der Aerosolpartikel hängt maßgeblich von ihrer Größe und chemischen Zusammensetzung ab. Durch Reflexion, Absorption und Streuung des Sonnenlichtes verändern sie den Strahlungshaushalt der Erde direkt und durch ihre Einflussnahme auf die Wolkenbildung indirekt. Besonders gealterte, stark oxidierte organische Aerosole mit großem Sauerstoff-zu-Kohlenstoff-Verhältnis wirken als effektive Wolkenkondensationskeime. Neben primären Aerosolpartikeln, die direkt partikelförmig in die Atmosphäre gelangen, spielen sekundäre Aerosolpartikel eine große Rolle, die aus Vorläufergasen in der Atmosphäre entstehen. Aktuelle Forschungsergebnisse legen nahe, dass kurzkettige aliphatische Amine bei Nukleationsprozessen beteiligt sind und somit die Partikelneubildung vielerorts mitsteuern. Um die Rolle von Aminen in der Atmosphäre besser erforschen und industrielle Emissionen kontrollieren zu können, bedarf es einer zuverlässigen Methode zur Echtzeitquantifizierung gasförmiger Amine mit hoher Zeitauflösung und niedriger Nachweisgrenze.rnDas hochauflösende Flugzeit-Aerosolmassenspektrometer (HR-ToF-AMS) bietet die Möglichkeit, atmosphärische Partikel in Echtzeit zu analysieren. Dabei werden Größe, Menge und grundlegende chemische Zusammensetzung erfasst. Anorganische Aerosolbestandteile können eindeutig zugeordnet werden. Es ist jedoch kaum möglich, einzelne organische Verbindungen in den komplizierten Massenspektren atmosphärischer Aerosole zu identifizieren und quantifizieren.rnIn dieser Arbeit wird atmosphärisches Aerosol untersucht, das im Westen Zyperns während der CYPHEX-Kampagne mit einem HR-ToF-AMS gemessen wurde. An diesem Standort ist vor allem stark gealtertes Aerosol vorzufinden, das aus Zentral- und Westeuropa stammt. Lokale Einflüsse spielen fast keine Rolle. Es wurde eine durchschnittliche Massenkonzentration von 10,98 μg/m3 gefunden, zusammengesetzt aus 57 % Sulfat, 30 % organischen Bestandteilen, 12 % Ammonium, < 1 % Nitrat und < 1 % Chlorid, bezogen auf das Gewicht. Der Median des vakuum-aerodynamischen Durchmessers betrug 446,25 nm. Es wurde sehr acides Aerosol gefunden, dessen anorganische Bestandteile weitgehend der Zusammensetzung von Ammoniumhydrogensulfat entsprachen. Tag-Nacht-Schwankungen in der Zusammensetzung wurden beobachtet. Die Sulfatkonzentration und die Acidität zeigten tagsüber Maxima und nachts Minima. Konzentrationsschwankungen an Nitrat und Chlorid zeigten einen weniger ausgeprägten Rhythmus, Maxima fallen aber immer mit Minima der Sulfatkonzentration, Aerosolacidität und Umgebungstemperatur zusammen. Organische Aerosolbestandteile entsprachen stark gealtertem, schwerflüchtigem oxidiertem organischem Aerosol. Es wurde eine interne Mischung der Partikel beobachtet, die ebenfalls meist bei alten Aerosolen auftritt.rnUm mit dem HR-ToF-AMS auch einzelne organische Verbindungen identifizieren und quantifizieren zu können, wurde eine Methode entwickelt, mit der man Amine der Gasphase selektiv in künstlich erzeugte Phosphorsäurepartikel aufnimmt und so für die HR-ToF-AMS-Messung zugänglich macht. Dadurch kombiniert man die Vorteile der Online-Messung des HR-ToF-AMS mit den Vorteilen klassischer Offline-Probenahmen. So können in Echtzeit sehr einfache Massenspektren gemessen werden, in denen störende Komponenten abgetrennt sind, während die Analyten eindeutig identifiziert werden können. Systeme dieser Art wurden GTRAP-AMS (Gaseous compound TRapping in Artificially-generated Particles – Aerosol Mass Spectrometry) genannt. Kalibrierungen für (Mono)Methylamin, Dimethylamin, Trimethylamin, Diethylamin und Triethylamin ergaben Nachweisgrenzen im ppt-Bereich bei einer Zeitauflösung von 3 min. Kammerexperimente zur Aminemission von Pflanzen zeigten eine gute Übereinstimmung des neu entwickelten Systems mit einer Gasdiffusionsabscheider-Offline-Probenahme und anschließender ionenchromatographischer Analyse. Beide Methoden zeigten Reaktionen der Pflanzen auf eine Veränderung der Lichtverhältnisse, während erhöhte Ozonkonzentrationen die Aminemission nicht veränderten. Die GTRAP-AMS-Methode eignet sich bereits für die Messung von Umgebungsluftkonzentrationen an einigen Orten, für die meisten Orte reicht die Nachweisgrenze allerdings noch nicht aus. Die Technik könnte bereits zur Echtzeitkontrolle industrieller Abgasemissionen eingesetzt werden.

Charge generation and recombination in solid-state dye-sensitized solar cells

Diese Doktorarbeit befasst sich mit Ladungsgeneration und – rekombination in Feststoff-Farbstoffsolarzellen, die spiro-OMeTAD als Lochleiter verwenden. Die vorliegende Arbeit ist in drei Fallstudien unterteilt: i.) Kern-erweiterte Rylen-Farbstoffe, ii.) ein Perylenmonoimid-Farbstoff und iii.) Donor-π verbrückte (Cyclopentadithiophen)-Akzeptor-Farbstoffe. Trotz ihres hohen molaren Extinktionskoeffizienten und der hohen Absorbanz der sensibilisierten Filme, zeigen einige dieser Farbstoffmoleküle nur geringe photovoltaischen Effizienzen. Um den Ursprung des geringen Wirkungsgrades herauszufinden, wurde breitbandige, ultraschnelle transiente Absorptionsspektroskopie an Solarzellen durchgeführt.rnInsbesondere die Auswirkungen verschiedender Ankergruppen, Dipolmomente, Photolumineszenzlebenszeiten, Lithium-Kationensensitivität und Ladungsträgerdynamik, die alle einen großen Einfluss auf den Wirkungsgrad der Solarzelle besitzen, wurden untersucht. In der ersten Fallstudie zeigte ein kurzer Rylen-Farbstoff aufgrund deutlich verlängerter Lebenszeiten die beste Effizienz im Vergleich zu größeren Kern-erweiterten Rylen-Farbstoffen. Die Lebenszeit wurde weiter reduziert, wenn Maleinsäure als Ankergruppe unter einer Ringöffnungsreaktion an die mesoporöse Oberfläche des Metalloxid-Halbleiters adsorbierte. Dies konnte mit Hilfe von Berechnungen mittels der Dichtefunktionaltheorie (DFT, B3LYP) auf die Differenz des Dipolmoments zwischen Grundzustand und angeregtem Zustand zurückgeführt werden. Die Berechnungen bekräftigen die unvorteilhafte Injektion von Ladungen durch die Änderung der Richtung des Dipolmoments, wenn eine Ringöffnung der Anhydridgruppe stattfindet. In der zweiten Studie zeigte das Perylenmonoimid-Derivat ID889 einen Wirkungsgrad von 4.5% in Feststoff-Farbstoffsolarzellen, wobei ID889 sogar ohne Zuhilfenahme eines Additivs in der Lage ist langlebige Farbstoffkationen zu bilden. Die Verwendung von Lithium-Kationen stabilisiert jedoch sowohl den Prozess der Ladungsgeneration als auch den der Ladungsregeneration. Des Weiteren wurde in ID889-sensitivierten Bauteilen kein reduktives Löschen beobachtet. Dabei wurde die Dynamik der Exzitonen mittels einer soft-modelling Methode Kurvenanalyse aus den Daten der transienten Absorptionsspektroskopie gewonnen. Zuletzt wurden Strukturen mit Cyclopentadithiophen(CPDT)-Baustein untersucht, die eine typische D-π-A Molekülstruktur bilden. FPH224 und 233 zeigten dabei eine bessere Effizienz als FPH231 und 303 aufgrund einer großen Injektionseffizienz (IE) und längerer Lebenszeit der angeregten Zustände. Dies kann auf reduktives Löschen in FPH231 und 303 zurückgeführt werden, wohingegen FPH224 und 233 einen moderaten Zerfall des Spirokationensignals zeigten.

Sensing applications of biofunctionalised plasmonic gold nanoparticles

Plasmonische Metallnanopartikel bündeln, verstärken und beeinflussen Licht auf nanoskopischer Ebene. Diese grundlegende Eigenschaft kommt von koheränten, kollektiven Schwingungen der Leitungsbandelektronen, die von einfallendem Licht resonant angeregt und lokalisierte Oberflächenplasmonenresonanz (LSPR) oder ‚Partikelplasmonen‘ genannt werden. Plasmonen in Metallnanopartikeln wurden bisher z.B. zur Erkennen von pathogenen Biomolekülen, bei der photothermischen Therapie und zur Verbesserung der Effizienz von Solarzellen verwendet. In dieser Arbeit werde ich meinen Fokus auf die Synthese und Funktionalisierung von Goldnanopartikeln zur Anwendung als Sensoren legen.rnrnKürzliche Verbesserungen in der nasschemischen Synthese haben zur Herstellung von Goldnanopartikel mit unterschiedlichen Formen und Größen geführt, die sich in ihren Sensoreigenschaften unterscheiden. Unter den unterschiedlichen Sensorgeometrien sind Goldnanostäbchen die bevorzugte Form zur Biomolekül-Sensorik durch LSPR. Nanostäbchen werden durch eine positiv geladene CTAB-Schicht stabilisiert, die Proteine bei neutralem pH-Wert anziehen kann. Die Adsorption und Desorption von Proteinen an der Nanopartikeloberfläche und damit die Bindungskinetiken von Proteinen kann auf Einzelmolekülebene erforscht werden. Ich zeige hier eine Studie mit hoher örtlicher und zeitlicher Auflösung um einzelne Bindungsereignisse von Fibronectin auf Goldnanostäbchen darzustellen.rnrnGoldnanostäbchen müssen mit spezifischen biologischen Erkennungselementen funktionalisiert werden um eine Analyterkennung oder Proteinwechselwirkung zu erreichen. Ich funktionalisiere Goldnanostäbchen mit kurzen DNA-Sequenzen (Aptamer-Sequenzen und NTA konjugierten Polihymidinen) und habe anhand diese unterschiedlich sensitiven Partikel eine Studie mit verschiedenen Analyten (oder Protein-Protein Wechselwirkungen) erfolgreich durchgeführt.rn rnPlasmonen von Nanopartikel-Clustern koppeln miteinander, was ihre Resonanzenergie ändert. Der kontrollierte Zusammenbau von Nanopartikeln zu Dimeren oder höher geordneten Strukturen wie ‚Core-Satellites‘ können dazu dienen ihre Sensitivität zu erhöhen. Diese Cluster bieten eine hohe Sensitivität auf Grund der Anwesenheit von plasmonischen Hotspots in der Lücke zwischen zwei Partikeln. Die Plasmonkopplung ist ein Phänomen, das abhängig vom Abstand zweier Partikel zueinander ist und bildet somit die Basis von sogenannten Plasmon-Linealen. Ich habe eine Strategie entwickelt um Dimere aus Hsp90 funktionalisierten Goldnanosphären zu bilden. Diese Technik wird nicht durch Ausbleichen oder das Blinken von Farbstoffen limitiert und ich zeige zum ersten Mal wie man dadurch dynamische Proteinkonformationen untersuchen kann.rn

Synthese und Charakterisierung von Polymer-Wirkstoff-Antikörper-Konjugaten zur Anwendung in der Krebsimmuntherapie

Polymere Wirkstoffsysteme gewinnen im Bereich der biomedizinischen Forschung immer größeres Interesse. Vielversprechende Systeme für die Entwicklung von neuartigen Krebs-immun¬therapien stellen insbesondere Polymer-Konjugate dar. Das ideale Polymer-Konjugat besitzt eine Größe zwischen 10 nm und 100 nm, ist nicht zytotoxisch und zeigt keine Aggregation in humanem Blutserum. In der vorliegenden Arbeit wurde die Synthese und Charakterisierung von Polymer-Wirkstoff-Konjugaten zur Anwendung in der Krebsimmuntherapie behandelt. Erstes Ziel der Arbeit war es, geeignete polymere Trägersysteme für die in vivo Anwendung zu finden. Hierzu wurde zunächst die Stabilität verschiedener potentieller polymerer Träger-systeme (Nanohydrogele, Succinyliertes-Poly-L-Lysin (Bürste), ELP-Bürsten und Poly(2-oxazolin)bürsten) in humanem Serum untersucht. Weiterhin wurde die unspezifische Zellaufnahme in murinen dendritischen Zellen (DCs) analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass vor allem neutrale bzw. zwitterionische Partikel eine hohe Serumstabilität sowie keine unspezifische Zellaufnahme zeigen. Um eine gezielte Adressierung der DCs des Immunsystems zu erreichen und dadurch eine Immunantwort gegenüber einem bestimmten Krebs Zelltyp zu induzieren, wurden Biokonjugate - auf Basis der Succinylierten-Poly-L-Lysin-(Bürste) sowie der Azid-funktionalisierten Poly(2-oxazolin)bürste (POx) – entwickelt, da diese Polymerbürsten keine bzw. kaum unspezifische Aufnahme in DCs zeigen. Hierbei diente der Antikörper aDEC205 der gezielten Adressierung von CD8+ DCs. Die weiteren bioaktiven Komponenten waren das tumorassoziierte Antigen (TAA) mit der Kernsequenz SIINFEKL zur Induktion einer spezifischen Immunantwort sowie der immunaktivierende TLR9 Ligand, CpG1826. Die Komponenten wurden nacheinander an die Fluoreszenz-markierten Polymere kon¬jugiert. Die Konjugation des Antikörpers erfolgte nach vorangegangener DIBO-Modifizierung über kupferfreie Click-Chemie. Mit einer optimierten Aufarbeitungsmethodik gelang es, aggregat-freie, unimere DIBO-modifizierte aDEC205 Antikörper zu isolieren. Für die succinylierten Poly-L-Lysine konnten keine eindeutigen sowie reproduzierbaren Ergebnisse erhalten werden, sodass sich im weiteren Verlauf der Arbeit auf die POx konzentriert wurde. Die Konjugation von aDEC205 an POx wurde mittels verschiedener physiko-chemischer Methoden (UV-VIS, SDS-PAGE, FCS, GPC, CLSM und FACS) gezeigt. Mit Hilfe von „Specific-Hybridization-Internalisation-Sensor“ Experimenten konnte eine spezifische Aufnahme des Konjugats in CD8+ DCs nachgewiesen werden. rnDie Konjugation von Antigen und CpG erfolgte ebenso nach entsprechender Modifizierung über kupferfreie Click-Chemie. SDS-PAGE, UV-VIS und FCS bestätigten eine erfolgreiche Kopplung. T-Zell-Proliferationsversuche ergaben für Antigen enthaltende Polymer-Konjugate eine CD8+ T-Zell-Aktivierung. Des Weiteren zeigten die POx keine bemerkenswerte Toxizität und deren Konjugate keine Aggregation in humanem Serum. rnrnDarüber hinaus wurde der Einfluss verschiedener Polymertopologien auf ihre Biodistribution sowie Blutzirkulation untersucht. Für die nach GPC-Fraktionierung erhaltenen verschiedenen Polymerfraktionen - hochmolekulare wurmartige Polymerbürsten, ellipsoidartige Polymer-bürsten und niedermolekulare kugelförmige Moleküle - konnten vielversprechende Ergebnisse erhalten werden.

Dynamics of small interfering RNA - FRET based integrity measurements of siRNA in the cuvette & inside cells

RNAi ist ein bedeutendes Werkzeug zur Funktionsanalyse von Genen und hat großes Potential für den Einsatz in der Therapie. Obwohl effiziente Knockdowns in der Zellkultur erzielt werden, erweist sich eine in vivo Anwendung als schwierig. Die großen Hürden sind dabei der Transport der siRNA ins Zielgewebe und deren voranschreitende Degradierung.rnMarkierte siRNA kann sowohl zur eigenen Integritätsmessung als auch zur Lokalisierung verwendet werden. Zwei Farbstoffe an den jeweiligen 3’- bzw. -5’-Enden des Sense- bzw. Antisense-Stranges erzeugen ein robustes FRET-System (Hirsch et al. 2012). Das Verhältnis von FRET- zu Donor-Signal, das R/G-Ratio, dient zur sensitiven Klassifizierung des Integritätslevels einer siRNA Probe (Järve et al. 2007; Hirsch et al. 2011; Kim et al. 2010). Mit diesem System kann eine Degradierung von weniger als 5 % in der Küvette und in Zellen nachgewiesen werden.rnDie vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Evaluierung von potentiellen FRET Farbstoffpaaren hinsichtlich deren Eignung für in vitro und in vivo Anwendung. Verschiedenste FRET-Paare, die das gesamte sichtbare Spektrum abdecken, wurden evaluiert und ermöglichen nun die Auswahl eines geeigneten Paares für die jeweilige Anwendung oder Kombination mit anderen Farbstoffen.rnMit Hilfe von Alexa555/Atto647N siRNA wurde ein erfolgreicher Einschluss von siRNA in Liposomen beobachtet. Eine anschließende Evaluierung der RNase-Protektion ergab für Liposomen, Nanohydrogele und kationische Peptide hervorragende protektive Eigenschaften. Basierend auf den Ergebnisse können diese und andere Transportsysteme nun für eine zelluläre Aufnahme optimiert werden.rnAtto488/Atto590 zeigte die besten Eigenschaften für Echtzeit-Integritätsmessungen in der Lebendzellmikroskopie. Verringerte Bleicheigenschaften und minimaler spektraler “Cross-Talk” ermöglichten es, transfizierte Zellen über einen Zeitraum von bis zu 8 Stunden zu beobachten. Mittels Atto488/Atto590 siRNA wurde die Einschleusung und Freisetzung in Zellen in Echtzeit untersucht. Dabei konnten Freisetzung und Verteilung in einzelnen Zellen beobachtet und analysiert werden. rnAuf eine anfängliche Phase mit hoher Freisetzungsrate folgte eine Phase mit geringerer Rate für den restlichen Beobachtungszeitraum. Die durchschnittliche Verweildauer im Zytosol betrug 24 und 58 Minuten, wobei zwischen lang- und kurzanhaltenden Ereignissen unterschieden werden konnte. Obwohl ein Import von siRNA in den Zellkern beobachtet wurde, konnte kein Schema bzw. genauer Zeitpunkt, in Bezug auf den Transfektionszeitraum für diese Ereignisse bestimmt werden. Die beobachteten Freisetzungsprozesse fanden sporadisch statt und Änderungen in der zellulären Verteilung geschahen innerhalb von wenigen Minuten. Einmal freigesetzte siRNA verschwand mit der Zeit wieder aus dem Zytosol und es blieben nur kleine Aggregate von siRNA mit immer noch geringer Integrität zurück.rn

Non-parametric estimation of the diffusion coefficient of a branching diffusion with immigration

Wir betrachten Systeme von endlich vielen Partikeln, wobei die Partikel sich unabhängig voneinander gemäß eindimensionaler Diffusionen [dX_t = b(X_t),dt + sigma(X_t),dW_t] bewegen. Die Partikel sterben mit positionsabhängigen Raten und hinterlassen eine zufällige Anzahl an Nachkommen, die sich gemäß eines Übergangskerns im Raum verteilen. Zudem immigrieren neue Partikel mit einer konstanten Rate. Ein Prozess mit diesen Eigenschaften wird Verzweigungsprozess mit Immigration genannt. Beobachten wir einen solchen Prozess zu diskreten Zeitpunkten, so ist zunächst nicht offensichtlich, welche diskret beobachteten Punkte zu welchem Pfad gehören. Daher entwickeln wir einen Algorithmus, um den zugrundeliegenden Pfad zu rekonstruieren. Mit Hilfe dieses Algorithmus konstruieren wir einen nichtparametrischen Schätzer für den quadrierten Diffusionskoeffizienten $sigma^2(cdot),$ wobei die Konstruktion im Wesentlichen auf dem Auffüllen eines klassischen Regressionsschemas beruht. Wir beweisen Konsistenz und einen zentralen Grenzwertsatz.

Particles with tunable functionality by a nonaqueous emulsion polymerization approach

Diese Dissertation demonstriert die Synthese von funktionalen organischen Partikeln mit einem anwendungsspezifischen Fokus. Der Startpunkt dieser Partikel stellte stets die nicht-wässrige Emulsionspolymerisation dar. Diese Art der Emulsion besteht aus zwei nicht-mischbaren organischen Lösungsmitteln. Zur Stabilisierung der auftretenden Grenzflächenspannung zwischen den beiden organischen Phasen musste ein amphiphiles Blockcopolymer als Emulgator eingesetzt werden. Der Vorteil gegenüber der klassischen wässrigen Emulsionspolymerisation liegt im breiteren Portfolio an anwendbarer Polymerisationstechniken (z.B. Polykondensation) und zu verwendenden Komponenten (wassersensitive Chemikalien). rnrnSo wurde auf Basis einer wassersensitiven ringöffnenden Polymerisation von L-Lactid ein Wirkstoffträger synthetisiert, welcher eine selektive Freisetzung eines Zytostatikums in Tumorgewebe zeigte. Die Wirkstofffreisetzung war auf eine selektive Spaltung eines im Partikel befindlichen Peptids, welches von tumorassoziierenden Enzymen erkannt wird, zurückzuführen.rnrnDas nicht-wässrige Emulsionssystem wurde zudem zur Synthese von porösen Poly(Urethan)-Partikeln verwendet. Die Porosität wurde präzise durch eine definierte Wassermenge im System eingestellt. Die Ethylen-Polymerisation nach Katalysator-Beladung demonstrierte die Abhängigkeit der Aktivität und des Fragmentierungsverhaltens von der Partikelporosität.rnrnZuletzt wurde ein amphiphiles Blockcopolymer synthetisiert, welches Partikel in unpolaren Lösungsmitteln und in Wasser stabilisieren kann. Die Polarität des unpolaren, hydrophoben Polymerblocks konnte durch UV-Bestrahlung und einer resultierenden Abtrennung unpolarer Gruppen vom polaren Polymerrückgrat umgekehrt werden. So gelangen eine Hydrophilisierung der Partikeloberfläche und eine Stabilisierung der Partikel in wässrigem Medium, ohne Zusatz weiterer Tenside.

Non-aqueous dispersions of particles and their applications

In the current work, three studies about non-aqueous dispersions of particles were carried out by using an amphiphilic block copolymer poly(isoprene)-block-poly(methyl methacrylate) (PI-b-PMMA) as stabilizer:rn1. Dispersions of polyurethane and polyurea porous particles for polymer compositesrn2. Dispersions of PMMA and PU particles with PDI dye for study of Single Molecule Spectroscopy Detectionrn3. Dispersions of graphene nanosheets for polymer compositesrnrnIn the first study, highly porous polyurethane and polyurea particles were prepared in a non-aqueous emulsion. The preparation of porous particles consisted of two parts: At first, a system was developed where the emulsion had high stability for the polymerization among diisocyanate, diol and water. In the second part, porous particles were prepared by using two methods fission/fusion and combination by which highly porous particles were obtained. In this study, the applications of porous particles were also investigated where polyurethane particles were tested as filling material for polymer composites and as catalyst carrier for polyethylene polymerization. rnrnIn the second study, PMMA and PU particles from one non-aqueous emulsion were investigated via single molecule fluorescence detection. At first the particles were loaded with PDI dye, which were detected by fluorescence microscopy. The distribution and orientation of the PDI molecules in the particles were successfully observed by Single Molecule Fluorescence Detection. The molecules were homogenously distributed inside of the particles. In addition they had random orientation, meaning that no aggregations of dye molecules were formed. With the results, it could be supposed that the polymer chains were also homogenously distributed in the particles, and that the conformation was relatively flexible. rnrnIn the third part of the study, graphene nanosheets with high surface area were dispersed in an organic solvent with low boiling point and low toxicity, THF, stabilized with a block copolymer PI-b-PMMA. The dispersion was used to prepare polymer composites. It was shown that the modified graphene nanosheets had good compatibility with the PS and PMMA matrices. rn

Fast frontend electronics for high rate particle detectors

Future experiments in nuclear and particle physics are moving towards the high luminosity regime in order to access rare processes. In this framework, particle detectors require high rate capability together with excellent timing resolution for precise event reconstruction. In order to achieve this, the development of dedicated FrontEnd Electronics (FEE) for detectors has become increasingly challenging and expensive. Thus, a current trend in R&D is towards flexible FEE that can be easily adapted to a great variety of detectors, without impairing the required high performance. This thesis reports on a novel FEE for two different detector types: imaging Cherenkov counters and plastic scintillator arrays. The former requires high sensitivity and precision for detection of single photon signals, while the latter is characterized by slower and larger signals typical of scintillation processes. The FEE design was developed using high-bandwidth preamplifiers and fast discriminators which provide Time-over-Threshold (ToT). The use of discriminators allowed for low power consumption, minimal dead-times and self-triggering capabilities, all fundamental aspects for high rate applications. The output signals of the FEE are readout by a high precision TDC system based on FPGA. The performed full characterization of the analogue signals under realistic conditions proved that the ToT information can be used in a novel way for charge measurements or walk corrections, thus improving the obtainable timing resolution. Detailed laboratory investigations proved the feasibility of the ToT method. The full readout chain was investigated in test experiments at the Mainz Microtron: high counting rates per channel of several MHz were achieved, and a timing resolution of better than 100 ps after walk correction based on ToT was obtained. Ongoing applications to fast Time-of-Flight counters and future developments of FEE have been also recently investigated.

Saccharide based nanocapsules - From monomer building blocks to improved capsules properties

In dieser Arbeit wurde der vielfältige Nutzen von Kohlenhydraten in Nanokapsel Systemen untersucht. Drei verschiedene Nanokapsel-Typen wurden durch Reaktion an der Grenzfläche von inversen Miniemulsionen hergestellt. Es wurde gezeigt, dass die Kohlenhydrate nach Modifizierung als Monomer an der Kapselbildung teilnehmen können, oder zur Erhöhung der Sensitivität eines verkapselten Kontrastmittels beitragen können. Im Folgenden werden die Ergebnisse der einzelnen Projekte zusammengefasst. Eine neuartige Grenzflächen-Synthese zur Herstellung von Nanokapseln wurde entwickelt und untersucht. Bei der Reaktion handelt es sich um eine Ruthenium katalysierte Olefin-Kreuzmetathese, welche für die Reaktion an der Grenzfläche angepasst wurde. Als wasserlösliches Macromonomer wurde Dextranacrylat synthetisiert. Der Reaktionspartner war ein öl-löslichen Phosphoester (Phenyldi(undec-10-en-1-yl)phosphat). Anhand von NMR-Spektren wurde gezeigt, dass die Kapselbildung auf Olefin Kreuzmetathese beruht. Im Vergleich zu konventionellen Estern haben Phosphorester eine weitere Möglichkeit zur chemischen Funktionalisierung. Dies wurde exemplarisch durch die Verwendung von fluoreszenzmarkierten Phosphoestern gezeigt. Die Markierung wurde verwendet, um die pH-induzierte Abbaubarkeit der Nanokapseln mittels Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie zu beobachten. Ziel des zweiten Projekts war es, Nanostrukturen zu entwickeln, um Infektionen mit Antibiotika-resistenten Bakterien lokal zu behandeln. Dazu wurden mit Dextranmethacrylat vernetzte Poly(acrylamid) basierte Nanogele synthetisiert und Zinknitrat zugesetzt. Die Synthese der Nanogele wurde erweitert, um durch Vernetzung freier Alkoholgruppen mit Toluoldiisocyanat eine Kapselschale zu erhalten. Die Schalenbildung spiegelte sich in einer geringeren Quellbarkeit der Gel- Schale-Hybride wieder. Die erhaltenen Gel-Schale-Hybride waren in der Lage das Wachstum von zwei Methicillin-resistenten Bakterienstämmen (S. aureus) zu unterdrücken und verzögern. Die synthetisierten Hybridstrukturen könnten in der Beschichtung von Wundauflagen Verwendung finden, um bakterielle Infektionen lokal und direkt nach Ausbruch zu behandeln. Ziel des dritten Projektes war es, die wichtigen Parameter in der Herstellung von Nanokapseln mit hoher Kontrastmittel Sensitivität zu identifizieren. Relaxivität/Signalsensitivität des Kontrastmittels ist von großer Bedeutung für die Bildgebung mittels MRI, dies kann durch die Begrenzung der Mobilität des Kontrastmittels erreicht werden. Aufgrund seiner hohen Komplexstabilität und seiner klinischen Bedeutung wurde das Kontrastmittel Gadobutrol für die Verkapselung verwendet. Das Kontrastmittel wurde in Polyharnstoff-Kapseln eingeschlossen, die durch einen inversen Miniemulsion-Prozess hergestellt wurden. Um die Viskosität im Inneren der Nanokapsel zu erhöhen, wurden zusätzlich Saccharose, Dextran und Polyacrylsäure verkapselt. In Gegenwart von Saccharose konnte die Relaxivität verdoppelt werden. Dies gründet sich vermutlich auf einem Second-sphere Effekt der Saccharose, einer auf Wasserstoffbrückenbindungen beruhende Interaktion von Kontrastmittel und Saccharose.

Stratospheric aerosol extinction retrieved from SCIAMACHY measurements in limb geometry

Stratosphärische Partikel sind typischerweise mit dem bloßen Auge nicht wahrnehmbar. Dennoch haben sie einen signifikanten Einfluss auf die Strahlungsbilanz der Erde und die heteorogene Chemie in der Stratosphäre. Kontinuierliche, vertikal aufgelöste, globale Datensätze sind daher essenziell für das Verständnis physikalischer und chemischer Prozesse in diesem Teil der Atmosphäre. Beginnend mit den Messungen des zweiten Stratospheric Aerosol Measurement (SAM II) Instruments im Jahre 1978 existiert eine kontinuierliche Zeitreihe für stratosphärische Aerosol-Extinktionsprofile, welche von Messinstrumenten wie dem zweiten Stratospheric Aerosol and Gas Experiment (SAGE II), dem SCIAMACHY, dem OSIRIS und dem OMPS bis heute fortgeführt wird. rnrnIn dieser Arbeit wird ein neu entwickelter Algorithmus vorgestellt, der das sogenannte ,,Zwiebel-Schäl Prinzip'' verwendet, um Extinktionsprofile zwischen 12 und 33 km zu berechnen. Dafür wird der Algorithmus auf Radianzprofile einzelner Wellenlängen angewandt, die von SCIAMACHY in der Limb-Geometrie gemessen wurden. SCIAMACHY's einzigartige Methode abwechselnder Limb- und Nadir-Messungen bietet den Vorteil, hochaufgelöste vertikale und horizontale Messungen mit zeitlicher und räumlicher Koinzidenz durchführen zu können. Die dadurch erlangten Zusatzinformationen können verwendet werden, um die Effekte von horizontalen Gradienten entlang der Sichtlinie des Messinstruments zu korrigieren, welche vor allem kurz nach Vulkanausbrüchen und für polare Stratosphärenwolken beobachtet werden. Wenn diese Gradienten für die Berechnung von Extinktionsprofilen nicht beachtet werden, so kann dies dazu führen, dass sowohl die optischen Dicke als auch die Höhe von Vulkanfahnen oder polarer Stratosphärenwolken unterschätzt werden. In dieser Arbeit wird ein Verfahren vorgestellt, welches mit Hilfe von dreidimensionalen Strahlungstransportsimulationen und horizontal aufgelösten Datensätzen die berechneten Extinktionsprofile korrigiert.rnrnVergleichsstudien mit den Ergebnissen von Satelliten- (SAGE II) und Ballonmessungen zeigen, dass Extinktionsprofile von stratosphärischen Partikeln mit Hilfe des neu entwickelten Algorithmus berechnet werden können und gut mit bestehenden Datensätzen übereinstimmen. Untersuchungen des Nabro Vulkanausbruchs 2011 und des Auftretens von polaren Stratosphärenwolken in der südlichen Hemisphäre zeigen, dass das Korrekturverfahren für horizontale Gradienten die berechneten Extinktionsprofile deutlich verbessert.

Polymer nanoparticles : their functionalization for biomedical applications and dynamics near an electrode

In this work, a method for the functionalization of biocompatible, poly(lactic acid)-based nanoparticles with charged moieties or fluorescent labels is presented. Therefore, a miniemulsion solvent evaporation procedure is used in which prepolymerized poly(L-lactic acid) is used together with a previously synthesized copolymer of methacrylic acid or a polymerizable dye, respectively, and an oligo(lactic acid) macromonomer. Alternatively, the copolymerization has been carried out in one step with the miniemulsion solvent evaporation. The increased stability in salty solutions of the carboxyl-modified nanoparticles compared to nanoparticles consisting of poly(lactic acid) only has been shown in light scattering experiments. The properties of the nanoparticles that were prepared with the separately synthesized copolymer were almost identical to those in which the copolymerization and particle fabrication were carried out simultaneously. During the characterization of the fluorescently labeled nanoparticles, the focus was on the stable bonding between the fluorescent dye and the rest of the polymer chain to ensure that none of it is released from the particles, even after longer storage time or during lengthy experiments. In a fluorescence correlation spectroscopy experiment, it could be shown that even after two weeks, no dye has been released into the solvent. Besides biomedical research for which the above described, functionalized nanoparticles were optimized, nanoparticles also play a role in coating technology. One possibility to fabricate coatings is the electrophoretic deposition of particles. In this process, the mobility of nanoparticles near electrode interfaces plays a crucial role. In this thesis, the nanoparticle mobility has been investigated with resonance enhanced dynamic light scattering (REDLS). A new setup has been developed in which the evanescent electromagnetic eld of a surface plasmon that propagates along the gold-sample interface has been used as incident beam for the dynamic light scattering experiment. The gold layer that is necessary for the excitation of the plasmon doubles as an electrode. Due to the penetration depth of the surface plasmon into the sample layer that is limited to ca. 200 nm, insights on the voltage- and frequency dependent mobility of the nanoparticles near the electrode could be gained. Additionally, simultaneous measurements at four different scattering angles can be carried out with this setup, therefore the investigation of samples undergoing changes is feasible. The results were discussed in context with the mechanisms of electrophoretic deposition.

Analysis of zinc oxide nanoparticles as a potential mutagen of respiratory epithelia

Metallische Nanopartikel und ihre Oxide (z.B. ZnO NP, TiO2 NP und Fe2O3 NP) werden aufgrund ihrer chemischen und physikalischen Eigenschaften häufig als Additive in der Reifenproduktion, in Katalysatoren, Lebensmitteln, Arzneimitteln und Kosmetikprodukten verwendet. Künftig wird ein kontinuierlicher Anstieg der industriellen Anwendung (~ 1663 Tonnen im Jahr 2025) mit gesteigerter Freisetzung in die Umwelt erwartet, was zwangsläufig zu einer vermehrten Aufnahme über das respiratorische Epithel führt. Metalldampffieber ist als gesundheitsschädigender Effekt von Metalloxid-haltigen Aerosolen (z.B. ZnO) nach Inhalation bekannt. Immunreaktionen, wie beispielsweise Entzündungen, werden häufig mit der Entstehung von Sauerstoffradikalen (ROS) in Verbindung gebracht, die wiederum zu DNA-Schäden führen können. Drei mögliche Ursachen der Genotoxität werden angenommen: direkte Interaktion von Nanopartikeln mit intrazellulären Strukturen, Interaktion von Ionen dissoziierter Partikel mit intrazellulären Strukturen sowie die Entstehung von ROS initiiert durch Partikel oder Ionen.rnDie vorliegende Studie befasst sich mit den Mechanismen der Genotoxizität von ZnO Nanopartikeln (ZnO NP), als Beispiel für metallische Nanopartikel, im respiratorischen Epithel. In der Studie wurde gezielt die intrazelluläre Aufnahme und Verteilung von ZnO NP, deren Toxizität, deren DNA schädigendes Potential sowie die Aktivierung der DNA damage response (DDR) analysiert.rnEs konnten kaum internalisierte ZnO NP mittels TEM detektiert werden. Innerhalb der ersten Sekunden nach Behandlung mit ZnO NP wurde spektrofluorometrisch ein starker Anstieg der intrazellulären Zn2+ Konzentration gemessen. In unbehandelten Zellen war Zn2+ in granulären Strukturen lokalisiert. Die Behandlung mit ZnO NP führte zu einer Akkumulation von Zn2+ in diesen Strukturen. Im zeitlichen Verlauf verlagerten sich die Zn2+-Ionen in das Zytoplasma, sowie in Zellkerne und Mitochondrien. Es wurde keine Kolokalisation von Zn2+ mit den frühen Endosomen und dem endoplasmatischen Retikulum beobachtet. Die Vorbehandlung der Zellen mit Diethylen-triaminpentaessigsäure (DTPA), als extrazellulärem Komplexbildner, verhinderte den intrazellulären Anstieg von Zn2+ nach Behandlung mit den Partikeln.rnDie Behandlung mit ZnO NP resultierte in einer zeit- und dosisabhängigen Reduktion der zellulären Viabilität, während die intrazelluläre ROS-Konzentrationen in den ersten 30 min leicht und anschließend kontinuierlich bis zum Ende der Messung anstiegen. Außerdem verringerte sich das mitochondriale Membranpotential, während sich die Anzahl der frühapoptotischen Zellen in einer zeitabhängigen Weise erhöhte. rnDNA Doppelstrangbrüche (DNA DSB) wurden mittels Immunfluoreszenz-Färbung der γH2A.X foci sichtbar gemacht und konnten nach Behandlung mit ZnO NP detektiert werden. Die Vorbehandlung mit dem Radikalfänger N-Acetyl-L-Cytein (NAC) resultierte in stark reduzierten intrazellulären ROS-Konzentrationen sowie wenigen DNA DSB. Die DNA Schädigung wurde durch Vorbehandlung mit DTPA ganz verhindert.rnDie Aktivierung der DDR wurde durch die Analyse von ATM, ATR, Chk1, Chk2, p53 und p21 mittels Western Blot und ELISA nach Behandlung mit ZnO NP überprüft. Der ATR/Chk1 Signalweg wurde durch ZnO NP nicht aktiviert. Die Komplexierung von Zn2+ resultierte in einer verminderten ATM/Chk2 Signalwegaktivierung. Es zeigte sich, dass das Abfangen von ROS keinen Effekt auf die ATM/Chk2 Signalwegaktivierung hatte.rnZusammengefasst wurde festgestellt, dass die Exposition mit ZnO NP in der Entstehung von ROS, reduzierter Viabilität und vermindertem mitochondrialem Membranpotential resultiert, sowie zeitabhängig eine frühe Apoptose initiiert. ZnO NP dissoziierten extrazellulär und wurden schnell als Zn2+ über unbekannte Mechanismen internalisiert. Die Zn2+-Ionen wurden im Zytoplasma, sowie besonders in den Mitochondrien und dem Zellkern, akkumuliert. Die DDR Signalgebung wurde durch ZnO NP aktiviert, jedoch nicht durch NAC inhibiert. Es wurde gezeigt, dass DTPA die DDR Aktivierung komplett inhibierte. Die Behandlung mit ZnO NP induzierte DNA DSB. Die Inhibition von ROS reduzierte die DNA DSB und die Komplexierung der Zn2+ verhinderte die Entstehung von DNA DSB.rnDiese Daten sprechen für die Dissoziation der Partikel und die hierbei freigesetzten Zn2+ als Hauptmediator der Genotoxizität metallischer Nanopartikel. rn