Coating of surfaces of composite materials with enzymatically formed biosilica

Die Bildung kieselsäurehaltiger Spicula in marinen Schwämmen ist nur möglich durch die enzymatische Aktivität des Silicatein- in Verbindung mit der stöchiometrischen Selbstassemblierung des Enzyms mit anderen Schwammproteinen. Die vorliegende Arbeit basiert auf einem biomimetischen Ansatz mit dem Ziel, unterschiedliche Oberflächen für biotechnologische und biomedizinische Anwendungen mit Biosilica und Biotitania zu beschichten und zu funktionalisieren. Für biotechnologische Anwendungen ist dabei das Drucken von Cystein-getaggtem Silicatein auf Gold-Oberflächen von Bedeutung, denn es ermöglichte die Bildung definierter Biotitania-Strukturen (Anatas), welche als Photokatalysator den Abbau eines organischen Farbstoffs bewirkten. Des Weiteren zeigte sich die bio-inspirierte Modifikation von Tyrosin-Resten an rekombinantem Silicatein-(via Tyrosinase) als vielversprechendes Werkzeug zur Beschleunigung der Selbstassemblierung des Enzyms zu mesoskaligen Filamenten. Durch eine solche Modifikation konnte Silicatein auch auf der Oberfläche von anorganischen Partikeln immobilisiert werden, welches die Assemblierung von anorganisch-organischen Verbundwerkstoffen in wäßriger Umgebung förderte. Die resultierenden supramolekularen Strukturen könnten dabei in bio-inspirierten und biotechnologischen Anwendungen genutzt werden. Weiterhin wurde in der vorliegenden Arbeit die Sekundärstruktur von rekombinantem Silicatein- (Monomer und Oligomer) durch Raman Spektroskopie analysiert, nachdem das Protein gemäß einer neu etablierten Methode rückgefaltet worden war. Diese Spektraldaten zeigten insbesondere Änderungen der Proteinkonformation durch Solubilisierung und Oligomerisierung des Enzyms. Außerdem wurden die osteoinduzierenden und osteogenen Eigenschaften unterschiedlicher organischer Polymere, die herkömmlich als Knochenersatzmaterial genutzt werden, durch Oberflächenmodifikation mit Silicatein/Biosilica verbessert: Die bei der Kultivierung knochenbildender Zellen auf derart oberflächenbehandelten Materialien beobachtete verstärkte Biomineralisierung, Aktivierung der Alkalischen Phosphatase, und Ausbildung eines typischen zellulären Phänotyps verdeutlichen das Potential von Silicatein/Biosilica für der Herstellung neuartiger Implantat- und Knochenersatzmaterialien.

Bottom-up solution synthesis of structurally defined graphene nanoribbons

Graphene nanoribbons (GNRs), which are defined as nanometer-wide strips of graphene, are attracting an increasing attention as one on the most promising materials for future nanoelectronics. Unlike zero-bandgap graphene that cannot be switched off in transistors, GNRs possess open bandgaps that critically depend on their width and edge structures. GNRs were predominantly prepared through “top-down” methods such as “cutting” of graphene and “unzipping” of carbon nanotubes, but these methods cannot precisely control the structure of the resulting GNRs. In contrast, “bottom-up” chemical synthetic approach enables fabrication of structurally defined and uniform GNRs from tailor-made polyphenylene precursors. Nevertheless, width and length of the GNRs obtainable by this method were considerably limited. In this study, lateral as well as longitudinal extensions of the GNRs were achieved while preserving the high structural definition, based on the bottom-up solution synthesis. Initially, wider (~2 nm) GNRs were synthesized by using laterally expanded monomers through AA-type Yamamoto polymerization, which proved more efficient than the conventional A2B2-type Suzuki polymerization. The wider GNRs showed broad absorption profile extending to the near-infrared region with a low optical bandgap of 1.12 eV, which indicated a potential of such GNRs for the application in photovoltaic cells. Next, high longitudinal extension of narrow (~1 nm) GNRs over 600 nm was accomplished based on AB-type Diels–Alder polymerization, which provided corresponding polyphenylene precursors with the weight-average molecular weight of larger than 600,000 g/mol. Bulky alkyl chains densely installed on the peripheral positions of these GNRs enhanced their liquid-phase processability, which allowed their formation of highly ordered self-assembled monolayers. Furthermore, non-contact time-resolved terahertz spectroscopy measurements demonstrated high charge-carrier mobility within individual GNRs. Remarkably, lateral extension of the AB-type monomer enabled the fabrication of wider (~2 nm) and long (>100 nm) GNRs through the Diels–Alder polymerization. Such longitudinally extended and structurally well-defined GNRs are expected to allow the fabrication of single-ribbon transistors for the fundamental studies on the electronic properties of the GNRs as well as contribute to the development of future electronic devices.

Zerfallspionenspektroskopie leichter Hyperkerne in der Elektroproduktion

Am Mainzer Mikrotron können Lambda-Hyperkerne in (e,e'K^+)-Reaktionen erzeugt werden. Durch den Nachweis des erzeugten Kaons im KAOS-Spektrometer lassen sich Reaktionen markieren, bei denen ein Hyperon erzeugt wurde. Die Spektroskopie geladener Pionen, die aus schwachen Zweikörperzerfällen leichter Hyperkerne stammen, erlaubt es die Bindungsenergie des Hyperons im Kern mit hoher Präzision zu bestimmen. Neben der direkten Produktion von Hyperkernen ist auch die Erzeugung durch die Fragmentierung eines hoch angeregten Kontinuumszustands möglich. Dadurch können unterschiedliche Hyperkerne in einem Experiment untersucht werden. Für die Spektroskopie der Zerfallspionen stehen hochauflösende Magnetspektrometer zur Verfügung. Um die Grundzustandsmasse der Hyperkerne aus dem Pionimpuls zu berechnen, ist es erforderlich, dass das Hyperfragment vor dem Zerfall im Target abgebremst wird. Basierend auf dem bekannten Wirkungsquerschnitt der elementaren Kaon-Photoproduktion wurde eine Berechnung der zu erwartenden Ereignisrate vorgenommen. Es wurde eine Monte-Carlo-Simulation entwickelt, die den Fragmentierungsprozess und das Abbremsen der Hyperfragmente im Target beinhaltet. Diese nutzt ein statistisches Aufbruchsmodell zur Beschreibung der Fragmentierung. Dieser Ansatz ermöglicht für Wasserstoff-4-Lambda-Hyperkerne eine Vorhersage der zu erwartenden Zählrate an Zerfallspionen. In einem Pilotexperiment im Jahr 2011 wurde erstmalig an MAMI der Nachweis von Hadronen mit dem KAOS-Spektrometer unter einem Streuwinkel von 0° demonstriert, und koinzident dazu Pionen nachgewiesen. Es zeigte sich, dass bedingt durch die hohen Untergrundraten von Positronen in KAOS eine eindeutige Identifizierung von Hyperkernen in dieser Konfiguration nicht möglich war. Basierend auf diesen Erkenntnissen wurde das KAOS-Spektrometer so modifiziert, dass es als dedizierter Kaonenmarkierer fungierte. Zu diesem Zweck wurde ein Absorber aus Blei im Spektrometer montiert, in dem Positronen durch Schauerbildung abgestoppt werden. Die Auswirkung eines solchen Absorbers wurde in einem Strahltest untersucht. Eine Simulation basierend auf Geant4 wurde entwickelt mittels derer der Aufbau von Absorber und Detektoren optimiert wurde, und die Vorhersagen über die Auswirkung auf die Datenqualität ermöglichte. Zusätzlich wurden mit der Simulation individuelle Rückrechnungsmatrizen für Kaonen, Pionen und Protonen erzeugt, die die Wechselwirkung der Teilchen mit der Bleiwand beinhalteten, und somit eine Korrektur der Auswirkungen ermöglichen. Mit dem verbesserten Aufbau wurde 2012 eine Produktionsstrahlzeit durchgeführt, wobei erfolgreich Kaonen unter 0° Streuwinkel koninzident mit Pionen aus schwachen Zerfällen detektiert werden konnten. Dabei konnte im Impulsspektrum der Zerfallspionen eine Überhöhung mit einer Signifikanz, die einem p-Wert von 2,5 x 10^-4 entspricht, festgestellt werden. Diese Ereignisse können aufgrund ihres Impulses, den Zerfällen von Wasserstoff-4-Lambda-Hyperkernen zugeordnet werden, wobei die Anzahl detektierter Pionen konsistent mit der berechneten Ausbeute ist.

Synthese und biologische Evaluierung von fluorierten und carbaanalogen Glycopeptiden für die Entwicklung von tumorselektiven Vakzinen

Tumorassoziierte Kohlenhydrat-Antigene werden von einer Vielzahl epithelialer Tumoren in erhöhtem Maße exprimiert und können sowohl als selektive Tumormarker, als auch als Zielstrukturen zur Entwicklung von synthetischen Krebsvakzinen dienen. Mucine, allen voran MUC1, sind hochgradig O-glycosylierte Zelloberflächenproteine, die im Fall maligner Zellen in deutlich überexprimierter Form mit charakteristisch veränderten Glycosylierungsmustern auftreten und somit vom Immunsystem erkannt werden können. Die relativ schwache Immunogenität und die geringe metabolische Stabilität dieser Glycopeptid-Epitope stehen jedoch der Entwicklung effizienter, auf Kohlenhydraten basierender Krebsvakzine entgegen.rnEin interessanter Ansatz, die Stabilität und Immunogenität der Vakzinbausteine zu erhöhen, ohne dabei deren Tumorspezifität nennenswert zu beeinträchtigen, stellt die Verwendung von modifizierten Glycopeptid-Konjugaten mit Kohlenhydratmimetika dar, z.B. basierend auf Fluor- und Carbazuckern. rnUm die Eignung solcher bislang unbekannter MUC1-Antigenanaloga als Vakzinbausteine zu untersuchen, konnten im Rahmen dieses Promotionsvorhabens Synthesen zu verschiedenen, modifizierten Antigen-Threonin-Konjugaten erarbeitet werden. Dabei konnte neben der erstmaligen Synthese eines in 6-Position fluorierten Carbazuckers auch ein 1→3 verknüpftes Carbadisaccharid synthetisiert werden. Zudem wurden mehrere Vertreter der in Position 6 bzw. 6‘ fluorierten TN, T und der beiden ST-Antigene dargestellt und über eine Festphasenpeptidsynthese in die aus 20 Aminosäuren bestehende tandem-repeat-Sequenz des MUC1 eingebaut. Eine anschließende Konjugation dieser Glycopeptide über einen nicht-immunogenen Spacer auf Triethylenglycol Basis an Carrierproteine wie BSA und das Tetanus Toxoid lieferte nicht nur potente Tumorvakzine, sondern auch die für die Durchführung von ELISA-Studien benötigten Glycopeptid-Konjugate. rnIn ersten ELISA und Neutralisationsexperimenten konnte gezeigt werden, dass bereits erhaltene Antikörper gegen strukturell sehr ähnliche Vakzine in der Lage sind, die neuartigen fluorierten Glycopeptide zu erkennen und an ihnen zu binden. Zusätzlich konnte erstmals in Impfstudien gezeigt werden, dass mit diesen neuen fluorierten Glycopeptid-TTox-Konjugaten nicht nur eine stakt toleranzbrechende humorale Immunantwort induziert werden kann, sondern auch dass diese MUC1 spezifischen Antikörper zudem in der Lage sind Brustkrebszellen der Linie MCF-7 zu erkennen und zu binden. rnrn

Etablierung eines high content imaging-basierten in vitro Testsystems zur Evaluierung genotoxischer Substanzen

Zur Registrierung von Pharmazeutika ist eine umfassende Analyse ihres genotoxischen Potentials von Nöten. Aufgrund der Vielzahl genotoxischer Mechanismen und deren resultierenden Schäden wird ein gestaffeltes Testdesign durch die ICH-Richtlinie S2(R1) „Guidance on genotoxicity testing and data interpretation for pharmaceuticals intended for human use S2(R1)“ definiert, um alle genotoxischen Substanzen zu identifizieren. Die Standardtestbatterie ist in der frühen Phase der Arzneimittelentwicklung aufgrund des geringen Durchsatzes und des Mangels an verfügbarer Substanzmenge vermindert anwendbar. Darüber hinaus verfügen in vitro Genotoxizitätstests in Säugerzellen über eine relativ geringe Spezifität. Für eine vollständige Sicherheitsbeurteilung wird eine in vivo Testung auf Kanzerogenität benötigt. Allerdings sind diese Testsysteme kosten- und zeitintensiv. Aufgrund dessen zielen neue Forschungsansätze auf die Verbesserung der Prädiktivität und die Erfassung des genotoxischen Potentials bereits in der frühen Phase der Arzneimittelentwicklung ab. Die high content imaging (HCI)-Technologie offeriert einen Ansatz zur Verbesserung des Durchsatzes verglichen mit der Standardtestbatterie. Zusätzlich hat ein Zell-basiertes Modell den Vorteil Daten relativ schnell bei gleichzeitig geringem Bedarf an Substanzmenge zu generieren. Demzufolge ermöglichen HCI-basierte Testsysteme eine Prüfung in der frühen Phase der pharmazeutischen Arzneimittelentwicklung. Das Ziel dieser Studie ist die Entwicklung eines neuen, spezifischen und sensitiven HCI-basierten Testsytems für Genotoxine und Progenotoxine in vitro unter Verwendung von HepG2-Zellen gewesen. Aufgrund ihrer begrenzten metabolischen Kapazität wurde ein kombiniertes System bestehend aus HepG2-Zellen und einem metabolischen Aktivierungssystem zur Testung progenotoxischer Substanzen etabliert. Basierend auf einer vorherigen Genomexpressionsprofilierung (Boehme et al., 2011) und einer Literaturrecherche wurden die folgenden neun unterschiedlichen Proteine der DNA-Schadensantwort als putative Marker der Substanz-induzierten Genotoxizität ausgewählt: p-p53 (Ser15), p21, p-H2AX (Ser139), p-Chk1 (Ser345) p-ATM (Ser1981), p-ATR (Ser428), p-CDC2 (Thr14/Tyr15), GADD45A und p-Chk2 (Thr68). Die Expression bzw. Aktivierung dieser Proteine wurde 48 h nach Behandlung mit den (pro-) genotoxischen Substanzen (Cyclophosphamid, 7,12-Dimethylbenz[a]anthracen, Aflatoxin B1, 2-Acetylaminofluoren, Methylmethansulfonat, Actinomycin D, Etoposid) und den nicht-genotoxischen Substanzen (D-Mannitol, Phenforminhydrochlorid, Progesteron) unter Verwendung der HCI-Technologie ermittelt. Die beste Klassifizierung wurde bei Verwendung der folgenden fünf der ursprünglichen neun putativen Markerproteine erreicht: p-p53 (Ser15), p21, p-H2AX (Ser139), p-Chk1 (Ser345) und p-ATM (Ser1981). In einem zweiten Teil dieser Arbeit wurden die fünf ausgewählten Proteine mit Substanzen, welche von dem European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM) zur Beurteilung der Leistung neuer oder modifizierter in vitro Genotoxizitätstests empfohlen sind, getestet. Dieses neue Testsystem erzielte eine Sensitivität von 80 % und eine Spezifität von 86 %, was in einer Prädiktivität von 84 % resultierte. Der synergetische Effekt dieser fünf Proteine ermöglicht die Identifizierung von genotoxischen Substanzen, welche DNA-Schädigungen durch eine Vielzahl von unterschiedlichen Mechanismen induzieren, mit einem hohen Erfolg. Zusammenfassend konnte ein hochprädiktives Prüfungssystem mit metabolischer Aktivierung für ein breites Spektrum potenziell genotoxischer Substanzen generiert werden, welches sich aufgrund des hohen Durchsatzes, des geringen Zeitaufwandes und der geringen Menge benötigter Substanz zur Substanzpriorisierung und -selektion in der Phase der Leitstrukturoptimierung eignet und darüber hinaus mechanistische Hinweise auf die genotoxische Wirkung der Testsubstanz liefert.

Theoretical analysis of hidden photon searches in high-precision experiments

Although the Standard Model of particle physics (SM) provides an extremely successful description of the ordinary matter, one knows from astronomical observations that it accounts only for around 5% of the total energy density of the Universe, whereas around 30% are contributed by the dark matter. Motivated by anomalies in cosmic ray observations and by attempts to solve questions of the SM like the (g-2)_mu discrepancy, proposed U(1) extensions of the SM gauge group have raised attention in recent years. In the considered U(1) extensions a new, light messenger particle, the hidden photon, couples to the hidden sector as well as to the electromagnetic current of the SM by kinetic mixing. This allows for a search for this particle in laboratory experiments exploring the electromagnetic interaction. Various experimental programs have been started to search for hidden photons, such as in electron-scattering experiments, which are a versatile tool to explore various physics phenomena. One approach is the dedicated search in fixed-target experiments at modest energies as performed at MAMI or at JLAB. In these experiments the scattering of an electron beam off a hadronic target e+(A,Z)->e+(A,Z)+l^+l^- is investigated and a search for a very narrow resonance in the invariant mass distribution of the lepton pair is performed. This requires an accurate understanding of the theoretical basis of the underlying processes. For this purpose it is demonstrated in the first part of this work, in which way the hidden photon can be motivated from existing puzzles encountered at the precision frontier of the SM. The main part of this thesis deals with the analysis of the theoretical framework for electron scattering fixed-target experiments searching for hidden photons. As a first step, the cross section for the bremsstrahlung emission of hidden photons in such experiments is studied. Based on these results, the applicability of the Weizsäcker-Williams approximation to calculate the signal cross section of the process, which is widely used to design such experimental setups, is investigated. In a next step, the reaction e+(A,Z)->e+(A,Z)+l^+l^- is analyzed as signal and background process in order to describe existing data obtained by the A1 experiment at MAMI with the aim to give accurate predictions of exclusion limits for the hidden photon parameter space. Finally, the derived methods are used to find predictions for future experiments, e.g., at MESA or at JLAB, allowing for a comprehensive study of the discovery potential of the complementary experiments. In the last part, a feasibility study for probing the hidden photon model by rare kaon decays is performed. For this purpose, invisible as well as visible decays of the hidden photon are considered within different classes of models. This allows one to find bounds for the parameter space from existing data and to estimate the reach of future experiments.

Thermal excitations of optical nanofibers measured with a fiber-integrated Fabry-Pérot cavity

Efficient coupling of light to quantum emitters, such as atoms, molecules or quantum dots, is one of the great challenges in current research. The interaction can be strongly enhanced by coupling the emitter to the eva-nescent field of subwavelength dielectric waveguides that offer strong lateral confinement of the guided light. In this context subwavelength diameter optical nanofibers as part of a tapered optical fiber (TOF) have proven to be powerful tool which also provide an efficient transfer of the light from the interaction region to an optical bus, that is to say, from the nanofiber to an optical fiber. rnAnother approach towards enhancing light–matter interaction is to employ an optical resonator in which the light is circulating and thus passes the emitters many times. Here, both approaches are combined by experi-mentally realizing a microresonator with an integrated nanofiber waist. This is achieved by building a fiber-integrated Fabry-Pérot type resonator from two fiber Bragg grating mirrors with a stop-band near the cesium D2-line wavelength. The characteristics of this resonator fulfill the requirements of nonlinear optics, optical sensing, and cavity quantum electrodynamics in the strong-coupling regime. Together with its advantageous features, such as a constant high coupling strength over a large volume, tunability, high transmission outside the mirror stop band, and a monolithic design, this resonator is a promising tool for experiments with nanofiber-coupled atomic ensembles in the strong-coupling regime. rnThe resonator's high sensitivity to the optical properties of the nanofiber provides a probe for changes of phys-ical parameters that affect the guided optical mode, e.g., the temperature via the thermo-optic effect of silica. Utilizing this detection scheme, the thermalization dynamics due to far-field heat radiation of a nanofiber is studied over a large temperature range. This investigation provides, for the first time, a measurement of the total radiated power of an object with a diameter smaller than all absorption lengths in the thermal spectrum at the level of a single object of deterministic shape and material. The results show excellent agreement with an ab initio thermodynamic model that considers heat radiation as a volumetric effect and that takes the emitter shape and size relative to the emission wavelength into account. Modeling and investigating the thermalization of microscopic objects with arbitrary shape from first principles is of fundamental interest and has important applications, such as heat management in nano-devices or radiative forcing of aerosols in Earth's climate system. rnUsing a similar method, the effect of the TOF's mechanical modes on the polarization and phase of the fiber-guided light is studied. The measurement results show that in typical TOFs these quantities exhibit high-frequency thermal fluctuations. They originate from high-Q torsional oscillations that couple to the nanofiber-guided light via the strain-optic effect. An ab-initio opto-mechanical model of the TOF is developed that provides an accurate quantitative prediction for the mode spectrum and the mechanically induced polarization and phase fluctuations. These high-frequency fluctuations may limit the ultimate ideality of fiber-coupling into photonic structures. Furthermore, first estimations show that they may currently limit the storage time of nanofiber-based atom traps. The model, on the other hand, provides a method to design TOFs with tailored mechanical properties in order to meet experimental requirements. rn

Complex tracer mobilities in polymer networks revealed by fluorescence correlation spectroscopy

Gels are elastic porous polymer networks that are accompanied by pronounced mechanical properties. Due to their biocompatibility, ‘responsive hydrogels’ (HG) have many biomedical applications ranging from biosensors and drug delivery to tissue engineering. They respond to external stimuli such as temperature and salt by changing their dimensions. Of paramount importance is the ability to engineer penetrability and diffusion of interacting molecules in the crowded HG environment, as this would enable one to optimize a specific functionality. Even though the conditions under which biomedical devices operate are rather complex, a bottom-up approach could reduce the complexity of mutually coupled parameters influencing tracer mobility. The present thesis focuses on the interaction-induced tracer diffusion in polymer solutions and their homologous gels, probed by means of Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS). This is a single-molecule-sensitive technique having the advantage of optimal performance under ultralow tracer concentrations, typically employed in biosensors. Two different types of hydrogels have been investigated, a conventional one with broad polydispersity in the distance between crosslink points and a so-called ‘ideal’, with uniform mesh size distribution. The former is based on a thermoresponsive polymer, exhibiting phase separation in water at temperatures close to the human body temperature. The latter represents an optimal platform to study tracer diffusion. Mobilities of different tracers have been investigated in each network, varying in size, geometry and in terms of tracer-polymer attractive strength, as perturbed by different stimuli. The thesis constitutes a systematic effort towards elucidating the role of the strength and nature of different tracer-polymer interactions, on tracer mobilities; it outlines that interactions can still be very important even in the simplified case of dilute polymer solutions; it also demonstrates that the presence of permanent crosslinks exerts distinct tracer slowdown, depending on the tracer type and the nature of the tracer-polymer interactions, expressed differently by each tracer with regard to the selected stimulus. In aqueous polymer solutions, the tracer slowdown is found to be system-dependent and no universal trend seems to hold, in contrast to predictions from scaling theory for non-interacting nanoparticle mobility and empirical relations concerning the mesh size in polymer solutions. Complex tracer dynamics in polymer networks may be distinctly expressed by FCS, depending on the specific synergy among-at least some of - the following parameters: nature of interactions, external stimuli employed, tracer size and type, crosslink density and swelling ratio.

Hydrogels for DNA isolation from blood

This dissertation describes the synthesis of surface attached hydrogel biomaterials, characterization of their properties, evaluation of structuring concepts and the investigation of these materials in the isolation of DNA from human whole blood. Photosensitive hydrogel precursor materials on the basis of hydroxyethylmethacrylate (HEMA) were synthesized by free radical polymerization. In order to obtain surface bound hydrogel films, the precursors were deposited on a suitable substrate and subsequently irradatiated with UV - light to accomplish the formation of crosslinks in the film and create surface attachment. The composition of the polymerization precursor materials was determined by comprehensive NMR and GPC studies, revealing the copolymerizationrnbehaviour of the used monomers - HEMA derivatives and the photocrosslinkerrnMABP - and their respective distribution in the hydrogel precursors. The degree of crosslinking of the hydrogels was characterized with UV/vis spectroscopy. Stress-strain measurements were conducted in order to investigate the mechanical properties of the biomaterials. Moreover, the swelling process and biomolecule adsorption properties of the hydrogels were investigated with SPR/OW spectroscopy. For this, the deposition and binding of the hydrogels on gold or SiO2 surfaces was facilitated with photocrosslinkable adhesion promotors. The produced hydrogels were mechanically rigid and stablernunder the conditions of PCR and blood lysis. Furthermore, strategies towards the increase of hydrogel surface structure and porosity with porosigens, 2D laser interference lithography and photocleavable blockcopolymers were investigated. At last, a combinatorial strategy was used for the determination of the usefulness of hydrogels for the isolation from DNA from blood. A series of functionalized hydrogel precursors were synthesized, transferred to the surface inside a PCR tube and subsequently screened in regard to DNA adsorption properties with Taqman quantitative PCR. This approach yielded a promising candidate for a functional PCR tube coating that would allow the entire DNA isolation procedure being carried out in a single reaction container.rnThereforce, the practical application of such macromolecular architectures can be envisioned to improve industrial DNA diagnostic processes.

Safety and therapeutic efficacy of adoptive p53-specific T cell antigen receptor (TCR) gene transfer

Immunotherapy with T cells genetically modified by retroviral transfer of tumor-associated antigen (TAA)-specific T cell receptors (TCR) is a promising approach in targeting cancer. Therefore, using a universal TAA to target different tumor entities by only one therapeutic approach was the main criteria for our TAA-specific TCR. Here, an optimized (opt) αβ-chain p53(264-272)-specific and an opt single chain (sc) p53(264-272)-specific TCR were designed, to reduce mispairing reactions of endogenous and introduced TCR α and TCR β-chains, which might lead to off-target autoimmune reactions, similar to Graft-versus-host disease (GvHD). rnIn this study we evaluated the safety issues, which rise by the risk of p53TCR gene transfer-associated on/off-target toxicities as well as the anti-tumor response in vivo in a syngeneic HLA-A*0201 transgenic mouse model. We could successfully demonstrate that opt sc p53-specific TCR-redirected T cells prevent TCR mispairing-mediated lethal off-target autoimmunity in contrast to the parental opt αβ-chain p53-specific TCR. Since the sc p53-specific TCR proofed to be safe, all further studies were performed using sc p53-specific TCR redirected T cells only. Infusion of p53-specific TCR-redirected T cells in Human p53 knock-in (Hupki) mice after lymphodepletion-preconditioning regimen with either sublethal body irradiation (5Gy) or chemotherapy (fludarabine and cyclophosphamide) in combination with vaccination (anti-CD40, CpG1668 and p53(257-282) peptide) did not result in a depletion of hematopoietic cells. Moreover, adoptive transfer of high numbers of p53-specific TCR-redirected T cells in combination with Interleukin 2 (IL-2) also did not lead to toxic on-target reactions. The absence of host tissue damage was confirmed by histology and flow cytometry analysis. Furthermore, p53-specific TCR-redirected T cells were able to lyse p53+A2.1+ tumor cells in vitro. However, in vivo studies revealed the potent suppressive effect of the tumor microenvironment (TME) mediated by tumor-infiltrating myeloid-derived suppressor cells (MDSC). Accordingly, we could improve an insufficient anti-tumor response in vivo after injection of the sc p53-specific TCR-redirected T cells by additional depletion of immunosuppressive cells of the myeloid lineage.rnTogether, these data suggest that the optimized sc p53(264-272)-specific TCR may represent a safe and efficient approach for TCR-based gene therapy. However, combinations of immunotherapeutic strategies are needed to enhance the efficacy of adoptive cell therapy (ACT)-mediated anti-tumor responses.

Impact of anthropogenic stressors on the population genetics of the common bioindicator Dreissena polymorpha (Pallas, 1771)

Toxicant inputs from agriculture, industry and human settlements have been shown to severely affect freshwater ecosystems. Pollution can lead to changes in population genetic patterns through various genetic and stochastic processes. In my thesis, I investigated the impact of anthropogenic stressors on the population genetics of the zebra mussel Dreissena polymorpha. In order to analyze the genetics of zebra mussel populations, I isolated five new highly polymorphic microsatellite loci. Out of those and other already existing microsatellite markers for this species, I established a robust marker set of six microsatellite loci for D. polymorpha. rnMonitoring the biogeographical background is an important requirement when integrating population genetic measures into ecotoxicological studies. I analyzed the biogeographical background of eleven populations in a section of the River Danube (in Hungary and Croatia) and some of its tributaries, and another population in the River Rhine as genetic outgroup. Moreover, I measured abiotic water parameters at the sampling sites and analyzed if they were correlated with the genetic parameters of the populations. The genetic differentiation was basically consistent with the overall biogeographical history of the populations in the study region. However, the genetic diversity of the populations was not influenced by the geographical distance between the populations, but by the environmental factors oxygen and temperature and also by other unidentified factors. I found strong evidence that genetic adaptation of zebra mussel populations to local habitat conditions had influenced the genetic constitution of the populations. Moreover, by establishing the biogeographical baseline of molecular variance in the study area, I laid the foundation for interpreting population genetic results in ecotoxicological experiments in this region.rnIn a cooperation project with the Department of Zoology of the University of Zagreb, I elaborated an integrated approach in biomonitoring with D. polymorpha by combining the analysis techniques of microsatellite analysis, Comet assay and micronucleus test (MNT). This approach was applied in a case study on freshwater contamination by an effluent of a wastewater treatment plant (WWTP) in the River Drava (Croatia) and a complementary laboratory experiment. I assessed and compared the genetic status of two zebra mussel populations from a contaminated and a reference site. Microsatellite analysis suggested that the contaminated population had undergone a genetic bottleneck, caused by random genetic drift and selection, whereas a bottleneck was not detected in the reference population. The Comet assay did not indicate any difference in DNA damage between the two populations, but MNT revealed that the contaminated population had an increased percentage of micronuclei in hemocytes in comparison to the reference population. The laboratory experiment with mussels exposed to municipal wastewater revealed that mussels from the contaminated site had a lower percentage of tail DNA and a higher percentage of micronuclei than the reference population. These differences between populations were probably caused by an overall decreased fitness of mussels from the contaminated site due to genetic drift and by an enhanced DNA repair mechanism due to adaptation to pollution in the source habitat. Overall, the combination of the three biomarkers provided sufficient information on the impact of both treated and non-treated municipal wastewater on the genetics of zebra mussels at different levels of biological organization.rnIn my thesis, I could show that the newly established marker set of six microsatellite loci provided reliable and informative data for population genetic analyses of D. polymorpha. The adaptation of the analyzed zebra mussel populations to the local conditions of their habitat had a strong influence on their genetic constitution. We found evidence that the different genetic constitutions of two populations had influenced the outcome of our ecotoxicological experiment. Overall, the integrated approach in biomonitoring gave comprehensive information about the impact of both treated and non-treated municipal wastewater on the genetics of zebra mussels at different levels of biological organization and was well practicable in a first case study.

Tissue engineering strategies for biomaterial-based anticancer drug delivery and enhancement of angiogenesis in tumor-resected bone

Patienten, die an Osteosarkom leiden werden derzeit mit intravenös applizierten krebstherapeutischen Mitteln nach Tumorresektion behandelt, was oftmals mit schweren Nebenwirkungen und einem verzögerten Knochenheilungsprozess einhergeht. Darüber hinaus treten vermehrt Rezidive aufgrund von verbleibenden neoplastischen Zellen an der Tumorresektionsstelle auf. Erfolgreiche Knochenregeneration und die Kontrolle von den im Gewebe verbleibenden Krebszellen stellt eine Herausforderung für das Tissue Engineering nach Knochenverlust durch Tumorentfernung dar. In dieser Hinsicht scheint der Einsatz von Hydroxyapatit als Knochenersatzmaterial in Kombination mit Cyclodextrin als Medikamententräger, vielversprechend. Chemotherapeutika können an Biomaterial gebunden und direkt am Tumorbett über einen längeren Zeitraum freigesetzt werden, um verbliebene neoplastische Zellen zu eliminieren. Lokal applizierte Chemotherapie hat diverse Vorteile, einschließlich der direkten zytotoxischen Auswirkung auf lokale Zellen, sowie die Reduzierung schwerer Nebenwirkungen. Diese Studie wurde durchgeführt, um die Funktionsfähigkeit eines solchen Arzneimittelabgabesystems zu bewerten und um Strategien im Bereich des Tissue Engineerings zu entwickeln, die den Knochenheilungsprozess und im speziellen die Vaskularisierung fördern sollen. Die Ergebnisse zeigen, dass nicht nur Krebszellen von der chemotherapeutischen Behandlung betroffen sind. Primäre Endothelzellen wie zum Beispiel HUVEC zeigten eine hohe Sensibilität Cisplatin und Doxorubicin gegenüber. Beide Medikamente lösten in HUVEC ein tumor-unterdrückendes Signal durch die Hochregulation von p53 und p21 aus. Zudem scheint Hypoxie einen krebstherapeutischen Einfluss zu haben, da die Behandlung sensitiver HUVEC mit Hypoxie die Zellen vor Zytotoxizität schützte. Der chemo-protektive Effekt schien deutlich weniger auf Krebszelllinien zu wirken. Diese Resultate könnten eine mögliche chemotherapeutische Strategie darstellen, um den Effekt eines zielgerichteten Medikamenteneinsatzes auf Krebszellen zu verbessern unter gleichzeitiger Schonung gesunder Zellen. Eine erfolgreiche Integration eines Systems, das Arzneimittel abgibt, kombiniert mit einem Biomaterial zur Stabilisierung und Regeneration, könnte gesunden Endothelzellen die Möglichkeit bieten zu proliferieren und Blutgefäße zu bilden, während verbleibende Krebszellen eliminiert werden. Da der Prozess der Knochengeweberemodellierung mit einer starken Beeinträchtigung der Lebensqualität des Patienten einhergeht, ist die Beschleunigung des postoperativen Heilungsprozesses eines der Ziele des Tissue Engineerings. Die Bildung von Blutgefäßen ist unabdingbar für eine erfolgreiche Integration eines Knochentransplantats in das Gewebe. Daher ist ein umfangreich ausgebildetes Blutgefäßsystem für einen verbesserten Heilungsprozess während der klinischen Anwendung wünschenswert. Frühere Experimente zeigen, dass sich die Anwendung von Ko-Kulturen aus humanen primären Osteoblasten (pOB) und humanen outgrowth endothelial cells (OEC) im Hinblick auf die Bildung stabiler gefäßähnlicher Strukturen in vitro, die auch effizient in das mikrovaskuläre System in vivo integriert werden konnten, als erfolgreich erweisen. Dieser Ansatz könnte genutzt werden, um prä-vaskularisierte Konstrukte herzustellen, die den Knochenheilungsprozess nach der Implantation fördern. Zusätzlich repräsentiert das Ko-Kultursystem ein exzellentes in vitro Model, um Faktoren, welche stark in den Prozess der Knochenheilung und Angiogenese eingebunden sind, zu identifizieren und zu analysieren. Es ist bekannt, dass Makrophagen eine maßgebliche Rolle in der inflammatorisch-induzierten Angiogenese spielen. In diesem Zusammenhang hebt diese Studie den positiven Einfluss THP-1 abgeleiteter Makrophagen in Ko-Kultur mit pOB und OEC hervor. Die Ergebnisse zeigten, dass die Anwendung von Makrophagen als inflammatorischer Stimulus im bereits etablierten Ko-Kultursystem zu einer pro-angiogenen Aktivierung der OEC führte, was in einer signifikant erhöhten Bildung blutgefäßähnlicher Strukturen in vitro resultierte. Außerdem zeigte die Analyse von Faktoren, die in der durch Entzündung hervorgerufenen Angiogenese eine wichtige Rolle spielen, eine deutliche Hochregulation von VEGF, inflammatorischer Zytokine und Adhäsionsmoleküle, die letztlich zu einer verstärkten Vaskularisierung beitragen. Diese Resultate werden dem Einfluss von Makrophagen zugeschrieben und könnten zukünftig im Tissue Engineering eingesetzt werden, um den Heilungsprozess zu beschleunigen und damit die klinische Situation von Patienten zu verbessern. Darüber hinaus könnte die Kombination der auf Ko-Kulturen basierenden Ansätze für das Knochen Tissue Engineering mit einem biomaterial-basierenden Arzneimittelabgabesystem zum klinischen Einsatz kommen, der die Eliminierung verbliebener Krebszellen mit der Förderung der Knochenregeneration verbindet.

Plasmon-enhanced dynamic light scattering of gold nanorods in bulk and near a wall

Transportprozesse von anisotropen metallischen Nanopartikeln wie zum Beispiel Gold-Nanostäbchen in komplexen Flüssigkeiten und/oder begrenzten Geometrien spielen eine bedeutende Rolle in einer Vielzahl von biomedizinischen und industriellen Anwendungen. Ein Weg zu einem tiefen, grundlegenden Verständnis von Transportmechanismen ist die Verwendung zweier leistungsstarker Methoden - dynamischer Lichtstreuung (DLS) und resonanzverstärkter Lichtstreuung (REDLS) in der Nähe einer Grenzfläche. In dieser Arbeit wurden nanomolare Suspensionen von Gold-Nanostäbchen, stabilisiert mit Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB), mit DLS sowie in der Nähe einer Grenzfläche mit REDLS untersucht. Mit DLS wurde eine wellenlängenabhängige Verstärkung der anisotropen Streuung beobachtet, welche sich durch die Anregung von longitudinaler Oberflächenplasmonenresonanz ergibt. Die hohe Streuintensität nahe der longitudinalen Oberflächenplasmonenresonanzfrequenz für Stäbchen, welche parallel zum anregenden optischen Feld liegen, erlaubte die Auflösung der translationalen Anisotropie in einem isotropen Medium. Diese wellenlängenabhängige anisotrope Lichtstreuung ermöglicht neue Anwendungen wie etwa die Untersuchung der Dynamik einzelner Partikel in komplexen Umgebungen mittels depolarisierter dynamischer Lichtstreuung. In der Nähe einer Grenzfläche wurde eine starke Verlangsamung der translationalen Diffusion beobachtet. Hingegen zeigte sich für die Rotation zwar eine ausgeprägte aber weniger starke Verlangsamung. Um den möglichen Einfluss von Ladung auf der festen Grenzfläche zu untersuchen, wurde das Metall mit elektrisch neutralem Polymethylmethacrylat (PMMA) beschichtet. In einem weiteren Ansatz wurde das CTAB in der Gold-Nanostäbchen Lösung durch das kovalent gebundene 16-Mercaptohexadecyltrimethylammoniumbromid (MTAB) ersetzt. Daraus ergab sich eine deutlich geringere Verlangsamung.

Development of models and methods to simulate peptide-assisted nucleation and growth of calcium-minerals

In den vergangenen Jahren wurden einige bislang unbekannte Phänomene experimentell beobachtet, wie etwa die Existenz unterschiedlicher Prä-Nukleations-Strukturen. Diese haben zu einem neuen Verständnis von Prozessen, die auf molekularer Ebene während der Nukleation und dem Wachstum von Kristallen auftreten, beigetragen. Die Auswirkungen solcher Prä-Nukleations-Strukturen auf den Prozess der Biomineralisation sind noch nicht hinreichend verstanden. Die Mechanismen, mittels derer biomolekulare Modifikatoren, wie Peptide, mit Prä-Nukleations-Strukturen interagieren und somit den Nukleationsprozess von Mineralen beeinflussen könnten, sind vielfältig. Molekulare Simulationen sind zur Analyse der Formation von Prä-Nukleations-Strukturen in Anwesenheit von Modifikatoren gut geeignet. Die vorliegende Arbeit beschreibt einen Ansatz zur Analyse der Interaktion von Peptiden mit den in Lösung befindlichen Bestandteilen der entstehenden Kristalle mit Hilfe von Molekular-Dynamik Simulationen.rnUm informative Simulationen zu ermöglichen, wurde in einem ersten Schritt die Qualität bestehender Kraftfelder im Hinblick auf die Beschreibung von mit Calciumionen interagierenden Oligoglutamaten in wässrigen Lösungen untersucht. Es zeigte sich, dass große Unstimmigkeiten zwischen etablierten Kraftfeldern bestehen, und dass keines der untersuchten Kraftfelder eine realistische Beschreibung der Ionen-Paarung dieser komplexen Ionen widerspiegelte. Daher wurde eine Strategie zur Optimierung bestehender biomolekularer Kraftfelder in dieser Hinsicht entwickelt. Relativ geringe Veränderungen der auf die Ionen–Peptid van-der-Waals-Wechselwirkungen bezogenen Parameter reichten aus, um ein verlässliches Modell für das untersuchte System zu erzielen. rnDas umfassende Sampling des Phasenraumes der Systeme stellt aufgrund der zahlreichen Freiheitsgrade und der starken Interaktionen zwischen Calciumionen und Glutamat in Lösung eine besondere Herausforderung dar. Daher wurde die Methode der Biasing Potential Replica Exchange Molekular-Dynamik Simulationen im Hinblick auf das Sampling von Oligoglutamaten justiert und es erfolgte die Simulation von Peptiden verschiedener Kettenlängen in Anwesenheit von Calciumionen. Mit Hilfe der Sketch-Map Analyse konnten im Rahmen der Simulationen zahlreiche stabile Ionen-Peptid-Komplexe identifiziert werden, welche die Formation von Prä-Nukleations-Strukturen beeinflussen könnten. Abhängig von der Kettenlänge des Peptids weisen diese Komplexe charakteristische Abstände zwischen den Calciumionen auf. Diese ähneln einigen Abständen zwischen den Calciumionen in jenen Phasen von Calcium-Oxalat Kristallen, die in Anwesenheit von Oligoglutamaten gewachsen sind. Die Analogie der Abstände zwischen Calciumionen in gelösten Ionen-Peptid-Komplexen und in Calcium-Oxalat Kristallen könnte auf die Bedeutung von Ionen-Peptid-Komplexen im Prozess der Nukleation und des Wachstums von Biomineralen hindeuten und stellt einen möglichen Erklärungsansatz für die Fähigkeit von Oligoglutamaten zur Beeinflussung der Phase des sich formierenden Kristalls dar, die experimentell beobachtet wurde.

Stacked searches for high-energy neutrinos from blazars with IceCube

In the year 2013, the detection of a diffuse astrophysical neutrino flux with the IceCube neutrino telescope – constructed at the geographic South Pole – was announced by the IceCube collaboration. However, the origin of these neutrinos is still unknown as no sources have been identified to this day. Promising neutrino source candidates are blazars, which are a subclass of active galactic nuclei with radio jets pointing towards the Earth. In this thesis, the neutrino flux from blazars is tested with a maximum likelihood stacking approach, analyzing the combined emission from uniform groups of objects. The stacking enhances the sensitivity w.r.t. the still unsuccessful single source searches. The analysis utilizes four years of IceCube data including one year from the completed detector. As all results presented in this work are compatible with background, upper limits on the neutrino flux are given. It is shown that, under certain conditions, some hadronic blazar models can be challenged or even rejected. Moreover, the sensitivity of this analysis – and any other future IceCube point source search – was enhanced by the development of a new angular reconstruction method. It is based on a detailed simulation of the photon propagation in the Antarctic ice. The median resolution for muon tracks, induced by high-energy neutrinos, is improved for all neutrino energies above IceCube’s lower threshold at 0.1TeV. By reprocessing the detector data and simulation from the year 2010, it is shown that the new method improves IceCube’s discovery potential by 20% to 30% depending on the declination.