Simulazioni atomiche di canali ionici del potassio: limiti del Force Field AMBER nelle stime di conduttanza

Le simulazioni atomiche dei canali ionici del K+ mettono in evidenza una significativa inaccuratezza: i valori di conduttanza del canale stimati sono molto distanti dai valori sperimentali. Per tentare di migliorare le simulazioni e i loro risultati, è necessario modificare il modello di Force Field impiegato. Si è scelto di adottare il modello di Force Field AMBER, uno dei più utilizzati per simulazioni di molecole biologiche in dinamica molecolare, e di agire sui valori dei parametri di Lennard-Jones cercando un set di valori che permetta di minimizzare la distanza tra la conduttanza stimata e la conduttanza sperimentale delle soluzioni saline. L’analisi ha dimostrato che non è possibile riprodurre in modo quantitativo i valori sperimentali di conduttanza di soluzioni saline di Na+ e K+ in simulazioni atomiche basate su un modello di Force Field additivo.

Caratterizzazione di un setup miniaturizzato per studi di elettrofisiologia

La messa a punto di tecniche come il patch clamp e la creazione di doppi strati lipidici artificiali (artificial bilayers) ha permesso di effettuare studi su canali ionici per valutarne la permeabilità, la selettività ionica, la dipendenza dal voltaggio e la cinetica, sia in ambito di ricerca, per analizzarne il funzionamento specifico, sia in quello farmaceutico, per studiare la risposta cellulare a nuovi farmaci prodotti. Tali tecniche possono essere inoltre impiegate nella realizzazione di biosensori, combinando così i vantaggi di specificità e sensibilità dei sistemi biologici alla veloce risposta quantitativa degli strumenti elettrochimici. I segnali in corrente che vengono rilevati con questi metodi sono dell’ordine dei pA e richiedono perciò l’utilizzo di strumentazioni molto costose e ingombranti per amplificarli, analizzarli ed elaborarli correttamente. Il gruppo di ricerca afferente al professor Tartagni della facoltà di ingegneria di Cesena ha sviluppato un sistema miniaturizzato che possiede molte delle caratteristiche richieste per questi studi. L’obiettivo della tesi riguarda la caratterizzazione sperimentale di tale sistema con prove di laboratorio eseguite in uno spazio ridotto e senza l’impiego di ulteriori strumentazioni ad eccezione del PC. In particolare le prove effettuate prevedono la realizzazione di membrane lipidiche artificiali seguita dall’inserimento e dallo studio del comportamento di due particolari canali ionici comunemente utilizzati per questa tipologia di studi: la gramicidina A, per la facilità d’inserimento nella membrana e per la bassa conduttanza del singolo canale, e l’α-emolisina, per l’attuale impiego nella progettazione e realizzazione di biosensori. Il presente lavoro si sviluppa in quattro capitoli di seguito brevemente riassunti. Nel primo vengono illustrate la struttura e le funzioni svolte dalla membrana cellulare, rivolgendo particolare attenzione ai fosfolipidi e alle proteine di membrana; viene inoltre descritta la struttura dei canali ionici utilizzati per gli esperimenti. Il secondo capitolo comprende una descrizione del metodo utilizzato per realizzare i doppi strati lipidici artificiali, con riferimento all’analogo elettrico che ne risulta, ed una presentazione della strumentazione utilizzata per le prove di laboratorio. Il terzo e il quarto capitolo sono dedicati all’elaborazione dei dati raccolti sperimentalmente: in particolare vengono prima analizzati quelli specifici dell’amplificatore, quali quelli inerenti il rumore che si somma al segnale utile da analizzare e la variabilità inter-prototipo, successivamente si studiano le prestazioni dell’amplificatore miniaturizzato in reali condizioni sperimentali e dopo aver inserito i canali proteici all’interno dei bilayers lipidici.

Proprietà elettriche di cellule interagenti con matrici polimeriche biocompatibili

L'utilizzo di polimeri organici coniugati in dispositivi elettronici per applicazioni biologiche, grazie alle loro proprietà meccaniche ed elettriche, insieme alla loro biocompatibilità, è un campo di ricerca relativamente nuovo e in rapida espansione. In questo lavoro di tesi si utilizza la tecnica del Voltage Clamp in configurazione whole cell per caratterizzare le proprietà elettrofisiologiche della linea cellulare di glioblastoma multiforme (T98G) e per registrare le correnti ioniche di cellule adese su una matrice polimerica biocompatibile di poli(etilenediossitiofene)-poli(stirenesulfonato) (PEDOT:PSS). La tecnica consiste nel bloccare il potenziale di membrana al valore desiderato, secondo un preciso protocollo di stimolazione, misurando la corrente necessaria per mantenere costante il potenziale presente tra le due superfici della membrana cellulare. Nella prima parte del lavoro le cellule sono state perfuse con farmaci inibitori dei canali potassio, prima con il bloccante non specifico tetraetilammonio (TEA), e poi selettivamente tramite bloccanti specifici come iberiotossina e dendrotossina. Il 44% circa delle cellule ha evidenziato una significativa corrente residua riconducibile all'attività dei canali ionici voltaggio-dipendenti Kv1.2. Al contrario nelle cellule restanti questi canali non sono espressi. Successivamente, sempre utilizzando le T98G, si è analizzato come lo stato di ossido-riduzione del polimero coniugato PEDOT:PSS possa influenzare le correnti dei canali ionici di membrana; è emerso che il substrato di PEDOT:PSS ridotto provoca una diminuzione significativa della corrente registrata rispetto al substrato di controllo (petri in polistirene). Questi risultati sono stati confrontati con le curve di proliferazione delle cellule T98G coltivate per 24h, 48h e 72h sui diversi substrati considerati, evidenziando interessanti correlazioni nel caso del substrato PEDOT:PSS ridotto.

Parametrizzazione e validazione di campi di forza polarizzabili per l'acetonitrile

Il perfezionamento dei campi di forza in meccanica molecolare, necessario per migliorare l’accuratezza della modellazione classica di materiali, è un procedimento dispendioso. L’accuratezza dei campi di forza è tuttavia la chiave per la predizione affidabile di proprietà chimico-fisiche dalle simulazioni MD. A questo scopo, risulta importante l’inclusione esplicita della polarizzazione, trascurata nei campi di forze tradizionali. Il modello dell’oscillatore di Drude rappresenta una soluzione computazionalmente conveniente ed è implementato in diversi software di simulazione. In questo modello, la polarizzazione atomica è resa dall’introduzione di una particella carica e di massa ridotta, ancorata all’atomo polarizzabile. In questo lavoro di tesi abbiamo sviluppato una procedura per ottenere un campo di forza polarizzabile per molecole organiche in fase liquida, prendendo in esame un solvente polare molto comune: l’acetonitrile. Il nostro approccio si serve di calcoli quantomeccanici preliminari per la determinazione dei valori di riferimento di alcune proprietà molecolari: le cariche parziali atomiche, il momento di dipolo e la polarizzabilità. A questi calcoli seguono due fasi di parametrizzazione basate su algoritmi di minimizzazione. La prima fase riguarda la parametrizzazione delle polarizzabilità atomiche descritte con il modello di Drude e ha come scopo la riproduzione della polarizzabilità molecolare quantomeccanica. Nella seconda fase, si sono ottimizzati i parametri del potenziale Lennard-Jones in modo da riprodurre la densità sperimentale a temperatura e pressione ambiente, ottenendo diverse parametrizzazioni del campo di forza polarizzabile. Infine, queste parametrizzazioni sono state confrontate sulla base della loro capacità di riprodurre alcune proprietà di bulk, quali entalpia di vaporizzazione, costante dielettrica, coefficiente di diffusione e specifiche funzioni di distribuzione radiale.

Sviluppo di un modulo VHDL per interfacciamento Ethernet-FPGA in applicazioni di high throughput screening

In molti settori della ricerca in campo biologico e biomedico si fa ricorso a tecniche di High Throughput Screening (HTS), tra cui studio dei canali ionici. In questo campo si studia la conduzione di ioni attraverso una membrana cellulare durante fenomeni che durano solo alcuni millisecondi. Allo scopo sono solitamente usati sensori e convertitori A/D ad elevata velocità insieme ad opportune interfacce di comunicazione, ad elevato bit-rate e latenza ridotta. In questa tesi viene descritta l'implementazione di un modulo VHDL per la trasmissione di dati digitali provenienti da un sistema HTS attraverso un controller di rete integrato dotato di un'interfaccia di tipo Ethernet, individuando le possibili ottimizzazioni specifiche per l'applicazione di interesse.

Dispositivi per la diagnostica basati su biomembrana lipidica artificiale

Il presente elaborato ha lo scopo di descrivere le principali caratteristiche e applicazioni delle biomembrane lipidiche artificiali utilizzate nel campo biochimico e biomedico. Nel Capitolo 1. viene presentata una panoramica generale della membrana cellulare, descrivendo la sua struttura a “mosaico fluido” e i principali componenti che la costituiscono, cioè i lipidi e le proteine transmembrana. Viene quindi descritto uno dei ruoli fondamentali della membrana cellulare, ovvero il trasporto di soluti all’interno e all’esterno della cellula. Vengono schematizzate le tipologie di trasporto, attivo e passivo, e la funzione dei canali ionici, un particolare tipo di proteina transmembrana che permette il passaggio selettivo di ioni dall'esterno all'interno della cellula o viceversa. Il Capitolo 2. si focalizza sui principali modelli di biomembrane lipidiche artificiali. Infatti, a seconda del tipo di metodo e di materiale utilizzato, è possibile ottenere dei prototipi che differiscono per caratteristiche e funzionalità. Verranno illustrate le membrane lipidiche nere (BLM), i doppi strati lipidici (bilayer) con supporto solido (SLB), i bilayer lipidici ibridi e i doppi strati con ammortizzatore polimerico. Per ognuna di queste biomembrane artificiali verranno analizzati i metodi di formazione e gli utilizzi in campo biomedico. Verranno poi descritti i metodi di incorporazione delle proteine nel doppio strato lipidico e le tecniche per stabilizzare il bilayer e realizzare una piattaforma sensoriale. Nel Capitolo 3 verranno presentate le principali applicazioni che utilizzano membrane artificiali, sia per lo studio dei principali processi cellulari di membrana e screening dei farmaci sia per la realizzazione di piattaforme sensorizzate. Infine nel Capitolo 4. si considereranno le innovazioni attese nel campo delle biomembrane artificiali anticipando le loro potenziali applicazioni future. Infatti, le prospettive in questo campo sono molto promettenti soprattutto per quel che riguarda lo screening di nuovi farmaci.

Sviluppo di un modulo di acquisizione dati ad elevato throughput da amplificatori per elettrofisiologia

Lo scopo dell'elaborato di tesi è la progettazione e lo sviluppo di alcuni moduli di un software per la lettura ad elevato throughput di dati da particolari dispositivi per elettrofisiologia sviluppati dall'azienda Elements s.r.l. Elements produce amplificatori ad alta precisione per elettrofisiologia, in grado di misurare correnti a bassa intensità prodotte dai canali ionici. Dato il grande sviluppo che l'azienda sta avendo, e vista la previsione di introdurre sul mercato nuovi dispositivi con precisione e funzionalità sempre migliori, Elements ha espresso l'esigenza di un sistema software che fosse in grado di supportare al meglio i dispositivi già prodotti, e, soprattutto, prevedere il supporto dei nuovi, con prestazioni molto migliori del software già sviluppato da loro per la lettura dei dati. Il software richiesto deve fornire una interfaccia grafica che, comunicando con il dispositivo tramite USB per leggere dati da questo, provvede a mostrarli a schermo e permette di registrarli ed effettuare basilari operazioni di analisi. In questa tesi verranno esposte analisi, progettazione e sviluppo dei moduli di software che si interfacciano direttamente con il dispositivo, quindi dei moduli di rilevamento, connessione, acquisizione ed elaborazione dati.

Estrazione automatica di parametri fisiologici da registrazioni di potenziali d'azione cardiaci

Implementazione di uno strumento in Matlab in grado di analizzare i tracciati di potenziali d'azione cardiaci e di valutarne dei potenziali d'azione in risposta a variazioni di parametri del modello cardiaco della corrente di ripolarizzazione rapida di potassio.

Identificazione dei parametri meccanici del ponte metallico ferroviario a Pontelagoscuro attraverso un algoritmo di ottimizzazione di tipo evolutivo

Nel periodo storico compreso tra la seconda metà dell’Ottocento ed il primo ventennio del Novecento, un’ondata di innovazioni tecnologiche e scientifiche, unitamente all’espansione dell’industria siderurgica e la conseguente diffusione del ferro come materiale da costruzione, portarono alla realizzazione di strutture metalliche grandiose. Ciò fu reso possibile grazie ad una fervida attività di ricerca che permise la risoluzione di problematiche tecniche di assoluto rilievo, come la progettazione di grandi coperture o di ponti destinati al traffico ferroviario in grado di coprire luci sempre maggiori. In questo contesto si sviluppò il sistema della chiodatura come metodo di unione per il collegamento rigido e permanente dei vari elementi che compongono la struttura portante metallica. Ad oggi il sistema della chiodatura è stato quasi completamente sostituito dalla bullonatura di acciaio ad alta resistenza e dalla saldatura, che garantendo gli stessi standard di affidabilità e sicurezza, offrono vantaggi in termini economici e di rapidità esecutiva. Tuttavia lo studio delle unioni chiodate continua a rivestire notevole importanza in tutti quei casi in cui il progettista debba occuparsi di restauro, manutenzione o adeguamento di strutture esistenti che in molti casi continuano ad assolvere le funzioni per le quali erano state progettate. La valutazione delle strutture esistenti, in particolare i ponti, ha assunto un’importanza sempre crescente. L’incremento della mobilità e del traffico sulle infrastrutture di trasporto ha portato ad un incremento contemporaneo di carichi e velocità sui ponti. In particolare nelle ferrovie, i ponti rappresentano una parte strategica della rete ferroviaria e in molti casi, essi hanno già raggiunto i loro limiti di capacità di traffico, tanto è vero che l’età media del sessanta percento dei ponti metallici ferroviari è di un centinaio di anni. Pertanto i carichi di servizio, i cicli di sforzo accumulati a causa dei carichi da traffico e il conseguente invecchiamento delle strutture esistenti, inducono la necessità della valutazione della loro rimanente vita a fatica. In questo contesto, la valutazione delle condizioni del ponte e le conseguenti operazioni di manutenzione o sostituzione diventano indispensabili. Negli ultimi decenni sono state effettuate numerose iniziative di ricerca riguardo il comportamento a fatica dei ponti ferroviari chiodati, poiché le passate esperienze hanno mostrato che tali connessioni sono suscettibili di rotture per fatica. Da uno studio dell’ASCE Committee on Fatigue and Fracture Reliability è emerso che l’ottanta, novanta percento delle crisi nelle strutture metalliche è da relazionarsi ai fenomeni di fatica e frattura. Il danno per fatica riportato dai ponti chiodati è stato osservato principalmente sulle unioni tra elementi principali ed è causato dagli sforzi secondari, che si possono sviluppare in diverse parti delle connessioni. In realtà riguardo la valutazione della fatica sui ponti metallici chiodati, si è scoperto che giocano un ruolo importante molti fattori, anzitutto i ponti ferroviari sono soggetti a grandi variazioni delle tensioni indotte da carichi permanenti e accidentali, così come imperfezioni geometriche e inclinazioni o deviazioni di elementi strutturali comportano sforzi secondari che solitamente non vengono considerati nella valutazione del fenomeno della fatica. Vibrazioni, forze orizzontali trasversali, vincoli interni, difetti localizzati o diffusi come danni per la corrosione, rappresentano cause che concorrono al danneggiamento per fatica della struttura. Per questo motivo si studiano dei modelli agli elementi finiti (FE) che riguardino i particolari delle connessioni e che devono poi essere inseriti all’interno di un modello globale del ponte. L’identificazione degli elementi critici a fatica viene infatti solitamente svolta empiricamente, quindi è necessario che i modelli numerici di cui si dispone per analizzare la struttura nei particolari delle connessioni, così come nella sua totalità, siano il più corrispondenti possibile alla situazione reale. Ciò che ci si propone di sviluppare in questa tesi è un procedimento che consenta di affinare i modelli numerici in modo da ottenere un comportamento dinamico analogo a quello del sistema fisico reale. Si è presa in esame la seguente struttura, un ponte metallico ferroviario a binario unico sulla linea Bologna – Padova, che attraversa il fiume Po tra le località di Pontelagoscuro ed Occhiobello in provincia di Ferrara. Questo ponte fu realizzato intorno agli anni che vanno dal 1945 al 1949 e tra il 2002 e il 2006 ha subito interventi di innalzamento, ampliamento ed adeguamento nel contesto delle operazioni di potenziamento della linea ferroviaria, che hanno portato tra l’altro all’affiancamento di un nuovo ponte, anch’esso a singolo binario, per i convogli diretti nella direzione opposta. Le travate metalliche del ponte ferroviario sono costituite da travi principali a traliccio a gabbia chiusa, con uno schema statico di travi semplicemente appoggiate; tutte le aste delle travi reticolari sono formate da profilati metallici in composizione chiodata. In particolare si è rivolta l’attenzione verso una delle travate centrali, della quale si intende affrontare un’analisi numerica con caratterizzazione dinamica del modello agli Elementi Finiti (FEM), in modo da conoscerne lo specifico comportamento strutturale. Ad oggi infatti l’analisi strutturale si basa prevalentemente sulla previsione del comportamento delle strutture tramite modelli matematici basati su procedimenti risolutivi generali, primo fra tutti il Metodo agli Elementi Finiti. Tuttavia i risultati derivanti dal modello numerico possono discostarsi dal reale comportamento della struttura, proprio a causa delle ipotesi poste alla base della modellazione. Difficilmente infatti si ha la possibilità di riscontrare se le ipotesi assunte nel calcolo della struttura corrispondano effettivamente alla situazione reale, tanto più se come nella struttura in esame si tratta di una costruzione datata e della quale si hanno poche informazioni circa i dettagli relativi alla costruzione, considerando inoltre che, come già anticipato, sforzi secondari e altri fattori vengono trascurati nella valutazione del fenomeno della fatica. Nel seguito si prenderanno in esame le ipotesi su masse strutturali, rigidezze dei vincoli e momento d’inerzia delle aste di parete, grandezze che caratterizzano in particolare il comportamento dinamico della struttura; per questo sarebbe ancora più difficilmente verificabile se tali ipotesi corrispondano effettivamente alla costruzione reale. Da queste problematiche nasce l’esigenza di affinare il modello numerico agli Elementi Finiti, identificando a posteriori quei parametri meccanici ritenuti significativi per il comportamento dinamico della struttura in esame. In specifico si andrà a porre il problema di identificazione come un problema di ottimizzazione, dove i valori dei parametri meccanici vengono valutati in modo che le caratteristiche dinamiche del modello, siano il più simili possibile ai risultati ottenuti da elaborazioni sperimentali sulla struttura reale. La funzione costo è definita come la distanza tra frequenze proprie e deformate modali ottenute dalla struttura reale e dal modello matematico; questa funzione può presentare più minimi locali, ma la soluzione esatta del problema è rappresentata solo dal minimo globale. Quindi il successo del processo di ottimizzazione dipende proprio dalla definizione della funzione costo e dalla capacità dell’algoritmo di trovare il minimo globale. Per questo motivo è stato preso in considerazione per la risoluzione del problema, l’algoritmo di tipo evolutivo DE (Differential Evolution Algorithm), perché gli algoritmi genetici ed evolutivi vengono segnalati per robustezza ed efficienza, tra i metodi di ricerca globale caratterizzati dall’obiettivo di evitare la convergenza in minimi locali della funzione costo. Obiettivo della tesi infatti è l’utilizzo dell’algoritmo DE modificato con approssimazione quadratica (DE-Q), per affinare il modello numerico e quindi ottenere l’identificazione dei parametri meccanici che influenzano il comportamento dinamico di una struttura reale, il ponte ferroviario metallico a Pontelagoscuro.