Caratterizzazione di vini bianchi tipici siciliani in termini di profilo in molecole volatili e contenuto di etilcarbammato ed ammine biogene

Nella mia sperimentazione si è determinato le concentrazioni di ammine biogene ed etilcarbammato di vini autoctoni siciliani prodotti a partire da vitigni Catarratto, Grillo ed Insolia provenienti da 4 cantine siciliane e detrrminato il profilo in molecole volatili di questi vini mediante la tecnica GS/MS-SPME e il naso elettronico. Per quanto concerne le ammine biogene, l’ammina rilevata in maggiore quantità è stata la putrescina, mentre la 2-feniletilammina e le poliammine sono state rilevate a bassissime concentrazioni. L’istamina era al di sotto del limite di determinazione (0,1 ppm) nei vini della cantina D e nei vini Grillo e Catarratto della cantina C. La tiramina è stata rilevata solo in 7 dei vini analizzati a concentrazioni mai eccedenti 1,31ppm. I vini della cantina B, pur presentando in 2 campioni delle elevate concentrazioni di putrescina, erano privi di poliammine e tiramina. Per quanto riguarda l’etilcarbammato, esso è risultato sempre al di sotto dei 15ppb, indipendentemente dal vitigno e dalla cantina di produzione, con l’eccezione dei campioni di Catarratto della cantina D. Il vino Grillo proveniente dalla stessa cantina presentava i più bassi valori di etilcarbammato determinato tra i campioni analizzati.Per il profilo in molecole volatili rilevate mediante GC/MS-SPME sono state identificate circa 20 molecole appartenenti a classi chimiche differenti quali esteri, alcoli, acidi ed aldeidi.Al fine di evidenziare meglio le differenze tra i diversi campioni di vino, è stata effettuata un’analisi PCA. La proiezione dei diversi campioni sul piano cartesiano definito dalle componenti 1 e 2 era in grado di spiegare, rispettivamente, il 46,44% e il 17,52% della varianza. I diversi campioni sono stati raggruppati principalmente per cantina e non in rapporto al vitigno. Infatti, sono stati individuati 4 cluster corrispondenti alle 4 cantine di produzione. Dal momento che il profilo sensoriale di un vino è la risultante, oltre che di un complesso equilibrio quali-quantitativo di numerose molecole, anche delle interazioni che si vengono a creare tra le molecole volatili e non in un sistema complesso come il vino, è stata effettuata un’analisi mediante naso elettronico. Come precedentemente, i risultati ottenuti sono stati analizzati mediante l’analisi della componente principale che è stata in grado di spiegare più del 80% della varianza totale. Anche in questo caso, i campioni tendevano a raggrupparsi per cantina e non per vitigno. Dall’analisi critica dei dati si evince come il processo produttivo adottato abbia influito in maniera più significativa rispetto al vitigno sulla differenziazione dei profili in molecole volatili determinati sia mediante gascromatografia che naso elettronico. In conclusione, i risultati della mia sperimentazione hanno evidenziato: marcate differenze in termini di profili in molecole volatili tra i vini analizzati solo in rapporto al processo produttivo adottato dalle cantine, sebbene la zona di produzione della materia prima sia piuttosto ristretta; ottima qualità dei prodotti considerati in termini di molecole potenzialmente tossiche per la salute del consumatore.

Effetti degli starter e delle condizioni di maturazione su salami tipici

In questo lavoro, sono stati analizzati come caso di studio due tipi di salami fermentati italiani (tipo Felino e tipo Milano). Lo scopo è stato quello di valutare l’effetto di diverse condizioni ambientali nelle celle d’asciugamento e l’effetto di diverse colture starter sulle caratteristiche dei salami di produzione industriale. Alla fine della maturazione, i salami ottenuti sono stati analizzati per determinare i conteggi microbici, l’accumulo di ammine biogene (AB) e il profilo aromatico volatile, mediante l’utilizzo delle analisi SPME-GC. Questi profili sono stati confrontati con i risultati di un gruppo panel esperto. I salami tipo Felino, inoculati solo con Stafilococchi, sono stati caratterizzati da un lento abbassamento del pH e dalla presenza di alti contenuti di AB. Inoltre, sono state osservate le attività enzimatiche specifiche degli Stafilococchi, come il metabolismo della fenilalanina, che hanno modificato radicalmente i profili volatili del prodotto. Anche le diverse condizioni d’asciugamento applicate sono state in grado d’influenzare alcune caratteristiche sensoriali dei prodotti finali come la durezza e la masticabilità che mostrano diverse cinetiche di perdita d’acqua.

Attivita tirosina decarbossilasica di enterococcus faecalis in terreno sintetico

Le ammine biogene sono composti azotati a basso peso molecolare che vengono prodotti in seguito alla decarbossilazione degli aminoacidi da parte di specifici enzimi microbici della famiglia delle decarbossilasi. Questi composti sono presenti in diversi alimenti e, in particolare, in quelli fermentati. Nonostante la capacità dell’organismo di metabolizzare tali molecole tramite appositi sistemi di detossificazione una loro eccessiva assunzione provoca sintomatologie deleterie per la salute umana. La tiramina, in particolare, è una delle ammine biogene attualmente più studiate in ragione della diffusa presenza dell’enzima tirosina decarbossilasi (tyrDC) nel pool enzimatico di diversi batteri lattici, specialmente quelli appartenenti al genere Enterococcus. Seppure in letteratura vi siano numerosi studi riguardanti il rapporto fra contenuto di tiramina e l’attività degli enterococchi in molti alimenti, ad oggi sono ridotte le informazioni inerenti la regolazione e il ruolo fisiologico di tale molecola per la cellula microbica. Alla luce di tali considerazioni questa tesi mi sono occupata di approfondire le conoscenze relative l’attività dell’enzima tyrDC in un terreno di coltura a composizione nota da parte dei due ceppi di Enterococcus faecalis EF37 e ATCC29212. A tal fine i ceppi sono stati inoculati in cinque diversi terreni e incubati a tre diverse temperature (20°C, 30°C e 40°C), dopo averli pre-coltivati in terreni contenenti o meno tirosina, allo scopo di valutare se la fase di pre-adattamento fosse in grado di influenzare le performance dei ceppi considerati. Dai risultati ottenuti è emerso che è presente un’estrema eterogeneità nell’attività dell’enzima tyrDC anche all’interno della medesima specie, infatti se il ceppo EF37 ha performance migliori in termini di decarbossilazione quando pre-adattato, il ceppo ATCC29212 non sembra essere influenzato da questo fattore, seppur entrambi presentino una crescita cellulare più accentuata quando pre-adattati. È stata inoltre confermata, alle condizioni adattate, la capacità di produrre 2-feniletilamina da parte del solo ceppo EF37.

Attivita tirosina decarbossilasica in enterococcus mundtii

Le ammine biogene sono il prodotto della decarbossilazione degli amminoacidi da parte di enzimi microbici. Tra essi vi è la tirosina decarbossilasi, caratterizzata dalla possibilità di utilizzare, in assenza di tirosina, la fenilalanina, ottenendo la 2-feniletilamina. In particolare, la tiramina è responsabile della comparsa di importanti sintomi tossicologici, raggruppati con il termine “cheese reaction”. In questa sperimentazione sono stati presi in considerazione 2 ceppi di Enterococcus mundtii (C46 e C53) coltivati in BHI in presenza o assenza di tirosina per caratterizzarne l’attività decarbossilasica. Sono state monitorate la crescita microbica, mediante densità ottica e la produzione di tiramina e 2-feniletilamina mediante tecnica HPLC. Dai risultati ottenuti è emerso che entrambi i ceppi producono tiramina sia in presenza che in assenza del precursore. La concentrazione massima rilevata per il ceppo C46 è stata di 797 mg/l e 767 mg/l per C53. È inoltre emerso che essi possono decarbossilare la fenilalanina, ma solo dopo 8 e 24 ore di incubazione per il ceppo C46 e C53. Per quanto concerne la crescita, entrambi i ceppi hanno raggiunto il massimo valore di densità ottica dopo 6-8 ore a 37°C, con una durata della fase lag ridotta, seguita da un rapido aumento della densità ottica. Non sono state riscontrate differenze significative in termini di massima densità ottica raggiunta (A) e durata della fase lag (λ) tra i due ceppi, mentre C53 ha presentato valori inferiori per quanto riguarda la velocità incremento della densità ottica in fase esponenziale (µmax). Dagli studi genici è emerso che l’organizzazione dell’operone dei ceppi considerati corrisponde con quella filogeneticamente riconosciuta per il genere Enterococcus, ma nonostante la similarità, l’operone manca del gene codificante per l’antiporto Na+/H+. È stata inoltre evidenziata nel genoma dei ceppi considerati un’altra regione che contiene geni codificanti per un ulteriore sistema decarbossilasico.

Caratteristiche chimico-fisiche e microbiologiche di salami in relazione al diametro e alla coltura starter impiegata.

I salumi fermentati sono prodotti caratterizzati da grandi differenze che riguardano la materia prima, gli ingredienti, le dimensioni e le condizioni di maturazione. Questa differenziazione è dovuta a pratiche storiche, culturali e tradizionali che variano da zona a zona. Il processo produttivo nel nostro Paese è però cambiato radicalmente grazie alle innovazioni tecnologiche. Tra queste l’introduzione delle colture starter ha rappresentato una garanzia di maggiore sicurezza igienica e sanitaria ma ha determinato una standardizzazione delle caratteristiche qualitative dei prodotti. Infatti, tutte le trasformazioni biochimiche che avvengono durante la maturazione possono essere influenzate dall’uso degli starter, così come dal diametro dei salami, che influenza la cinetica di perdita dell’acqua e la disponibilità di ossigeno all’interno del prodotto. Lo scopo del lavoro descritto nel mio elaborato è stato quello di valutare l’effetto di queste due variabili su alcune caratteristiche fisico-chimiche, microbiologiche e sul contenuto in amine biogene di salami prodotti industrialmente a partire dalla stessa miscela di ingredienti. Questo impasto carneo è stato addizionato di due starter diversi: oltre all’impiego di Staphylococcus carnosus, un primo lotto è stato inoculato con Lactobacillus sakei mentre un secondo con Pediococcus pentosaceus. Successivamente i due lotti sono stati insaccati in budelli sintetici aventi dimensioni diverse (grande con peso del prodotto all’insacco di 5.3kg e piccolo, con peso all’insacco di 385g). I risultati ottenuti da questa sperimentazione confermano il fatto che la dimensione è uno degli aspetti che maggiormente influenza la caratteristiche del prodotto. Inoltre, anche le colture starter hanno dato risultati diversi indipendentemente dal diametro, dimostrando la necessità di una più approfondita conoscenza tecnologica dei prodotti studiati in relazione alle attività microbiche che si svolgono durante la fermentazione e la maturazione.

Caratterizzazione della popolazione microbica di salami fermentati spontaneamente

Le fermentazioni spontanee nei salami sono un fenomeno molto complesso in cui si assiste ad una successione di diverse popolazioni microbiche (micrococchi, stafilococchi e batteri lattici), avente ognuna un ruolo importante nell’ottenimento delle qualità desiderate del prodotto finale. Questo susseguirsi vorticoso di popolazioni microbiche nelle fermentazioni spontanee viene ormai regolamentato dall’uso di colture starter che, aggiunte in quantità idonee immediatamente prima dell’insaccamento, contribuiscono in maniera essenziale ad un rapido, corretto (e soprattutto sicuro) processo di fermentazione prima e di disidratazione poi. Poiché però l’impiego di starter segue spesso protocolli indifferenziati, è importante la selezione di colture starter “taylor made”, in grado di differenziare i prodotti in maniera riconoscibile con l’apporto di specifici tratti organolettici e sensoriali. Dunque, con questo elaborato di tesi si è voluto procedere alla raccolta di potenziali colture starter provenienti da diversi salami della tradizione mediterranea (salame di tipo bresciano, romagnolo e lucano), fermentati spontaneamente. Questi prodotti sono stati dapprima caratterizzati per quanto riguarda le loro caratteristiche microbiologiche, chimico-fisiche, profilo aromatico e il loro contenuto in ammine biogene. Successivamente, in particolare per il salame di tipo bresciano, sono stati isolati ceppi di interesse dalla popolazione lattica, poi identificati e testati per alcune caratteristiche di interesse tecnologico (capacità di produrre ammine biogene e profilo aromatico). I ceppi riscontrati, appartenenti alle specie Lactobacillus sakei e Lactobacillus curvatus, hanno mostrato una notevole biodiversità, soprattutto per quanto riguarda la produzione di molecole aromatiche, e quindi una notevole capacità, anche nell’ambito della stessa specie, di modulare la produzione di composti molto importanti dal punto di vista organolettico.

Confronto tra caratteristiche tecnologiche di diversi ceppi di Lactobacillus sakei in differenti condizioni.

Lactobacillus sakei è una specie altamente specializzata nella colonizzazione di prodotti a base di carne. Possiede un genoma relativamente ridotto nel quale, ad esempio, mancano le informazioni per la sintesi di 18 aminoacidi su 20, per i quali risulta dunque auxotrofo. La carne è quindi un substrato ottimale poiché tali aminoacidi sono facilmente disponibili. Una delle caratteristiche più interessanti di Lb. sakei, ed il motivo per cui viene largamente impiegato come coltura starter nell’industria dei salumi, è la sua capacità di permanere attivo e dominante per lungo tempo, anche quando le fonti principali di zuccheri sono esaurite. Inoltre tale microorganismo non è in grado di produrre sostanze dannose, come ad esempio le ammine biogene, ma bensì produce sostanze con attività antimicrobica: le batteriocine (sakacina). Questo elaborato ha costituito il primo tassello di un lavoro più ampio di selezione di ceppi di Lb. sakei da destinare all’utilizzo come colture starter. Sono state valutate alcune caratteristiche tecnologiche di ceppi di Lb. sakei, isolati da prodotti ottenuti tramite fermentazioni spontanee, e le loro performance sono state confrontate con ceppi di collezione e con un ceppo utilizzato a livello commerciale. In particolare si sono studiate le cinetiche di fermentazione a temperature diverse, variabili da 5°C a 40°C, e a differenti concentrazione di NaCl, da 0 a 8%. Per quanto riguarda la temperatura, tutti i ceppi sono stati in grado di sviluppare tra 5°C e 35°C, ma nessuno è riuscito a 40°C. I risultati hanno evidenziato una notevole variabilità delle performance fermentative tra 15 e 20°C. Per quanto riguarda la presenza di sale, tutti i ceppi sono cresciuti a tutte le concentrazioni di NaCl, anche a quella più elevata (8%), seppur con cinetiche diverse. Questi diversi pattern fermentativi, associati con altre caratteristiche che verranno valutate in futuro, determineranno i criteri di scelta per nuovi starter.

Effetto di starter autoctoni sulla qualità e la sicurezza di salami tradizionali spagnoli

Il lavoro svolto in questa tesi aveva l’obiettivo di valutare il potenziale tecnologico e bioprotettivo di ceppi di batteri lattici (LAB) isolati da salami tradizionali spagnoli. In particolare due ceppi (Lactiplantibacillus paraplantarum BPF2 e Pediococcus acidilactici ST6) che avevano dimostrato buone performance in vitro sono stati utilizzati, da soli o in miscela, come colture starter per la produzione salami e i prodotti ottenuti sono stati confrontati con un controllo a fermentazione spontanea ed un prodotto addizionato di uno starter commerciale contenente LAB e stafilococchi. Per quanto riguarda gli aspetti tecnologici, il pH ha mostrato cinetiche di acidificazione simili in tutti i prodotti, mentre il calo peso era più lento nel controllo. A livello microbiologico, i campioni addizionati di colture starter hanno mostrato carichi di LAB molto più elevati già al tempo zero, senza differenze significative in relazione al ceppo utilizzato. Enterobatteri e lieviti hanno mostrato andamenti simili in tutti i campioni. L’utilizzo di colture starter ha invece avuto un impatto rilevante sul contenuto di ammine biogene, con valori totali doppi nel campione ottenuto con fermentazione spontanea, e sul profilo in metaboliti volatili (soprattutto a carico di composti derivanti dall’acido piruvico). L’aspetto più rilevante di questa tesi è stato ottenuto nel challenge test, utilizzando come microrganismo target Listeria monocytogenes (inoculo 3 log ufc/g): infatti, nel controllo e nei campioni contenenti starter commerciale, L. monocytogenes era in grado di crescere fino a valori superiori a 5.7 log ufc/g, mentre i ceppi BPF2 e ST6 hanno determinato una riduzione del suo carico cellulare (2.4 log ufc/g). Questo conferma quindi le grandi potenzialità anti-listeria dei due ceppi testati e la loro attitudine ad essere utilizzati, oltre che come starter per i salami, anche come colture bioprotettive con lo specifico compito di contrastare lo sviluppo di L. monocytogenes.

Caratterizzazione di ceppi di Companilactobacillus alimentarius isolati da salami spagnoli fermentati spontaneamente

Il lavoro svolto in questa tesi era finalizzato allo studio di 14 ceppi di Companilactobacillus alimentarius isolati da salami spagnoli con un duplice obiettivo: da una parte aumentare la conoscenza relativa a questa specie, le cui informazioni in letteratura sono ancora scarse, dall’altra valutarne i caratteri di sicurezza e le performance tecnologiche per selezionare ceppi da utilizzare eventualmente come colture starter e/o bioprotettive in salumi fermentati o altri prodotti alimentari. I ceppi sono stati prima testati per la loro capacità di produrre ammine biogene, con circa la metà dei ceppi in grado di produrre tiramina, mentre solo 4 accumulavano istamina e due putrescina. Dai dati relativi all’antibiotico resistenza è emerso che la metà dei ceppi erano sensibili agli 8 antibiotici testati. È stata valutata poi la capacità dei ceppi di crescere a diverse temperature (10, 20 e 30°C) e a diverse concentrazioni di NaCl (0, 2,5, 5%). I risultati hanno mostrato un andamento variabile: un solo ceppo non era in grado di crescere a 10°C, mentre a 30°C i ceppi si dividevano in due gruppi, ed i ceppi caratterizzati da maggiori velocità di sviluppo a questa temperatura erano anche quelli dotati delle migliori performance a 20 e 10°C. Mentre per la capacità di crescere a diverse concentrazioni di sale, la variabilità era più evidente alla più alta concentrazione di NaCl (5%). Infine, è stata valutata la capacità di produrre molecole che potessero avere un impatto sul profilo sensoriale del prodotto, tra cui i composti derivanti dall’acido piruvico (acetoino, diacetile, 2-butanone), acido acetico, etanolo, benzeneacetaldeide e benzaldeide, ed anche in questo caso i ceppi hanno mostrato attitudini diverse all’accumulo di questi metaboliti. Sulla base dei dati ottenuti in questo lavoro sperimentale, 2 ceppi tra i 14 testati sono stati scelti per future sperimentazioni, dapprima in vitro e poi in sistemi reali, per valutare il loro potenziale come nuove colture starter.

Valutazione delle performances di nuove colture starter in salami prodotti industrialmente

Le colture starter sono preparazioni comprendenti una o più specie microbiche aggiunte per condurre i processi fermentativi, con risvolti positivi sulle caratteristiche tecnologiche e igienico-sanitarie dei prodotti ottenuti. Questa tesi si inserisce in un progetto europeo volto a sfruttare la biodiversità microbica di salumi dell'area del Mediterraneo, utilizzandoli come fonte di isolamento di batteri lattici (LAB) da proporre come nuove colture starter e/o bioprotettive. Prove preliminari hanno permesso di selezionare un numero ridotto di LAB, considerati sicuri, che in questa tesi sono stati studiati per il loro potenziale tecnologico (cinetiche di crescita a 20°C) per valutarne l’attitudine ad essere utilizzati in salami prodotti a livello industriale. Sulla base di queste prove effettuate in laboratorio, 4 ceppi (Latilactobacillus sakei 2M7 e SWO10, Lactiplantibacillus paraplantarum BPF2, Latilactobacillus curvatus KN55) sono stati utilizzati per la produzione di salami a livello industriale, confrontando le loro performances con uno starter commerciale utilizzato comunemente in azienda. I risultati hanno mostrato come tutti i ceppi siano stati in grado di sviluppare nella matrice con cinetiche simili, anche se questa acidificazione non ha limitato il contenuto di enterobatteri, ad eccezione del campione controllo, dove tuttavia i LAB hanno mostrato una ridotta capacità di persistenza. Il ceppo BPF2 ha ridotto significativamente il contenuto di tiramina nel prodotto finito. L’analisi dei metaboliti volatili ha evidenziato un diverso accumulo di prodotti derivanti dallo sviluppo dei LAB (es. acidi, aldeidi), anche se tali differenze erano difficilmente percepibili a livello olfattivo e tutti i salami presentavano un odore gradevole. Ulteriori prove saranno necessarie per garantire la qualità microbiologica del prodotto finito (controllo degli enterobatteri) e per effettuare anche test sensoriali, al fine anche di favorire la differenziazione dei prodotti.