Modeling and simulation of a synthetic genetic circuit that implements a multicelled behavior in a growing microcolony of E. coli

Synthetic Biology is a relatively new discipline, born at the beginning of the New Millennium, that brings the typical engineering approach (abstraction, modularity and standardization) to biotechnology. These principles aim to tame the extreme complexity of the various components and aid the construction of artificial biological systems with specific functions, usually by means of synthetic genetic circuits implemented in bacteria or simple eukaryotes like yeast. The cell becomes a programmable machine and its low-level programming language is made of strings of DNA. This work was performed in collaboration with researchers of the Department of Electrical Engineering of the University of Washington in Seattle and also with a student of the Corso di Laurea Magistrale in Ingegneria Biomedica at the University of Bologna: Marilisa Cortesi. During the collaboration I contributed to a Synthetic Biology project already started in the Klavins Laboratory. In particular, I modeled and subsequently simulated a synthetic genetic circuit that was ideated for the implementation of a multicelled behavior in a growing bacterial microcolony. In the first chapter the foundations of molecular biology are introduced: structure of the nucleic acids, transcription, translation and methods to regulate gene expression. An introduction to Synthetic Biology completes the section. In the second chapter is described the synthetic genetic circuit that was conceived to make spontaneously emerge, from an isogenic microcolony of bacteria, two different groups of cells, termed leaders and followers. The circuit exploits the intrinsic stochasticity of gene expression and intercellular communication via small molecules to break the symmetry in the phenotype of the microcolony. The four modules of the circuit (coin flipper, sender, receiver and follower) and their interactions are then illustrated. In the third chapter is derived the mathematical representation of the various components of the circuit and the several simplifying assumptions are made explicit. Transcription and translation are modeled as a single step and gene expression is function of the intracellular concentration of the various transcription factors that act on the different promoters of the circuit. A list of the various parameters and a justification for their value closes the chapter. In the fourth chapter are described the main characteristics of the gro simulation environment, developed by the Self Organizing Systems Laboratory of the University of Washington. Then, a sensitivity analysis performed to pinpoint the desirable characteristics of the various genetic components is detailed. The sensitivity analysis makes use of a cost function that is based on the fraction of cells in each one of the different possible states at the end of the simulation and the wanted outcome. Thanks to a particular kind of scatter plot, the parameters are ranked. Starting from an initial condition in which all the parameters assume their nominal value, the ranking suggest which parameter to tune in order to reach the goal. Obtaining a microcolony in which almost all the cells are in the follower state and only a few in the leader state seems to be the most difficult task. A small number of leader cells struggle to produce enough signal to turn the rest of the microcolony in the follower state. It is possible to obtain a microcolony in which the majority of cells are followers by increasing as much as possible the production of signal. Reaching the goal of a microcolony that is split in half between leaders and followers is comparatively easy. The best strategy seems to be increasing slightly the production of the enzyme. To end up with a majority of leaders, instead, it is advisable to increase the basal expression of the coin flipper module. At the end of the chapter, a possible future application of the leader election circuit, the spontaneous formation of spatial patterns in a microcolony, is modeled with the finite state machine formalism. The gro simulations provide insights into the genetic components that are needed to implement the behavior. In particular, since both the examples of pattern formation rely on a local version of Leader Election, a short-range communication system is essential. Moreover, new synthetic components that allow to reliably downregulate the growth rate in specific cells without side effects need to be developed. In the appendix are listed the gro code utilized to simulate the model of the circuit, a script in the Python programming language that was used to split the simulations on a Linux cluster and the Matlab code developed to analyze the data.

Studio di fattibilità di applicazione di radar UWB per controlli non distruttivi

Studio di fattibilità sull'utilizzo della tecnologia radar Ultra Wideband per il controllo non distruttivo di manufatti in materiale composito in fibra di carbonio. La tecnologia radar UWB permette, a differenza dei radar convenzionali, una maggiore risoluzione e un maggior quantitativo di informazioni estraibili dal segnale ricevuto come eco. Nella prima parte del lavoro ci si è concentrati sulla individuazione dell'eventuale presenza del difetto in lastre di materiale composito di differenti dimensioni. Le lastre vengono "illuminate" da un fascio di onde radar UWB dal cui eco si estraggono le informazioni necessarie per determinare la presenza o meno del difetto. Lo scopo è progettare le basi di un algoritmo che, qualora la lastra in esame presenti una certa difettologia, informi l'utente della presenza dell'anomalia. Nella seconda parte si è passati a scansionare la lastra con un radar UWB in modo tale da costruire un'immagine della stessa grazie alle informazioni ricevute dai segnali eco. Per fare questo è stata necessaria dapprima la costruzione di un movimentatore ad hoc in grado di muovere il radar lungo due dimensioni (per permetterne la scansione del piano della lastra). Il movimentatore, autocostruito, è gestibile da Matlab attraverso cavo USB. L'algoritmo di controllo gestisce sia la movimentazione che l'acquisizione dei segnali ricevuti e quindi la creazione del database, punto di partenza per la creazione dell'immagine della lastra. Rispetto alla prima fase del lavoro dove si cercava di sapere se ci fosse o meno il difetto, ora, si è in grado di determinare dimensione e posizione dello stesso.

Studio di sistemi precipitanti con radar polarimetrico in banda c e disdrometro a microonde

In questo lavoro di tesi si studiano quattro sistemi precipitanti di carattere principalmente convettivo che hanno interessato la regione Emilia-Romagna tra la primavera 2012 e l'inverno 2013. Si fornisce una trattazione che prevede l'utilizzo di due strumenti basati sulla tecnologia radar: il pluviometro disdrometro a microonde PLUDIX e il radar polarimetrico in banda C di San Pietro Capofiume (SPC). Gli strumenti sono posizionati ad una distanza di circa 30 km in linea d'aria. PLUDIX, situato al Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR) di Bologna, rileva le idrometeore al suolo e fornisce informazioni pluviometriche e disdrometriche sulla precipitazione in corso. Il radar SPC analizza echi provenienti dall'atmosfera circostante, fino alla distanza di 112.5 km e all'elevazione di 13° rispetto a terra. Si confrontano i profili temporali di intensità di precipitazione ottenuti da PLUDIX con quelli ricavati dalle variabili polarimetriche radar, che permettono di meglio interpretare l'evoluzione temporale degli eventi. Si procede, inoltre, alla classificazione delle idrometeore in atmosfera. A tal fine si implementa un algoritmo di classificazione polarimetrico basato sul lavoro di Park et al. (2009) e modificato in funzione della letteratura scientifica al riguardo. La classificazione di idrometeore che più interessa è quella relativa alle quote radar sulla verticale del CNR, che può essere messa a confronto con le evidenze disdrometriche da PLUDIX al suolo. I risultati sono soddisfacenti e mostrano che i due strumenti vedono gli stessi fenomeni da due punti di vista. L'analisi combinata dei dati eterogenei da PLUDIX e dal radar SPC permette di ricavare importanti informazioni sui processi fisici in nube e sull'evoluzione temporale e spaziale dei sistemi precipitanti.

Tracking di target multipli in reti di sensori radar

Viene proposta una possibile soluzione al problema del tracking multitarget, tramite una rete di sensori radar basata su tecnoligia ultra wide-band. L'area sorvegliata ha una superficie pari a 100 metri quadri e all'interno di essa si vuole tracciare la traiettoria di più persone.

Surface-enhanced vibrational techniques for the detection of synthetic organic colorants

The research project object of this thesis is focused on the development of an advanced analytical system based on the combination of an improved thin layer chromatography (TLC) plate coupled with infrared (FTIR) and Raman microscopies for the detection of synthetic dyes. Indeed, the characterization of organic colorants, which are commonly present in mixtures with other components and in a very limited amount, still represents a challenging task in scientific analyses of cultural heritage materials. The approach provides selective spectral fingerprints for each compound, foreseeing the complementary information obtained by micro ATR-RAIRS-FTIR and SERS-Raman analyses, which can be performed on the same separated spot. In particular, silver iodide (AgI) applied on a gold coated slide is proposed as an efficient stationary phase for the discrimination of complex analyte mixtures, such as dyes present in samples of art-historical interest. The gold-AgI-TLC plate shows high performances related both to the chromatographic separation of analytes and to the spectroscopic detection of components. The use of a mid-IR transparent inorganic salt as the stationary phase avoids interferences of the background absorption in FTIR investigations. Moreover, by ATR microscopy measurements performed on the gold-AgI surface, a considerable enhancement in the intensity of spectra is observed. Complementary information can be obtained by Raman analyses, foreseeing a SERS activity of the AgI substrate. The method has been tested for the characterization of a mixture of three synthetic organic colorants widely used in dyeing processes: Brilliant Green (BG1), Rhodamine B (BV10) and Methylene Blue (BB9).

Progettazione di un banco di prova per radar UWB per l'analisi non distruttiva dei danni sui materiali compositi

Breve introduzione sui radar, sistemi Ultra WideBand, controlli non distruttivi e progettazione di un banco di prova per radar UWB per l'analisi non distruttiva dei danni sui materiali compositi.

Analisi di algoritmi per reti di sensori radar uwb basati su misure sperimentali

In un sistema radar è fondamentale rilevare, riconoscere e cercare di seguire il percorso di un eventuale intruso presente in un’area di osservazione al fine ultimo della sicurezza, sia che si consideri l’ambito militare, che anche quello civile. A questo proposito sono stati fatti passi avanti notevoli nella creazione e sviluppo di sistemi di localizzazione passiva che possano rilevare un target (il quale ha come unica proprietà quella di riflettere un segnale inviato dal trasmettitore), in modo che esso sia nettamente distinto rispetto al caso di assenza dell’intruso stesso dall’area di sorveglianza. In particolare l’ultilizzo di Radar Multistatico (ossia un trasmettitore e più ricevitori) permette una maggior precisione nel controllo dell’area d’osservazione. Tra le migliori tecnologie a supporto di questa analisi vi è l’UWB (Ultra Wide-Band), che permette di sfruttare una banda molto grande con il riscontro di una precisione che può arrivare anche al centimetro per scenari in-door. L’UWB utilizza segnali ad impulso molto brevi, a banda larga e che quindi permettono una risoluzione elevata, tanto da consentire, in alcune applicazioni, di superare i muri, rimuovendo facilmente gli elementi presenti nell’ambiente, ossia il clutter. Quindi è fondamentale conoscere algoritmi che permettano la detection ed il tracking del percorso compiuto dal target nell’area. In particolare in questa tesi vengono elaborati nuovi algoritmi di Clustering del segnale ricevuto dalla riflessione sull’intruso, utilizzati al fine di migliorare la visualizzazione dello stesso in post-processing. Infine questi algoritmi sono stati anche implementati su misure sperimentali attuate tramite nodi PulsOn 410 Time Domain, al fine ultimo della rilevazione della presenza di un target nell’area di osservazione dei nodi.

Rappresentazione della caratteristiche spaziali di eventi temporaleschi di elevata intensità attraverso l'uso combinato di misure da pluviometro e da radar

Il presente lavoro di Tesi si inserisce nell’ambito della previsione e caratterizzazione spaziale di fenomeni convettivi, tipicamente intensi e a carattere locale, come i sistemi temporaleschi organizzati che spesso sono i protagonisti di eventi calamitosi importanti. Lo studio è stato condotto in modo tale da poter apportare un contributo ai sistemi previsionali, i quali attualmente non consentono una valutazione accurata ed una caratterizzazione spaziale attendibile di detti fenomeni temporaleschi (Elisabetta Trovatore, Ecoscienza, numero 4, 2012). Lo scopo è stato quello di verificare l’esistenza caratteristiche spaziali comuni a questa tipologia di eventi di precipitazione mediante un confronto tra la curva di riduzione della precipitazione media all’area, ottenuta dalle mappe di precipitazione cumulata oraria desunte da radar meteorologici e da mappe corrispondenti ricavate a partire dai dati pluviometrici osservati al suolo servendosi di tre modelli di interpolazione spaziale: Kriging ordinario (con variogramma desunto da dati ai pluviometri e da dati al radar), Inverso delle Distanze Pesate (Inverse Distance Weighted, IDW) e Poligoni di Voronoi.Le conclusioni del lavoro di Tesi hanno evidenziato che: - la curva di riduzione della precipitazione valutata da dati radar viene in generale meglio approssimata da due metodi: il Kriging ordinario, che utilizza come modello di variogramma teorico quello dedotto da misure ai pluviometri, e le distanze inverse pesate (IDW, Inverse Distance Weighted); - paragonando le curve di riduzione della precipitazione media all’area dedotte da radar si è potuta notare l’esistenza di quattro curve, di cui tre relative ad eventi che hanno registrato valori elevati di intensità di precipitazione (superiori ai 140 mm/h), che presentano un comportamento analogo, mentre nella porzione superiore del grafico sono presenti due curve che non seguono tale andamento e che sono relative ad eventi convettivi meno intensi; - non esiste una distanza alla quale tutti i variogrammi, desunti da dati radar, raggiungono la stazionarietà ma si è visto come questa, per i sei casi di studio, vari tra 10000 e 25000 metri.

Engineering the synthesis of lantibiotics in e. Coli by combining the cynnamicin and nisin modification systems.

I lantibiotici sono molecole peptidiche prodotte da un gran numero di batteri Gram-positivi, posseggono attività antibatterica contro un ampio spettro di germi, e rappresentano una potenziale soluzione alla crescente problematica dei patogeni multi-resistenti. La loro attività consiste nel legame alla membrana del bersaglio, che viene quindi destabilizzata mediante l’induzione di pori che determinano la morte del patogeno. Tipicamente i lantibiotici sono formati da un “leader-peptide” e da un “core-peptide”. Il primo è necessario per il riconoscimento della molecola da parte di enzimi che effettuano modifiche post-traduzionali del secondo - che sarà la regione con attività battericida una volta scissa dal “leader-peptide”. Le modifiche post-traduzionali anticipate determinano il contenuto di amminoacidi lantionina (Lan) e metil-lantionina (MeLan), caratterizzati dalla presenza di ponti-tioetere che conferiscono maggior resistenza contro le proteasi, e permettono di aggirare la principale limitazione all’uso dei peptidi in ambito terapeutico. La nisina è il lantibiotico più studiato e caratterizzato, prodotto dal batterio L. lactis che è stato utilizzato per oltre venti anni nell’industria alimentare. La nisina è un peptide lungo 34 amminoacidi, che contiene anelli di lantionina e metil-lantionina, introdotti dall’azione degli enzimi nisB e nisC, mentre il taglio del “leader-peptide” è svolto dall’enzima nisP. Questo elaborato affronta l’ingegnerizzazione della sintesi e della modifica di lantibiotici nel batterio E.coli. In particolare si affronta l’implementazione dell’espressione eterologa in E.coli del lantibiotico cinnamicina, prodotto in natura dal batterio Streptomyces cinnamoneus. Questo particolare lantibiotico, lungo diciannove amminoacidi dopo il taglio del leader, subisce modifiche da parte dell’enzima CinM, responsabile dell’introduzione degli aminoacidi Lan e MeLan, dell’enzima CinX responsabile dell’idrossilazione dell’acido aspartico (Asp), e infine dell’enzima cinorf7 deputato all’introduzione del ponte di lisinoalanina (Lal). Una volta confermata l’attività della cinnamicina e di conseguenza quella dell’enzima CinM, si è deciso di tentare la modifica della nisina da parte di CinM. A tal proposito è stato necessario progettare un gene sintetico che codifica nisina con un leader chimerico, formato cioè dalla fusione del leader della cinnamicina e del leader della nisina. Il prodotto finale, dopo il taglio del leader da parte di nisP, è una nisina completamente modificata. Questo risultato ne permette però la modifica utilizzando un solo enzima invece di due, riducendo il carico metabolico sul batterio che la produce, e inoltre apre la strada all’utilizzo di CinM per la modifica di altri lantibiotici seguendo lo stesso approccio, nonché all’introduzione del ponte di lisinoalanina, in quanto l’enzima cinorf7 necessita della presenza di CinM per svolgere la sua funzione.

Simulation of bistatic radar experiments with deep space missions

L’obiettivo del lavoro esposto nella seguente relazione di tesi ha riguardato lo studio e la simulazione di esperimenti di radar bistatico per missioni di esplorazione planeteria. In particolare, il lavoro si è concentrato sull’uso ed il miglioramento di un simulatore software già realizzato da un consorzio di aziende ed enti di ricerca nell’ambito di uno studio dell’Agenzia Spaziale Europea (European Space Agency – ESA) finanziato nel 2008, e svolto fra il 2009 e 2010. L’azienda spagnola GMV ha coordinato lo studio, al quale presero parte anche gruppi di ricerca dell’Università di Roma “Sapienza” e dell’Università di Bologna. Il lavoro svolto si è incentrato sulla determinazione della causa di alcune inconsistenze negli output relativi alla parte del simulatore, progettato in ambiente MATLAB, finalizzato alla stima delle caratteristiche della superficie di Titano, in particolare la costante dielettrica e la rugosità media della superficie, mediante un esperimento con radar bistatico in modalità downlink eseguito dalla sonda Cassini-Huygens in orbita intorno al Titano stesso. Esperimenti con radar bistatico per lo studio di corpi celesti sono presenti nella storia dell’esplorazione spaziale fin dagli anni ’60, anche se ogni volta le apparecchiature utilizzate e le fasi di missione, durante le quali questi esperimenti erano effettuati, non sono state mai appositamente progettate per lo scopo. Da qui la necessità di progettare un simulatore per studiare varie possibili modalità di esperimenti con radar bistatico in diversi tipi di missione. In una prima fase di approccio al simulatore, il lavoro si è incentrato sullo studio della documentazione in allegato al codice così da avere un’idea generale della sua struttura e funzionamento. È seguita poi una fase di studio dettagliato, determinando lo scopo di ogni linea di codice utilizzata, nonché la verifica in letteratura delle formule e dei modelli utilizzati per la determinazione di diversi parametri. In una seconda fase il lavoro ha previsto l’intervento diretto sul codice con una serie di indagini volte a determinarne la coerenza e l’attendibilità dei risultati. Ogni indagine ha previsto una diminuzione delle ipotesi semplificative imposte al modello utilizzato in modo tale da identificare con maggiore sicurezza la parte del codice responsabile dell’inesattezza degli output del simulatore. I risultati ottenuti hanno permesso la correzione di alcune parti del codice e la determinazione della principale fonte di errore sugli output, circoscrivendo l’oggetto di studio per future indagini mirate.

Synthetic studies towards a new fulvestrant analogue

A study towards the synthesis of a new fulvestrant analogue with improved bioavailability was carried out. In this work a twelve-step synthetic route starting from β-estradiol was optimized and a palladium (Pd)-catalyzed endo-selective Heck reaction for the functionalization of an advanced intermediate was investigated.

Analisi dei fenomeni franosi lenti nell'abitato di Gaggio Montano mediante interferometria radar

I movimenti lenti delle colate in terra sono una caratteristica geomorfologica comune nell’Appennino settentrionale e sono uno dei principali agenti di modellazione del paesaggio. Spesso case e piccoli centri abitati sorgono in zone affette da questo tipo di movimento franoso e di conseguenza subiscono danni causati da piccoli spostamenti. In questo lavoro di Tesi vengono presentati i risultati ottenuti dall’interferometria radar ad apertura sintetica (InSAR) mediante elaborazione tramite StaMPS (Stanford Method of Persistent Scatterers), utilizzando la tecnica avanzata Small Baseline Subset (Berardino et al., 2002). Questo metodo informatico è applicato alle acquisizioni rilevate dai satelliti Envisat e COSMO-SkyMed in orbita ascendente e discendente, ottenendo una copertura di dati che va dal 2004 al 2015, oltre ad un rilevamento geologico-geomorfologico in dettaglio eseguito nell’area di studio. Questa tecnica di telerilevamento è estremamente efficace per il monitoraggio dei fenomeni di deformazione millimetrica che persistono sulla superficie terrestre, basata sull'impiego di serie temporali d’immagini radar satellitari (Ferretti et al., 2000). Lo studio è stato realizzato nel paese di Gaggio Montano nell’Appennino bolognese. In questa zona sono stati identificati diversi corpi di frana che si muovono con deformazioni costanti durante il tempo di investigazione e grazie ai risultati ottenuti dai satelliti è possibile confrontare tale risultato. Gli spostamenti misurati con il metodo InSAR sono dello stesso ordine di grandezza dei movimenti registrati dai sondaggi inclinometrici. Le probabili cause dell’instabilità di versante a Gaggio Montano sono di natura antropica, in quanto alti tassi di deformazione sono presenti nelle zone dove sorgono case di recente costruzione e complessi industriali. Un’altra plausibile spiegazione potrebbe essere data dalla ricarica costante d’acqua, proveniente dagli strati dei Flysch verso l’interno del complesso caotico sottostante, tale dinamica causa un aumento della pressione dell’acqua nelle argille e di conseguenza genera condizioni d’instabilità sul versante. Inoltre, i depositi franosi rilevati nell’area di studio non mostrano nessun tipo di variazione dovuta ad influenze idrologiche. Per questo motivo le serie temporali analizzare tendo ad essere abbastanza lineari e costanti nel tempo, non essendo influenzate da cicli stagionali.

SAR ed effetti termici su Cheratinociti sottoposti a Radiofrequenze

Negli ultimi anni, la popolazione è stata esposta a vari tipi di campi elettromagnetici generati da strumentazioni elettroniche e dispositivi di telecomunicazione. In questa tesi, si valutano SAR ed effetti termici prodotti da tre antenne patch a radiofrequenza sia su Cheratinociti (cellule dell'epidermide) in vitro che sull'epidermide umana in vivo caratterizzata in un modello multistrato contenente tessuti biologici. Le antenne progettate hanno frequenze di risonanza di 1.8 e 2.4 GHz, tipiche delle bande utilizzate rispettivamente da LTE (Long Term Evolution, la più recente evoluzione degli standard di telefonia mobile cellulare) e dalle moderne tecnologie Wi-Fi, e di 60 GHz, propria delle cosiddette onde millimetriche. Vengono valutati quindi il SAR (Specific Absorption Rate, grandezza che fornisce una misura dell'assorbimento delle onde da parte dei tessuti biologici) e le variazioni di temperatura prodotte dall'applicazione del campo elettromagnetico: ciò viene realizzato attraverso l'equazione del calore stazionaria e, nel caso dell'epidermide in vivo, con la Bioheat Equation, che contempla anche la circolazione sanguigna ed il calore generato nei processi metabolici che avvengono nell'organismo.

UWB radar sensor networks: Detection algorithms design and experimental analysis

In the last years radar sensor networks for localization and tracking in indoor environment have generated more and more interest, especially for anti-intrusion security systems. These networks often use Ultra Wide Band (UWB) technology, which consists in sending very short (few nanoseconds) impulse signals. This approach guarantees high resolution and accuracy and also other advantages such as low price, low power consumption and narrow-band interference (jamming) robustness. In this thesis the overall data processing (done in MATLAB environment) is discussed, starting from experimental measures from sensor devices, ending with the 2D visualization of targets movements over time and focusing mainly on detection and localization algorithms. Moreover, two different scenarios and both single and multiple target tracking are analyzed.