Individuazione e caratterizzazione dei prodotti di degradazione ossidativa dei secoiridoidi nell'olio vergine di oliva mediante tecniche analitiche innovative

Lo scopo di questo lavoro di tesi è la caratterizzazione dei prodotti di ossidazione di diversi fenoli idrofili contenuti nell’olio vergine d’oliva come idrossitirosolo, tirosolo e la forma dialdeidica dell’acido decarbossimetil elenolico legato all’idrossitirosolo, e la loro identificazione nel prodotto durante la conservazione. L’obiettivo della ricerca è trovare degli indici analitici che possono essere usati sia come marker di “freschezza” dell’olio vergine di oliva sia nella valutazione della “shelf life” del prodotto stesso. Due sistemi di ossidazione sono stati usati per ossidare le molecole sopracitate: ossidazione enzimatica e ossidazione di Fenton. I prodotti di ossidazione sono stati identificati come chinoni, dimeri e acidi.

Study of the antioxidant fraction in edible olive oils obtained from different technological systems and parameters

Questo lavoro di tesi è stato suddiviso in tre parti. L’argomento principale è stato lo “Studio della componente antiossidante di oli ottenuti da olive mediante l’utilizzo di diversi sistemi e parametri tecnologici”. E’ ben noto come la qualità ossidativa di un olio di oliva dipenda oltre che dalla sua composizione in acidi grassi, dalla presenza di composti caratterizzati da un elevata attività antiossidante, ovvero le sostanze fenoliche. I composti fenolici contribuiscono quindi in maniera preponderante alla shelf life dell’olio extravergine di oliva. Inoltre sono state riscontrate delle forti correlazione tra alcune di queste sostanze e gli attributi sensoriali positivi di amaro e piccante. E’ poi da sottolineare come il potere antiossidante dei composti fenolici degli oli vergini di oliva, sia stato negli ultimi anni oggetto di considerevole interesse, poiché correlato alla protezione da alcune patologie come ad esempio quelle vascolari, degenerative e tumorali. Il contenuto delle sostanze fenoliche negli oli di oliva dipende da diversi fattori: cultivar, metodo di coltivazione, grado di maturazione delle olive e ovviamente dalle operazioni tecnologiche poiché possono variare il quantitativo di questi composti estratto. Alla luce di quanto appena detto abbiamo valutato l’influenza dei fattori agronomici (metodi di agricoltura biologica, integrata e convenzionale) e tecnologici (riduzione della temperatura della materia prima, aggiunta di coadiuvanti in fase di frangitura e di gramolatura, confronto tra tre oli extravergini di oliva ottenuti mediante diversi sistemi tecnologici) sul contenuto in composti fenolici di oli edibili ottenuti da olive (paper 1-3-4). Oltre alle sostanze fenoliche, negli oli di oliva sono presenti altri composti caratterizzati da proprietà chimiche e nutrizionali, tra questi vi sono i fitosteroli, ovvero gli steroli tipici del mondo vegetale, che rappresentano la frazione dell’insaponificabile quantitativamente più importante dopo gli idrocarburi. La composizione quali-quantitativa degli steroli di un olio di oliva è una delle caratteristiche analitiche più importanti nella valutazione della sua genuinità; infatti la frazione sterolica è significativamente diversa in funzione dell’origine botanica e perciò viene utilizzata per distinguere tra di loro gli oli e le loro miscele. Il principale sterolo nell’olio di oliva è il β- sitosterolo, la presenza di questo composto in quantità inferiore al 90% è un indice approssimativo dell’aggiunta di un qualsiasi altro olio. Il β-sitosterolo è una sostanza importante dal punto di vista della salute, poiché si oppone all’assorbimento del colesterolo. Mentre in letteratura si trovano numerosi lavori relativi al potere antiossidante di una serie di composti presenti nell’olio vergine di oliva (i già citati polifenoli, ma anche carotenoidi e tocoferoli) e ricerche che dimostrano invece come altri composti possano promuovere l’ossidazione dei lipidi, per quanto riguarda il potere antiossidante degli steroli e dei 4- metilsteroli, vi sono ancora poche informazioni. Per questo è stata da noi valutata la composizione sterolica in oli extravergini di oliva ottenuti con diverse tecnologie di estrazione e l’influenza di questa sostanza sulla loro stabilità ossidativa (paper 2). E’ stato recentemente riportato in letteratura come lipidi cellulari evidenziati attraverso la spettroscopia di risonanza nucleare magnetica (NMR) rivestano una importanza strategica da un punto di vista funzionale e metabolico. Questi lipidi, da un lato un lato sono stati associati allo sviluppo di cellule neoplastiche maligne e alla morte cellulare, dall’altro sono risultati anche messaggeri di processi benigni quali l’attivazione e la proliferazione di un normale processo di crescita cellulare. Nell’ambito di questa ricerca è nata una collaborazione tra il Dipartimento di Biochimica “G. Moruzzi” ed il Dipartimento di Scienze degli Alimenti dell’Università di Bologna. Infatti, il gruppo di lipochimica del Dipartimento di Scienze degli Alimenti, a cui fa capo il Prof. Giovanni Lercker, da sempre si occupa dello studio delle frazioni lipidiche, mediante le principali tecniche cromatografiche. L’obiettivo di questa collaborazione è stato quello di caratterizzare la componente lipidica totale estratta dai tessuti renali umani sani e neoplastici, mediante l’utilizzo combinato di diverse tecniche analitiche: la risonanza magnetica nucleare (1H e 13C RMN), la cromatografia su strato sottile (TLC), la cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) e la gas cromatografia (GC) (paper 5-6-7)

Sulla energia dissipata in alcuni organi di macchina

Questa tesi riguarda l'analisi delle trasmissioni ad ingranaggi e delle ruote dentate in generale, nell'ottica della minimizzazione delle perdite di energia. È stato messo a punto un modello per il calcolo della energia e del calore dissipati in un riduttore, sia ad assi paralleli sia epicicloidale. Tale modello consente di stimare la temperatura di equilibrio dell'olio al variare delle condizioni di funzionamento. Il calcolo termico è ancora poco diffuso nel progetto di riduttori, ma si è visto essere importante soprattutto per riduttori compatti, come i riduttori epicicloidali, per i quali la massima potenza trasmissibile è solitamente determinata proprio da considerazioni termiche. Il modello è stato implementato in un sistema di calcolo automatizzato, che può essere adattato a varie tipologie di riduttore. Tale sistema di calcolo consente, inoltre, di stimare l'energia dissipata in varie condizioni di lubrificazione ed è stato utilizzato per valutare le differenze tra lubrificazione tradizionale in bagno d'olio e lubrificazione a “carter secco” o a “carter umido”. Il modello è stato applicato al caso particolare di un riduttore ad ingranaggi a due stadi: il primo ad assi paralleli ed il secondo epicicloidale. Nell'ambito di un contratto di ricerca tra il DIEM e la Brevini S.p.A. di Reggio Emilia, sono state condotte prove sperimentali su un prototipo di tale riduttore, prove che hanno consentito di tarare il modello proposto [1]. Un ulteriore campo di indagine è stato lo studio dell’energia dissipata per ingranamento tra due ruote dentate utilizzando modelli che prevedano il calcolo di un coefficiente d'attrito variabile lungo il segmento di contatto. I modelli più comuni, al contrario, si basano su un coefficiente di attrito medio, mentre si può constatare che esso varia sensibilmente durante l’ingranamento. In particolare, non trovando in letteratura come varia il rendimento nel caso di ruote corrette, ci si è concentrati sul valore dell'energia dissipata negli ingranaggi al variare dello spostamento del profilo. Questo studio è riportato in [2]. È stata condotta una ricerca sul funzionamento di attuatori lineari vite-madrevite. Si sono studiati i meccanismi che determinano le condizioni di usura dell'accoppiamento vite-madrevite in attuatori lineari, con particolare riferimento agli aspetti termici del fenomeno. Si è visto, infatti, che la temperatura di contatto tra vite e chiocciola è il parametro più critico nel funzionamento di questi attuatori. Mediante una prova sperimentale, è stata trovata una legge che, data pressione, velocità e fattore di servizio, stima la temperatura di esercizio. Di tale legge sperimentale è stata data un'interpretazione sulla base dei modelli teorici noti. Questo studio è stato condotto nell'ambito di un contratto di ricerca tra il DIEM e la Ognibene Meccanica S.r.l. di Bologna ed è pubblicato in [3].

Nuovo modello animale per lo studio della working memory: validazione farmacologica e applicazioni

The present study was performed to validate a spatial working memory task using pharmacological manipulations. The water escape T-maze, which combines the advantages of the Morris water maze and the T-maze while minimizes the disadvantages, was used. Scopolamine, a drug that affects cognitive function in spatial working memory tasks, significantly decreased the rat performance in the present delayed alternation task. Since glutamate neurotransmission plays an important role in the maintaining of working memory, we evaluated the effect of ionotropic and metabotropic glutamatergic receptors antagonists, administered alone or in combination, on rat behaviour. As the acquisition and performance of memory tasks has been linked to the expression of the immediately early gene cFos, a marker of neuronal activation, we also investigated the neurochemical correlates of the water escape T-maze after pharmacological treatment with glutamatergic antagonists, in various brain areas. Moreover, we focused our attention on the involvement of perirhinal cortex glutamatergic neurotransmission in the acquisition and/or consolidation of this particular task. The perirhinal cortex has strong and reciprocal connections with both specific cortical sensory areas and some memory-related structures, including the hippocampal formation and amygdala. For its peculiar position, perirhinal cortex has been recently regarded as a key region in working memory processes, in particular in providing temporary maintenance of information. The effect of perirhinal cortex lesions with ibotenic acid on the acquisition and consolidation of the water escape T-maze task was evaluated. In conclusion, our data suggest that the water escape T-maze could be considered a valid, simple and quite fast method to assess spatial working memory, sensible to pharmacological manipulations. Following execution of the task, we observed cFos expression in several brain regions. Furthermore, in accordance to literature, our results suggest that glutamatergic neurotransmission plays an important role in the acquisition and consolidation of working memory processes.

Strategie alimentari atte a incrementare il contenuto di Omega3 e CLA del latte

Tra i componenti naturali biologicamente attivi, e con cui è possibile arricchire il latte, notevole importanza rivestono gli acidi grassi Omega3 e i CLA. I ruoli benefici svolti da questi particolari lipidi si manifestano soprattutto nella regolazione dei processi infiammatori, nella prevenzione del diabete e delle malattie cardiovascolari; è inoltre dimostrato come i CLA abbiano attività anticancerogena e ipocolesterolemica, stimolino il sistema immunitario e prevengano l’insorgenza del diabete e delle malattie croniche non trasmissibili. Lo scopo di questo lavoro è stato quello di individuare, in condizioni sperimentali controllate e nelle comuni realtà di allevamento, le possibili strategie alimentari atte ad aumentare le concentrazioni di Omega-3 e CLA del latte vaccino, senza penalizzare i titoli di grasso del latte. I lavori sperimentali effettuati possono essere distinti in 3 fasi: una prima fase in cui l’oggetto principale delle ricerche svolte è stato l’incremento in acidi grassi Omega3 del latte, una seconda fase in cui l’obiettivo si è allargato anche all’incremento delle concentrazioni in CLA, e una terza fase che ha avuto come scopo quello di incrementare i livelli di Omega3 e CLA del latte senza penalizzare i titoli di grasso. Le strategie alimentari più efficaci si sono basate sulla modificazione degli apporti lipidici della razione attraverso la supplementazione con seme di soia o relativo olio, semi di lino o relativo olio, olii di pesce e acido stearico. Le ricerche svolte hanno evidenziato come, attraverso opportune ed accurate modulazioni degli apporti lipidici delle razioni, sia di fatto possibile innalzare i contenuti di acidi grassi della serie Omega3 e CLA nel latte vaccino, senza penalizzare i titoli del grasso del latte.

Valutazione della sostenibilità ambientale tramite metodologia LCA di sistemi per lo sfruttamento di fonti alternative di energia e materiali

La dissertazione ha riguardato l’analisi di sostenibilità di un sistema agronomico per la produzione di olio vegetale a fini energetici in terreni resi marginali dall’infestazione di nematodi. Il processo indagato ha previsto il sovescio di una coltura con proprietà biofumiganti (brassicacea) coltivata in precessione alla specie oleosa (soia e tabacco) al fine di contrastare il proliferare dell’infestazione nel terreno. Tale sistema agronomico è stato confrontato attraverso una analisi di ciclo di vita (LCA) ad uno scenario di coltivazione della stessa specie oleosa senza precessione di brassica ma con l’utilizzo di 1-3-dicloropropene come sistema di lotta ai nematodi. Allo scopo di completare l’analisi LCA con una valutazione dell’impatto sull’uso del suolo (Land use Impact) generato dai due scenari a confronto, sono stati costruiti due modelli nel software per il calcolo del Soil Conditioning Index (SCI), un indicatore quali-quantitativo della qualità del terreno definito dal Dipartimento per l’Agricoltura degli Stati Uniti d’America (USDA).

Basi molecolari ed implicazioni fisio-patologiche dell'alterata glicosilazione di IgG nell'invecchiamento

Introduzione: Le catene N-linked associate al principale sito di N-glicosilazione (Asn297) delle IgG sono di tipo bi-antennario e presentano una grande microeterogeneità in quanto una o entrambe le antenne possono terminare con uno o due residui di acido sialico, galattosio o N-acetilglucosammina ed essere core-fucosilate. Nell’invecchiamento e in malattie infiammatorie aumenta la percentuale di glicani associati alle catene pesanti delle IgG privi del galattosio terminale (IgG-G0). La glicosilazione enzimatica delle proteine è classicamente un processo intracellulare, sebbene recenti studi abbiano messo in evidenza la possibilità di una glicosilazione ecto-cellulare in quanto le piastrine sono ottimi donatori di nucleotidi-zuccheri. Scopo: Misurare le attività delle glicosiltrasferasi ST6Gal1 e B4GalT plasmatiche (potenzialmente responsabili della glicosilazione di proteine plasmatiche) in soggetti di entrambi i sessi e di età compresa tra 5 e 105 anni e correlarle con lo stato di glicosilazione di IgG circolanti (analizzato mediante lectin-blot) e il GlycoAge test, un noto marcatore di invecchiamento, espresso come il logaritmo del rapporto tra gli N-glicani agalattosilati e di-galattosilati associati a glicoproteine plasmatiche. Risultati e conclusioni: I dati ottenuti indicano che: 1) l’attività B4GalT si propone come nuovo marcatore di invecchiamento perché aumenta linearmente con l’età; 2) la ST6Gal1 è maggiormente espressa solo nei bambini e negli over 80; 3) le attività delle due glicosilatransferasi non risultano correlate in modo significativo né tra loro né con il GlycoAge test, indicando che questi tre marcatori siano espressioni di diversi quadri fisio-patologici legati all’invecchiamento; 4) con l’età si ha una predominanza di glicoforme di IgG pro-infiammatorie, ovvero prive dell’acido sialico, del galattosio terminali e del core fucose; 5) l’attività della ST6Gal1 e B4GalT risultano in controtendenza con il grado di sialilazione e galattosilazione delle IgG, indicando quindi che la loro glicosilazione non avviene a livello extracellulare.

Functional relationship of colorectal cancer-associated glycans with malignant phenotype and transcriptome changes

Glycosyltransferases ST6GAL1 and B4GALNT2 (and their cognate antigens Sia6LacNAc and Sda, respectively) are associated with colorectal cancer (CRC) but it is not fully clear their biological and clinical significance. We explored the clinical relevance of both glycosyltransferases by interrogating The Cancer Genome Atlas (TCGA) database while the phenotypic/transcriptomic effects of ST6GAL1/B4GALNT2 overexpression were studied in genetically modified CRC cell lines. Transcriptomic data from CRC patients in TCGA database suggested a moderate impact of ST6GAL1 on CRC progression, although it was not possible to define a clear role for this glycosyltransferase. Transcriptomic analysis of ST6GAL1-transduced cell lines revealed a much deeper effect of ST6GAL1 on gene expression in SW948 than in SW48. The overexpression of ST6GAL1 induced opposite effects on soft agar growth and wound healing in both cell lines. These results indicate that the impact of a cancer-associated glycosyltransferase change on phenotype/transcriptome can be extremely variable, depending on the molecular context of the tumor cell. On the contrary, transcriptomic analysis of B4GALNT2-modified cell lines together with TCGA database survey demonstrated a strong impact of B4GALNT2 on the transcriptional activity of CRC cells, in particular its association with a better prognosis. We suggest an anti-tumoral role of B4GALNT2 in CRC. We also investigated the glycan changes related to ST6GAL1/B4GALNT2 expression in a small cohort of tissues/plasma as well as the N-glycomic profile of CRC, normal and polyp tissues. We found an increase of ST6GAL1 activity in CRC and inflammatory bowel disease plasma samples comparing with plasma from healthy donors. A different Sda protein carrier pattern was observed between healthy donors and CRC plasma samples. β-arrestin 1 is a possible candidate as Sda carrier protein in plasma samples although future validation studies are needed. The alterations found in the N-glycan pattern highlight the importance of N-glycome as a molecular signature in cancer.

Impact of Glycosyltransferases on the Phenotype, Signaling and Transcriptome of Colorectal Cancer Cell Lines. Focus on the role of glycosyltransferases B4GALNT2 and FUT6 and their cognate Sda and sLex antigens

In colorectal cancer (CRC), two carbohydrate structures are modulated: the Sda antigen, synthesized by B4GALNT2, and sLex antigen, mainly synthesized by FUT6. sLex antigen is often overexpressed and associated with worse prognosis; B4GALNT2/Sda antigen are dramatically downregulated but their role in tumor progression and development is not fully clear. TCGA interrogation revealed a dramatic down-regulation of B4GALNT2 mRNA in CRC, compared with normal samples. Patients with higher B4GALNT2 mRNA in CRC samples displayed longer survival. Yet, methylation and miRNA expression play a relevant role in B4GALNT2 downregulation in CRC. To clarify the mechanisms linking the B4GALNT2/Sda expression level to CRC phenotype, three different CRC cell lines were modified to express B4GALNT2: LS174T cell line, in which the constitutively expressed sLex antigen was partially replaced by Sda; SW480/SW620 pair, both lacking Sda and sLex antigens. In LS174T cells, the expression of B4GALNT2 reduced the ability to grow in poor adherence conditions and the expression of ALDH, a stemness marker. In SW620 cells, B4GALNT2 expression impacted on the main aspects of malignancy. In SW480 cells the expression of B4GALNT2 left unchanged the proliferation rate and the wound healing ability. To clarify the impact of sLex on CRC phenotype, the SW480/SW620 pair were permanently transfected to express FUT6 cDNA. In both cell lines, overexpression of FUT6/sLex boosted the clonogenic ability in standard growth conditions. Conversely, the growth in soft agar and the capacity to close a wound were enhanced only in SW620 cells. Transcriptome analysis of CRC cell lines transfected either with B4GALNT2 or FUT6 showed a relevant impact of both enzymes on gene expression modulation. Overall, current data may help to personalize therapies for CRC patients according to the B4GALNT2 levels and support a causal effect of this glycosyltransferase on reducing malignancy independently of sLex inhibition.

Tumor burden as assessed by 18 F FDG PET scan as predictive biomarker for immune checkpoint blockers in advanced NSCLC - a multi centric study

Introduction Only a proportion of patients with advanced NSCLC benefit from Immune checkpoint blockers (ICBs). No biomarker is validated to choose between ICBs monotherapy or in combination with chemotherapy (Chemo-ICB) when PD-L1 expression is above 50%. The aim of the present study is to validate the biomarker validity of total Metabolic Tumor Volume (tMTV) as assessed by 2-deoxy-2-[18F]fluoro-d-glucose positron emission tomography ([18F]FDG-PET) Material and methods This is a multicentric retrospective study. Patients with advanced NSCLC treated with ICBs, chemotherapy plus ICBs and chemotherapy were enrolled in 12 institutions from 4 countries. Inclusion criteria was a positive PET scan performed within 42 days from treatment start. TMTV was analyzed at each center based on a 42% SUVmax threshold. High tMTV was defined ad tMTV>median Results 493 patients were included, 163 treated with ICBs alone, 236 with chemo-ICBs and 94 with CT. No correlation was found between PD-L1 expression and tMTV. Median PFS for patients with high tMTV (100.1 cm3) was 3.26 months (95% CI 1.94–6.38) vs 14.70 (95% CI 11.51–22.59) for those with low tMTV (p=0.0005). Similarly median OS for pts with high tMTV was 11.4 months (95% CI 8.42 – 19.1) vs 33.1 months for those with low tMTV (95% CI 22.59 – NA), p .00067. In chemo-ICBs treated patients no correlation was found for OS (p = 0.11) and a borderline correlation was found for PFS (p=0.059). Patients with high tMTV and PD-L1 ≥ 50% had a better PFS when treated with combination of chemotherapy and ICBs respect to ICBs alone, with 3.26 months (95% CI 1.94 – 5.79) for ICBs vs 11.94 (95% CI 5.75 – NA) for Chemo ICBs (p = 0.043). Conclusion tMTV is predictive of ICBs benefit, not to CT benefit. tMTV can help to select the best upfront strategy in patients with high tMTV.

Development of machine learning methods for multi-modal biomarkers detection and integration

In medicine, innovation depends on a better knowledge of the human body mechanism, which represents a complex system of multi-scale constituents. Unraveling the complexity underneath diseases proves to be challenging. A deep understanding of the inner workings comes with dealing with many heterogeneous information. Exploring the molecular status and the organization of genes, proteins, metabolites provides insights on what is driving a disease, from aggressiveness to curability. Molecular constituents, however, are only the building blocks of the human body and cannot currently tell the whole story of diseases. This is why nowadays attention is growing towards the contemporary exploitation of multi-scale information. Holistic methods are then drawing interest to address the problem of integrating heterogeneous data. The heterogeneity may derive from the diversity across data types and from the diversity within diseases. Here, four studies conducted data integration using customly designed workflows that implement novel methods and views to tackle the heterogeneous characterization of diseases. The first study devoted to determine shared gene regulatory signatures for onco-hematology and it showed partial co-regulation across blood-related diseases. The second study focused on Acute Myeloid Leukemia and refined the unsupervised integration of genomic alterations, which turned out to better resemble clinical practice. In the third study, network integration for artherosclerosis demonstrated, as a proof of concept, the impact of network intelligibility when it comes to model heterogeneous data, which showed to accelerate the identification of new potential pharmaceutical targets. Lastly, the fourth study introduced a new method to integrate multiple data types in a unique latent heterogeneous-representation that facilitated the selection of important data types to predict the tumour stage of invasive ductal carcinoma. The results of these four studies laid the groundwork to ease the detection of new biomarkers ultimately beneficial to medical practice and to the ever-growing field of Personalized Medicine.