Accuracy of liver stiffness measurement using fibroscan ® to predict the response to antiviral therapy in patients with chronic hepatitis c viral infection

Introduction: Antiviral therapy can prevent disease progression in patients with chronic hepatitis C . Transient Elastografy (TE; Fibroscan) is an accurate surrogate marker to liver fibrosis, by measuring liver stiffness (LS). LS decrease has been associated with sustained virologic response (SVR). Aim: to assess the changes of LS measurments in CHC patients during and one year after Interferon (IFN)-based antiviral therapy (IFN/ribavirin) or (telaprevir+IFN/ribavirin). Methods: consecutive 69 CHC patients (53.6% females, mean age 57.9 ± 11.4) who underwent antiviral therapy for at least 20 weeks were enrolled. LS was measured using FibroScan at baseline, after three months, at the end of treatment and one year after treatment discontinuation. Fibrosis was graded using METAVIR score. Results: twenty patients treated with triple therapy and 49 with IFN/ribavirin. Fifty patients had SVR and 19 were non-responders. SVR patients: F0-F1, F2 and F3 patients (39.1%, 7.2% and 17.4%; respectively) showed no significant LS decrease (P= 0.186, 0.068 and 0.075; respectively). Conversely, in F4 patients (36.2%) LS was significantly decreased (P=0.015) after one year of treatment completion. In all patients with no SVR, no significant decrease in LS was observed. Interestingly, all Patients with F4 fibrosis (even non-responders) showed an initial significant decrease in LS (P=0.024) at 3 months after the start of treatment. However, this decrease was not predictive of SVR; area under the ROC curve 0.369 (CI %: 0.145-0.592) P= 0.265. Conclusion: Our study showed that initial decrease in LSM, especially in patients with higher baseline fibrosis score is unlikely to predict an SVR. In addition no significant association was found between clinical or virological parameters and fibrosis improvement. Further studies are needed to delineate the most appropriate clinical scenarios for the LSM by Fibroscan in chronic hepatitis C and its role in monitoring the response to antiviral treatment.

Serum anti-interferon alpha antibodies in chronic hepatitis C patients treated with pegylated interferon alpha containing therapy

The development of anti-IFNα antibodies is an occurrence described in chronic hepatitis C patients during treatment with Interferonα/PEG-Interferonα. However, its relevance, especially in difficult-to treat patients, has not been defined. Methods: We retrospectively measured the serum levels of anti-IFNα antibodies (baseline and week 12) and IFNα levels (week 12) by ELISA in 76 previous non-responders, and in 14 naive patients treated with Pegylated-IFNα and Ribavirin. A group of 57 healthy donors (HD) was also assessed as control. Positivity to anti-IFNα antibodies was established on the values of HD. Results: Baseline anti-IFNα antibodies were detected in 15.5% of patients and in 7% of HD, with significantly higher concentrations in patients than HD (181.5±389.9 vs 95.9±143.0 ng mL−1, p=0.0023). All positive patients were IFNα-experienced. At week 12, the prevalence of positivity increased to 22.3 and 28.5% in experienced and naïve patients, respectively, and the levels of anti-IFNα antibodies did not differ between the two groups (391±792.3 vs 384.7±662.6 ng mL−1, respectively). IFNα concentrations were significantly lower in antibody-positive patients than in antibody-negatives (988.2±1402 vs 3462±830.8 pg mL−1, p≤0.0001) and the levels of antibodies and IFNα were inversely correlated (r=-0.405, p=0.0001). The antibody-positive population clustered in null responders (67%) and 19/21 patients (90%) did not achieve SVR. Conclusions: The development of anti-IFNα antibodies is a non-negligible occurrence in patients treated with PEG-IFNα, is stable over time, and has a relevant clinical impact when associated with low levels of circulating PEG-IFNα. It should be considered in patients undergoing treatments including PEG-IFNα.

Lo sviluppo di disturbi psichiatrici in pazienti hcv+ sottoposti a terapia antivirale: L'impatto dei nuovi farmaci

Introduzione:l’interferone (IFN) usato per l’eradicazione del virus dell’Epatite C, induce effetti collaterali anche riferibili alla sfera psichica. I dati sugli eventi avversi di tipo psichiatrico dei nuovi farmaci antivirali (DAA) sono limitati. Lo scopo di questo studio è di valutare lo sviluppo di effetti collaterali di tipo psichiatrico in corso di due distinti schemi di trattamento: IFN-peghilato e ribavirina [terapia duplice (standard o SOC)]; DAA in associazione a IFN-peghilato e ribavirina (terapia triplice). Metodi: pazienti HCV+ consecutivi seguiti presso l’Ambulatorio delle Epatiti Croniche della Semeiotica Medica del Dipartimento di Scienze Mediche e Chirurgiche dell’Università di Bologna in procinto di intraprendere un trattamento antivirale a base di IFN, sottoposti ad esame psicodiagnostico composto da intervista clinica semistrutturata e test autosomministrati: BDI, STAXI-2, Hamilton Anxiety Scale, MMPI – 2. Risultati: Sono stati arruolati 84 pazienti, 57/84 (67.9%) nel gruppo in triplice e 27/84 nel gruppo SOC. Quasi tutti i pazienti arruolati hanno eseguito l’intervista clinica iniziale (82/84; 97.6%), mentre scarsa è stata l’aderenza ai test (valori missing>50%). Ad eccezione dell’ansia, la prevalenza di tutti gli altri disturbi (irritabilità, astenia, disfunzioni neurocognitive, dissonnia) aumentava in corso di trattamento. In corso di terapia antivirale 43/84 (51.2%) hanno avuto bisogno di usufruire del servizio di consulenza psichiatrica e 48/84 (57.1%) hanno ricevuto una psicofarmacoterapia di supporto, senza differenze significative fra i due gruppi di trattamento. Conclusioni : uno degli elementi più salienti dello studio è stata la scarsa aderenza ai test psicodiagnostici, nonostante l’elevata prevalenza di sintomi psichiatrici. I risultati di questo studio oltre ad evidenziare l’importanza dei sintomi psichiatrici in corso di trattamento e la rilevanza della consulenza psicologica e psichiatrica per consentire di portare a termine il ciclo terapeutico previsto (migliorandone l’efficacia), ha anche dimostrato che occorre ripensare gli strumenti diagnostici adattandoli probabilmente a questo specifico target.

Epidemiologia e caratterizzazione molecolare di virus emergenti responsabili di Zoonosi: Calcivirus e Virus dell'Epatite E

Il virus dell’Epatite E (HEV) e i calicivirus (norovirus e sapovirus) causano rispettivamente epatite acuta e gastroenterite. Questi virus sono considerati agenti eziologici emergenti rappresentando un problema di sanità pubblica e di sicurezza alimentare. Per HEV, è ormai confermata la trasmissione zoonotica, e il suino è considerato il principale serbatoio asintomatico. Norovirus e sapovirus infettano sia i bambini che gli adulti. Sebbene questi virus siano stati identificati anche negli animali, la possibile trasmissione zoonotica non è stata dimostrata in modo conclusivo. Il lavoro sperimentale condotto durante il Dottorato di Ricerca è stato focalizzato sullo studio degli aspetti biologici ed epidemiologici dell’infezioni causate da HEV e da calicivirus. Per la prima volta in Italia, i risultati ottenuti hanno dimostrato la presenza del virus HEV nei fegati di suini in fase di macellazione ed hanno confermato, attraverso la ricerca di anticorpi, un’elevata esposizione degli animali al virus. Inoltre, mediante la produzione di antigeni e reattivi immunologici, sono stati messi a punto test diagnostici per la ricerca di anticorpi contro HEV nel suino e nei cinghiali. Il lavoro svolto per la ricerca di calicivirus nel suino e nel bovino ha dimostrato la circolazione dei sapovirus in popolazioni di suini asintomatici e la presenza di norovirus nei vitelli affetti da diarrea acuta.Sono stati inoltre sviluppati reattivi immunologici, utilizzando proteine del capside di norovirus umano e bovino espresse con il sistema ricombinante baculovirus. Questi hanno permesso di evidenziare la presenza di anticorpi contro norovirus umano e bovino, in sieri di veterinari professionalmente esposti. Inoltre, sono stati utilizzati per sviluppare metodi per la concentrazione dei virus da matrici a bassa concentrazione.Infine, le VLP sono state utilizzate per valutare l’attivazione del sistema immunitario umano ex vivo. I risultati hanno dimostrato che le VLP di NoV stimolano il sistema immunitario attivando risposte di tipo Th1 e Th2 .

Sorveglianza dell’infezione da virus dell’epatite E (HEV) in Italia: from farm to table

L'epatite E è una malattia umana con caratteristiche di epatite acuta, causata da un ssRNA virus (HEV). Nel 1997, HEV è stato identificato per la prima volta nei suini (SwHEV). In seguito, diverse evidenze, tra cui la vicinanza genetica tra ceppi umani e suini, suggerirono la trasmissione zoonotica del virus. Nella presente tesi, l’identificazione di SwHEV è stata condotta mediante ricerca di porzioni di genoma virale attraverso RT-PCR. Dal 2011 al 2013, sono stati analizzati 343 campioni fecali (da 19 allevamenti) e 70 bili (da 2 macelli) prelevati da altrettanti suini, in diverse Regioni italiane. E’ stato inoltre condotto uno studio retrospettivo su 78 feci (da 3 allevamenti) raccolte nel 2000. Il virus è stato identificato nel 24,5% e 19,2% delle feci raccolte rispettivamente nel 2011-2013 e nel 2000. Nessuna bile è risultata positiva. Mediante sequenziamento del genoma intero di uno dei virus identificati, è stata condotta l’analisi filogenetica per valutarne il grado di correlazione con alti ceppi suini e umani. La presenza di HEV è stata valutata lungo la filiera di produzione suina, dal macello al punto vendita. Trentaquattro campioni di feci, fegato e muscolo sono stati raccolti in un macello da altrettanti suini sani (età:6-7 mesi). Quattordici feci e 2 fegati, sono risultati positivi per HEV. Sono state prelevate 129 salsicce sia allo stabilimento di trasformazione sia alla vendita, ma nessuna è risultata positiva. La presenza di HEV è stata valutata anche nelle salsicce di fegato, fresche e secche, acquistate presso una macelleria. Il genoma virale è stato rilevato nel 22,2% delle salsicce fresche e nel 4,3 % di quelle secche ma la vitalità del virus non è stata dimostrata. In conclusione, lo studio condotto ha confermato l’ampia circolazione di HEV nei suini e la possibile contaminazione dei prodotti carnei derivati, confermando la necessità di una continua sorveglianza.

Epatite E: ruolo del suino nella trasmissione dell'infezione all'uomo, studio di prevalenza in aree rurali della Bolivia

L’infezione da virus dell’ epatite E (HEV) nei suini e nell’uomo è stata segnalata in diversi Paesi. Nei suini, il virus causa infezioni asintomatiche, mentre nell’uomo è responsabile di epidemie di epatite ad andamento acuto nei Paesi a clima tropicale o subtropicale con condizioni igieniche scadenti, di casi sporadici in quelli sviluppati. HEV è stato isolato anche in diversi animali e l’analisi nucleotidica degli isolati virali di origine animale ha mostrato un elevato grado di omologia con i ceppi di HEV umani isolati nelle stesse aree geografiche, avvalorando l’ipotesi che l'infezione da HEV sia una zoonosi. In America del Sud HEV suino è stato isolato per la prima volta in suini argentini nel 2006, mentre solo dal 1998 esistono dati sull’ infezione da HEV nell’uomo in Bolivia. In questa indagine è stato eseguito uno studio di sieroprevalenza in due comunità rurali boliviane e i risultati sono stati confrontati con quelli dello studio di sieroprevalenza sopra menzionato condotto in altre zone rurali della Bolivia. Inoltre, mediante Nested RT-PCR, è stata verificata la presenza di HEV nella popolazione umana e suina. La sieroprevalenza per anticorpi IgG anti-HEV è risultata pari al 6,2%, molto simile a quella evidenziata nello studio precedente. La prevalenza maggiore (24%) si è osservata nei soggetti di età compresa tra 41 e 50 anni, confermando che l’ infezione da HEV è maggiore fra i giovani-adulti. La ricerca di anticorpi anti HEV di classe IgM eseguita su 52 sieri ha fornito 4 risultati positivi. Il genoma virale è stato identificato in uno dei 22 pool di feci umane e l'esame virologico di 30 campioni individuali fecali e 7 individuali di siero ha fornito rispettivamente risultati positivi in 4/30 e 1/7. La Nested RT-PCR eseguita sui 22 pool di feci suine ha dato esito positivo in 7 pool. L’analisi delle sequenze genomiche di tutti gli amplificati ha consentito di stabilire che gli isolati umani appartenevano allo stesso genotipo III di quelli suini e presentavano con questi una elevata omologia aminoacidica (92%).

L'epatite E nei suidi: epidemiologia, diagnosi e filogenesi

Hepatitis E is an infectious viral disease with clinical and morphological features of acute hepatitis. The aetiological agent is the Hepatitis E virus (HEV). The disease represents an important Public Health problem in developing countries where is frequently epidemic and primarily transmitted by fecal-oral route. In the last few years, a certain number of sporadic cases have been also described in industrialized countries, Italy included. A swine HEV was first identified in 1997 and is now considered an ubiquitous virus. Human and swine strains from the same geographical region have shown to have a high level of nucleotidic omology and in experimental infections, the possibility of interspecific transmission of swine strains to humans and of human strains to non-human primates has been demonstrated. Furthermore, some seroepidemiological studies have demonstrated that people working in contact with swine have a higher risk to get infected than normal blood donors. Recently, cases of HEV hepatitis have been directly associated to the ingestion of uncooked tissues from pigs, wild boar or deer and today the disease is considered an emerging zoonosis. The aims of this thesis were: evaluate HEV prevalence in Italian swine herds (both in fattening and in breeding animals); investigate the possibility of finding HEV in livers used for human consumption; investigate if there is any correlation between HEV infection and the presence of macroscopical lesions; investigate HEV prevalence in a demographic managed wild boar population; phylogenetically analyse viral strains identified. During an internship period at Veterinary Laboratories Agency (Weybridge, UK), furthermore, swine samples at different stages of production and slurry lagoons have been analysed. Six swine herds located in North Italy have been sampled at different stage of production. The overall prevalence resulted 42%, and both breeding and fattening animals were positive for HEV infection. A longitudinal study has been conducted in a herd across all stages of production until the slaughtering age. Livers have been collected from the animals at the abattoir and 11.8% of them were positive for HEV infection. No correlations have been identified between HEV infection and macroscopical lesions in pigs affected by different pathological conditions. Of 86 wild boars tested 22 (25%) were positive for HEV. Of the swine tested in UK 21,5 % and 2 of the 9 slurry lagoons (22,2%) were positive for HEV infection. All the strains identified belonged to genotype 3 and showed high percentages of nucleotidic identity with humans and swine strains identified in Europe. The high prevalence detected in these studies confirms the widespread diffusion of HEV in swine populations in Italy and in UK. Phylogenetical analysis of identified strains, similar to those identified in autochthonous human hepatitis E cases of the same geographical area, confirm the hypothesis that pigs can be a font of zoonotical infection. The finding that a fraction of the livers inserted in the food chain are positive for HEV infection it’s of some concern for Public Health. The finding of a high HEV prevalence in all examined farms, together with the observation that infection may be sub-clinical and affect animals at slaughtering age, raise concern because of the possible risk of transmission of HEV to humans by either direct contact with infected pigs, indirect contact with environment and working instruments contaminated with pig feces, or ingestion of contaminated undercooked meat.

Studio immunologico per l'individuazione di pazienti trapiantati per cirrosi HBV relata che potrebbero sospedere la terapia con immunoglobine specifiche (HBIG)

Hepatitis B virus (HBV) recurrence after orthotopic liver transplantation (OLT) is associated with poor graft and patient survival. Treatment with HBV-specific immunoglobulins (HBIG) in combination with nucleos(t)ide analogs is effective in preventing HBV reinfection of the graft and improving OLT outcome. However, the combined immunoprophylaxis has several limitations, mainly the high cost and the lack of standard schedules about duration. So far, the identification of markers able to predict the reinfection risk is needed. Although the HBV-specific immune response is believed to play an essential role in disease outcome, HBV-specific cellular immunity in viral containment in OLT recipients is unclear. To test whether or not OLT recipients maintain robust HBV-specific cellular immunity, the cellular immune response against viral nucleocapsid and envelope-protein of HBV was assessed in 15 OLT recipients and 27 individuals with chronic and 24 subjects with self-limited HBV infection, respectively. The data demonstrate that OLT recipients mounted fewer but stronger clusters of differentiation (CD)8 T cell responses than subjects with self-limited HBV infection and showed a preferential targeting of the nucleocapsid antigen. This focused response pattern was similar to responses seen in chronically infected subjects with undetectable viremia, but significantly different from patients who presented with elevated HBV viremia and who mounted mainly immune responses against the envelope protein. In conclusion, virus-specific CD4 T cell–mediated responses were only detected in subjects with self-limited HBV infection. Thus, the profile of the cellular immunity against HBV was in immune suppressed patients similar to subjects with chronic HBV infection with suppressed HBV-DNA.

Risposta Immunitaria Epatite B specifica in pazienti affetti da Epatocarcinoma

Hepatitis B x protein (HBx) is a non structural, multifunctional protein of hepatitis B virus (HBV) that modulates a variety of host processes.Due to its transcriptional activity,able to alter the expression of growth-control genes,it has been implicated in hepatocarcinogenesis.Increased expression of HBx has been reported on the liver tissue samples of hepatocellular carcinoma (HCC),and a specific anti-HBx immune response can be detected in the peripheral blood of patients with chronic HBV.However,its role and entity has not been yet clarified.Thus,we performed a cross-sectional analysis of anti-HBx specific T cell response in HBV-infected patients in different stage of disease.A total of 70 HBV-infected subjects were evaluated:15 affected by chronic hepatitis (CH-median age 45 yrs),14 by cirrhosis (median age 55 yrs),11 with dysplastic nodules (median age 64 yrs),15 with HCC (median age 60 yrs),15 with IC(median age 53 yrs).All patients were infected by virus genotype D with different levels of HBV viremia and most of them (91%) were HBeAb positive.The HBx-specific T cell response was evaluated by anti-Interferon (IFN)-gamma Elispot assay after in vitro stimulation of peripheral blood mononuclear cells,using 20 overlapping synthetic peptides covering all HBx protein sequence.HBx-specific IFN-gamma-secreting T cells were found in 6 out of 15 patients with chronic hepatitis (40%), 3 out of 14 cirrhosis (21%), in 5 out of 11 cirrhosis with macronodules (54%), and in 10 out of 15 HCC patients (67%). The number of responding patients resulted significantly higher in HCC than IC (p=0.02) and cirrhosis (p=0.02). Central specific region of the protein x was preferentially recognize,between 86-88 peptides. HBx response does not correlate with clinical feature disease(AFP,MELD).The HBx specific T-cell response seems to increase accordingly to progression of the disease, being increased in subjects with dysplastic or neoplastic lesions and can represent an additional tool to monitor the patients at high risk to develop HCC

Evaluation of Microbial Contamination in Bivalve Mollusks: Epidemiology and Diagnosis

Shellfish are filter-feeding organisms that can accumulate many bacteria and viruses. Considering that depuration procedures are not effective in removal of certain microorganisms, shellfish-borne diseases are frequent in many parts of the world, and their control must rely primarily on investigation of prevalence of human pathogens in shellfish and water environment. However, the diffusion of enteric viruses and Vibrio bacteria is not known in many geographical areas, for example in Sardinia, Italy. A survey aimed at investigating the prevalence of Norovirus (NoV), hepatitis A virus (HAV), V. parahaemolyticus, V. cholerae and V. vulnificus was carried out, analyzing both local and imported purified, non-purified and retail shellfish from North Italy and Sardinia. Shellfish from both areas were found contaminated by NoVs, HAV and Vibrio, including retail and purified animals. Molecular analysis evidenced different NoV genogroups and genotypes, including bovine NoVs, as well as pathogenic Vibrio strains, underlining the risk for shellfish consumers. However, also other approaches are needed to control the diffusion of shellfish-borne diseases. It was originally thought that enteric viruses are passively accumulated by shellfish. Recently, it was proven that NoVs bind to specific carbohydrate ligands in oysters, and various NoV strains are characterized by a different bioaccumulation pattern. To deepen the knowledge on this argument, a study was carried out, analyzing bioaccumulation of up to 8 different NoV strains in four different species of shellfish. Different bioaccumulation patterns were observed for each shellfish species and NoV strain used, potentially important in setting up effective shellfish purification protocols. Finally, a novel study of evaluation of viral contamination in shellfish from the French Atlantic coast was carried out following the passage of Xynthia tempest over Western Europe which caused massive destruction. Different enteric viruses were found over a one month period, evidencing the potential of these events of contaminating shellfish.

Il sistema degli endocannabinoidi nella cirrosi epatica complicata da infezione batterica: studio nell’uomo ed in un modello sperimentale animale

Gli endocannabinoidi (EC) sono una classe di composti che mimano gli effetti del Δ9-tetraidrocannabinolo. Essi comprendono l’anandamide (AEA) ed il 2-arachidonoilglicerolo (2-AG), molecole che interagiscono preferenzialmente con due specifici recettori, il CB1 ed il CB2. Più recente è la scoperta di due molecole EC simili, il palmitoiletanolamide (PEA) e l’oleiletanolamide (OEA), che tuttavia agiscono legando recettori diversi tra cui il PPARα ed il TRVP1. Studi sperimentali dimostrano che il sistema degli EC è attivato in corso di cirrosi epatica ed è coinvolto nel processo fibrogenico e nella patogenesi delle alterazioni emodinamiche tipiche della malattia. Esso partecipa alla patogenesi di alcune delle maggiori complicanze della cirrosi quali ascite, encefalopatia, cardiomiopatia ed infezioni batteriche. Scopo del presente studio è stato quello di studiare il ruolo degli EC nella patogenesi delle infezioni batteriche in corso di cirrosi. A tale scopo sono stati eseguiti un protocollo clinico ed uno sperimentale. Nel protocollo sperimentale la cirrosi è stata indotta mediante somministrazione di CCl4 per via inalatoria a ratti maschi Wistar. In tale protocollo i livelli circolanti di tutti gli EC sono risultati significativamente aumentati a seguito della somministrazione di LPS. La somministrazione dell’antagonista del recettore CB1, Rimonabant, inoltre, è stata efficace nel ridurre del 50% la mortalità a 24 ore dei ratti trattati col farmaco rispetto ai ratti trattati col solo LPS. Parallelamente il Rimonabant ha determinato una riduzione dell’espressione genica di molecole pro-infiammatorie e sostanze vasoattive. Lo studio clinico, condotto su 156 pazienti, ha confermato l’attivazione del sistema degli EC in corso di cirrosi epatica. Inoltre è stata identificata una forte correlazione tra il PEA e l’OEA e l’emodinamica sistemica ed una associazione con alcune delle maggiori complicanze. L’analisi statistica ha inoltre individuato l’OEA quale predittore indipendente di insufficenza renale e di sopravvivenza globale.