Development of Original Analytical Methods for the Determination of Drugs of Abuse in Biological Samples

Drug abuse is a major global problem which has a strong impact not only on the single individual but also on the entire society. Among the different strategies that can be used to address this issue an important role is played by identification of abusers and proper medical treatment. This kind of therapy should be carefully monitored in order to discourage improper use of the medication and to tailor the dose according to the specific needs of the patient. Hence, reliable analytical methods are needed to reveal drug intake and to support physicians in the pharmacological management of drug dependence. In the present Ph.D. thesis original analytical methods for the determination of drugs with a potential for abuse and of substances used in the pharmacological treatment of drug addiction are presented. In particular, the work has been focused on the analysis of ketamine, naloxone and long-acting opioids (buprenorphine and methadone), oxycodone, disulfiram and bupropion in human plasma and in dried blood spots. The developed methods are based on the use of high performance liquid chromatography (HPLC) coupled to various kinds of detectors (mass spectrometer, coulometric detector, diode array detector). For biological sample pre-treatment different techniques have been exploited, namely solid phase extraction and microextraction by packed sorbent. All the presented methods have been validated according to official guidelines with good results and some of these have been successfully applied to the therapeutic drug monitoring of patients under treatment for drug abuse.

Molecular analysis of Sigma-1 receptor modulation of the dopamine transporter

Sigma (σ) receptors are well established as a non-opioid, non-phencyclidine, and haloperidol-sensitive receptor family with its own binding profile and a characteristic distribution in the central nervous system (CNS) as well as in endocrine, immune, and some peripheral tissues. Two σ receptors subtypes, termed σ1 and σ2, have been pharmacologically characterized, but, to date, only the σ1 has also been cloned. Activation of σ1 receptors alter several neurotransmitter systems and dopamine (DA) neurotrasmission has been often shown to constitute an important target of σ receptors in different experimental models; however the exact role of σ1 receptor in dopaminergic neurotransmission remains unclear. The DA transporter (DAT) modulates the spatial and temporal aspects of dopaminergic synaptic transmission and interprer the primary mechanism by wich dopaminergic neurons terminate the signal transmission. For this reason present studies have been focused in understanding whether, in cell models, the human subtype of σ1 (hσ1) receptor is able to directly modulate the human DA transporter (hDAT). In the first part of this thesis, HEK-293 and SH-SY5Y cells were permanently transfected with the hσ1 receptor. Subsequently, they were transfected with another plasmid for transiently expressing the hDAT. The hDAT activity was estimated using the described [3H]DA uptake assay and the effects of σ ligands were evaluated by measuring the uptaken [3H]DA after treating the cells with known σ agonists and antagonists. Results illustrated in this thesis demonstrate that activation of overexpressed hσ1 receptors by (+)-pentazocine, the σ1 agonist prototype, determines an increase of 40% of the extracellular [3H]DA uptake, in comparison to non-treated controls and the σ1 antagonists BD-1047 and NE-100 prevent the positive effect of (+)-pentazocine on DA reuptake DA is likely to be considered a neurotoxic molecule. In fact, when levels of intracellular DA abnormally invrease, vescicles can’t sequester the DA which is metabolized by MAO (A and B) and COMT with consequent overproduction of oxygen reactive species and toxic catabolites. Stress induced by these molecules leads cells to death. Thus, for the second part of this thesis, experiments have been performed in order to investigate functional alterations caused by the (+)-pentazocine-mediated increase of DA uptake; particularly it has been investigated if the increase of intracellular [DA] could affect cells viability. Results obtained from this study demonstrate that (+)-pentazocine alone increases DA cell toxicity in a concentration-dependent manner only in cells co-expressing hσ1 and hDAT and σ1 antagonists are able to revert the (+)-pentazocine-induced increase of cell susceptibility to DA toxicity. In the last part of this thesis, the functional cross-talking between hσ1 receptor and hDAT has been further investigated using confocal microscopy. From the acquired data it could be suggested that, following exposure to (+)-pentazocine, the hσ1 receptors massively translocate towards the plasma membrane and colocalize with the hDATs. However, any physical interaction between the two proteins remains to be proved. In conclusion, the presented study shows for the first time that, in cell models, hσ1 receptors directly modulate the hDAT activity. Facilitation of DA uptake induced by (+)-pentazocine is reflected on the increased cell susceptibility to DA toxicity; these effects are prevented by σ1 selective antagonists. Since numerous compounds, including several drugs of abuse, bind to σ1 receptors and activating them could facilitate the damage of dopaminergic neurons, the reported protective effect showed by σ1 antagonists would represent the pharmacological basis to test these compounds in experimental models of dopaminergic neurodegenerative diseases (i.e. Parkinson’s Disease).

Spectroscopic studies on Cyclodextrin and Metal Organic Framework based potential nanovectors for delivery of Anticancer and Antiviral drugs

The aim of this work is to contribute to the development of new multifunctional nanocarriers for improved encapsulation and delivery of anticancer and antiviral drugs. The work focused on water soluble and biocompatible oligosaccharides, the cyclodextrins (CyDs), and a new family of nanostructured, biodegradable carrier materials made of porous metal-organic frameworks (nanoMOFs). The drugs of choice were the anticancer doxorubicin (DOX), azidothymidine (AZT) and its phosphate derivatives and artemisinin (ART). DOX possesses a pharmacological drawback due to its self-aggregation tendency in water. The non covalent binding of DOX to a series of CyD derivatives, such as g-CyD, an epichlorohydrin crosslinked b-CyD polymer (pb-CyD) and a citric acid crosslinked g-CyD polymer (pg-CyD) was studied by UV visible absorption, circular dichroism and fluorescence. Multivariate global analysis of multiwavelength data from spectroscopic titrations allowed identification and characterization of the stable complexes. pg-CyD proved to be the best carrier showing both high association constants and ability to monomerize DOX. AZT is an important antiretroviral drug. The active form is AZT-triphosphate (AZT-TP), formed in metabolic paths of low efficiency. Direct administration of AZT-TP is limited by its poor stability in biological media. So the development of suitable carriers is highly important. In this context we studied the binding of some phosphorilated derivatives to nanoMOFs by spectroscopic methods. The results obtained with iron(III)-trimesate nanoMOFs allowed to prove that the binding of these drugs mainly occurs by strong iono-covalent bonds to iron(III) centers. On the basis of these and other results obtained in partner laboratories, it was possible to propose this highly versatile and “green” carrier system for delivery of phosphorylated nucleoside analogues. The interaction of DOX with nanoMOFs was also studied. Finally the binding of the antimalarial drug, artemisinin (ART) with two cyclodextrin-based carriers,the pb-CyD and a light responsive bis(b-CyD) host, was also studied.

L’elusione fiscale nell’IVA e l’antielusione nell’esperienza comunitaria e nazionale in Europa

La ricerca oggetto della tesi riguarda la disamina delle esperienze comunitarie e nazionali in Europa in materia di elusione IVA ed antielusione IVA, al fine di esaminare le utilizzabili esperienze in materia per la Cina che dovrebbe iniziare a prendere le giuste azioni per fronteggiare il problema della crescente diffusione dei fenomeni dell’elusione IVA, in particolare nel contesto della riforma perdurante dell’IVA cinese verso il modello moderno. A questo fine, prima la tesi ha analizzato dettagliatamente le seguenti principali questioni sulla base delle esperienze comunitarie e nazionali dei determinati Stati Membri dell’UE: la definizione dell’elusione fiscale generale (a tale proposito, più rilevanti le differenze tra elusione fiscale ed altri relativi concetti come risparmio d’imposta, evasione fiscale e simulazione e la relazione intrinseca tra elusione fiscale ed altri relativi concetti come frode alla legge ed abuso del diritto), la definizione dell’elusione IVA (a tale proposito, più rilevanti gli aspetti di particolare interesse ai fini della definizione dell’elusione IVA), i principi e metodologie dell’elusione IVA, le applicazioni delle varie misure antielusive rivolte all’elusione IVA nell’ordinamento comunitario e negli ordinamenti interni degli alcuni principali Stati Membri dell’UE (a tale proposito, più rilevanti l’applicazone del principio Halifax, quale norma antielusiva generale basata sul principio di divieto dell’abuso del diritto, e la considerazione delle altre soluzioni antielusive applicabili nell’IVA, comprese correzioni normative e clausole antielusive specifiche), gli effetti dell’antielusione IVA e i limiti entro cui l’autorità impositiva può esercitare l’antielusione IVA per la tutela degli interessi legittimi dei soggetti passivi come certezza giuridica ed autonomia contrattuale. Poi, la tesi ha avanzato le proposte relative al perfezionamento delle soluzioni antielusive IVA nell’ordinamento tributario cinese, dopo presentati i principali regimi attuali dell’IVA cinese e analizzate le situazioni attuali realtive all’elusione IVA e all’antielusione IVA nel sistema fiscale cinese.

Controlled foreign companies (CFC) e delocalizzazione delle attività economiche nel diritto interno e nell'ordinamento europeo

Le ragioni della delocalizzazione sono molteplici e di differente natura. Si delocalizza, in primo luogo, per ragioni di stampo economico, finanziario eccetera, ma questa spinta naturale alla delocalizzazione è controbilanciata, sul piano strettamente tributario, dall’esigenza di preservare il gettito e da quella di controllare la genuinità della delocalizzazione medesima. E’ dunque sul rapporto tra “spinte delocalizzative” dell’impresa, da un lato, ed esigenze “conservative” del gettito pubblico, dall’altro, che si intende incentrare il presente lavoro. Ciò alla luce del fatto che gli strumenti messi in campo dallo Stato al fine di contrastare la delocalizzazione (più o meno) artificiosa delle attività economiche devono fare i conti con i principi comunitari introdotti con il Trattato di Roma e tratteggiati negli anni dalla giurisprudenza della Corte di Giustizia. In quest’ottica, la disciplina delle CFC costituisce un ottimo punto di partenza per guardare ai fenomeni di produzione transnazionale della ricchezza e agli schemi di ordine normativo preposti alla tassazione di codesta ricchezza. Ed infatti, le norme sulle CFC non fanno altro che omogeneizzare un sistema che, altrimenti, sarebbe lasciato alla libera iniziativa degli uffici fiscali. Tale “normalizzazione”, peraltro, giustifica le esigenze di apertura che sono incanalate nella disciplina degli interpelli disapplicativi. Con specifico riferimento alla normativa CFC, assumono particolare rilievo la libertà di stabilimento ed il principio di proporzionalità anche nella prospettiva del divieto di abuso del diritto. L’analisi dunque verterà sulla normativa CFC italiana con l’intento di comprendere se codesta normativa, nelle sue diverse sfaccettature, possa determinare situazioni di contrasto con i principi comunitari. Ciò anche alla luce delle recenti modifiche introdotte dal legislatore con il d.l. 78/2009 in un quadro normativo sempre più orientato a combattere le delocalizzazioni meramente fittizie.

La violenza sull'anziano: Aspetti medico-legali di una problematica sommersa

L’abuso dell’anziano è una condizione estremamente diffusa e ha un grande costo umano e finanziario. La dimensione reale del problema del maltrattamento dell’anziano non è stata correttamente definita, in particolare i casi segnalati ufficialmente di abuso sono solo la "punta dell'iceberg". In questi anni il problema è stato riconosciuto a livello internazionale come un fenomeno comune, che viene sottostimato e degno di attenzione da parte della comunità scientifica. In Italia non ci sono molti dati, la prevalenza degli abusi e maltrattamenti può essere circa il 5% e il problema è ampiamente sottovalutato, perché sono scarse le segnalazioni di abusi. Le evidenze disponibili dimostrano che l'abuso sugli anziani in Italia costituisce una questione pubblica, tuttavia, la legislazione e le politiche per affrontare il fenomeno sono scarse, riflettendo la mancanza di una strategia nazionale coerente e globale. Il codice civile italiano non contiene alcun riferimento esplicito a persone anziane, e pochi sono anche gli articoli del codice penale che riguardano le persone anziane. Gli articoli più rilevanti interessate sono le seguenti: art. 572: "Maltrattamenti contro familiari e conviventi" e art. 643: "circonvenzione di persone incapaci". Il presente studio ha lo scopo di analizzare la situazione attuale del fenomeno nel nostro Paese, al fine di valutare la dimensione del problema e le relazioni di abuso e maltrattamenti tra vittime, caregiver e operatori sanitari alle autorità.