Effetti dell'acido urico sulle cellule glomerulari mesangiali: meccanismi intracellulari di trasduzione del segnale e possibili implicazioni nella progressione del danno renale e nella sindrome infiammatoria in corso di nefropatie croniche

Uric acid is a major inducer of inflammation in renal interstitium and may play a role in the progression of renal damage in hyperuricemic subjects with primary nephropathies, renal vascular disease, and essential hypertension. At the same time, UA also acts as a water-soluble scavenger of reactive oxygen species. We evaluated the cellular effects of UA on cultured HMC as a potential interstitial target for abnormally elevated levels in acute and chronic renal disease. Intracellular free Ca2+ ([Ca2+]i) was monitored by microfluorometry of fura 2-loaded cells, while oxidation of intracellularly trapped non-fluorescent 2’,7’-dichlorofluorescein diacetate (DCFHDA, 20 uM) was employed to assess the generation of reactive oxygen species during 12-hr incubations with various concentrations of UA or monosodium urate. Fluorescent metabolites of DCFH-DA in the culture media of HMC were detected at 485/530 nm excitation/emission wavelengths, respectively. UA dose-dependently lowered resting [Ca2+]i (from 102±9 nM to 95±3, 57±2, 48±6 nM at 1-100 uM UA, respectively, p <0.05), leaving responses to vasoconstrictors such as angiotensin II unaffected. The effect was not due to Ca2+/H+ exchange upon acidification of the bathing media, as acetate, glutamate, lactate and other organic acids rather increased [Ca2+]i (to max. levels of 497±42 nM with 0.1 mM acetate). The decrease of [Ca2+]i was abolished by raising extracellular Ca2+ and not due to effects on Ca2+ channels or activation of Ca2+-ATPases, since unaffected by thapsigargin. The process rather appeared sensitive to removal of extracellular Na+ in combination with blockers of Na+/Ca2+ exchange, such as 2’,4’-dichlorobenzamil, pointing to a countertransport mechanism. UA dose-dependently prompted the extracellular release of oxidised DCFH (control 37±2 relative fluorescence units (RFU)/ml, 0.1uM 47±2, 1 uM 48±2, 10 uM 51±4, 0.1 mM 53±4; positive control, 10 uM sodium nitroprusside 92±5 RFU/ml, p<0.01). In summary, UA interferes with Ca2+ transport in cultured HMC, triggering oxidative stress which may initiate a sequence of events leading to interstitial injury and possibly amplifying renal vascular damage and/or the progression of chronic disease.

Application of FTIR microscopy to cultural heritage materials

Research in art conservation has been developed from the early 1950s, giving a significant contribution to the conservation-restoration of cultural heritage artefacts. In fact, only through a profound knowledge about the nature and conditions of constituent materials, suitable decisions on the conservation and restoration measures can thus be adopted and preservation practices enhanced. The study of ancient artworks is particularly challenging as they can be considered as heterogeneous and multilayered systems where numerous interactions between the different components as well as degradation and ageing phenomena take place. However, difficulties to physically separate the different layers due to their thickness (1-200 µm) can result in the inaccurate attribution of the identified compounds to a specific layer. Therefore, details can only be analysed when the sample preparation method leaves the layer structure intact, as for example the preparation of embedding cross sections in synthetic resins. Hence, spatially resolved analytical techniques are required not only to exactly characterize the nature of the compounds but also to obtain precise chemical and physical information about ongoing changes. This thesis focuses on the application of FTIR microspectroscopic techniques for cultural heritage materials. The first section is aimed at introducing the use of FTIR microscopy in conservation science with a particular attention to the sampling criteria and sample preparation methods. The second section is aimed at evaluating and validating the use of different FTIR microscopic analytical methods applied to the study of different art conservation issues which may be encountered dealing with cultural heritage artefacts: the characterisation of the artistic execution technique (chapter II-1), the studies on degradation phenomena (chapter II-2) and finally the evaluation of protective treatments (chapter II-3). The third and last section is divided into three chapters which underline recent developments in FTIR spectroscopy for the characterisation of paint cross sections and in particular thin organic layers: a newly developed preparation method with embedding systems in infrared transparent salts (chapter III-1), the new opportunities offered by macro-ATR imaging spectroscopy (chapter III-2) and the possibilities achieved with the different FTIR microspectroscopic techniques nowadays available (chapter III-3). In chapter II-1, FTIR microspectroscopy as molecular analysis, is presented in an integrated approach with other analytical techniques. The proposed sequence is optimized in function of the limited quantity of sample available and this methodology permits to identify the painting materials and characterise the adopted execution technique and state of conservation. Chapter II-2 describes the characterisation of the degradation products with FTIR microscopy since the investigation on the ageing processes encountered in old artefacts represents one of the most important issues in conservation research. Metal carboxylates resulting from the interaction between pigments and binding media are characterized using synthesised metal palmitates and their production is detected on copper-, zinc-, manganese- and lead- (associated with lead carbonate) based pigments dispersed either in oil or egg tempera. Moreover, significant effects seem to be obtained with iron and cobalt (acceleration of the triglycerides hydrolysis). For the first time on sienna and umber paints, manganese carboxylates are also observed. Finally in chapter II-3, FTIR microscopy is combined with further elemental analyses to characterise and estimate the performances and stability of newly developed treatments, which should better fit conservation-restoration problems. In the second part, in chapter III-1, an innovative embedding system in potassium bromide is reported focusing on the characterisation and localisation of organic substances in cross sections. Not only the identification but also the distribution of proteinaceous, lipidic or resinaceous materials, are evidenced directly on different paint cross sections, especially in thin layers of the order of 10 µm. Chapter III-2 describes the use of a conventional diamond ATR accessory coupled with a focal plane array to obtain chemical images of multi-layered paint cross sections. A rapid and simple identification of the different compounds is achieved without the use of any infrared microscope objectives. Finally, the latest FTIR techniques available are highlighted in chapter III-3 in a comparative study for the characterisation of paint cross sections. Results in terms of spatial resolution, data quality and chemical information obtained are presented and in particular, a new FTIR microscope equipped with a linear array detector, which permits reducing the spatial resolution limit to approximately 5 µm, provides very promising results and may represent a good alternative to either mapping or imaging systems.

Il coniglio come modello sperimentale per lo studio degli effetti neurologici indotti da Cobalto

Sono stati studiati gli effetti tossici dell’esposizione cronica a cobalto e cromo. In passato, questa tossicità, che colpiva lavoratori esposti per ragioni occupazionali, è stata un problema molto sentito. Tuttavia, recenti pubblicazioni hanno descritto una specifica tossicità mediata da elevati livelli di cobalto e cromo, anche in pazienti portatori di protesi metalliche, quali gli impianti d’anca. Anche se sintomi clinici tra cui, cecità, sordità e neuropatia periferica, suggeriscono uno specifico neurotropismo, ancora poco è conosciuto delle basi neuropatologiche di questo processo ed oltretutto non ne è ancora stata apportata un’evidenza sperimentale. In questo progetto di ricerca, quindi, si è voluto approfondire il meccanismo patogenetico da cui scaturiscono tali sintomi neurologici, utilizzando come modello sperimentale il coniglio. Conigli New Zealand White sono stati trattati con dosi endovenose ripetute di cobalto e cromo, inoculati singolarmente od in associazione tra loro. Nessuna evidente alterazione clinica o patologica è stata associata alla somministrazione di solo cromo, nonostante gli elevati livelli in sangue e tessuti, mentre i trattati con cobalto-cromo o solo cobalto hanno mostrato segni clinici gravanti sul sistema vestibolo-cocleare; il cobalto, quindi, è stato identificato come il maggiore elemento scatenante neurotossicità. Inoltre all’esame istopatologico gli animali hanno mostrato severa deplezione delle cellule gangliari retiniche e cocleari, assieme a danno al nervo ottico e perdita di cellule sensitive capellute dell’orecchio. È risultato infine evidente che la gravità delle alterazioni è stata correlata al dosaggio ed al tempo di esposizione; dati questi che confermano, quindi, le precedenti osservazioni fatte su pazienti umani esposti a rilascio abnorme di cobalto e cromo da usura di protesi d’anca. È stato ipotizzato che il cobalto agisca sui mitocondri provocando l’incremento di produzione di specie reattive dell’ossigeno e il rilascio di fattori proapoptotici, causando sulle cellule neuronali un danno proporzionale al loro fabbisogno energetico e grado di mielinizzazione.

Studio delle proprietà oncotiche e non incotiche dell'albumina nel paziente con cirrosi epatica e ascite

L’albumina umana (HA) è usata per le sue proprietà oncotiche per ricostituire il volume circolante in pazienti critici e nella cirrosi epatica avanzata. Tuttavia, l’albumina non è solo semplice espansore plasmatico, ma è provvista anche di proprietà non oncotiche, quali, la capacità di legare e trasportare molecole insolubili in acqua, come metalli e farmaci, il suo potere antiossidante e di detossificazione di sostanze sia endogene che esogene. Il nostro studio, è stato progettato da un lato per dimostrare che il trattamento in cronico con albumina umana nei pazienti cirrotici con ascite è in grado di ridurre l’incidenza di ascite refrattaria, delle complicanze legate all’uso dei diuretici e la ricorrenza delle ospedalizzazioni (studio randomizzato), dall’altro per determinare se le alterazioni delle proprietà non oncotiche dell’albumina, possono rappresentare degli indicatori di un aumentato rischio di complicanze cliniche e di una prognosi sfavorevole di questi pazienti (studio di coorte). METODI Studio multicentrico, prospettico, randomizzato, in 440 pts cirrotici con ascite: due bracci di trattamento: t. medica standard vs t. medica standard + albumina; Studio di coorte con 110 cirrotici vs 50 individui sani, valutati mediante -analisi proteomica per individuare con le modifiche post-trascrizionali; - Cobalt Binding Albumina (ACB) per quantificare la quota di albumina modificata dall’ischemia e IMA-Ratio. RISULTATI Studio randomizzato: non è possibile trarre conclusioni, ma emerge un dato incoraggiante, cioè i pazienti del braccio standard hanno una maggiore tendenza a chiudere lo studio per tre paracentesi / mese; Studio Coorte:-IMA e IMA-R sono aumentati in cirrosi, ma non associate a complicanze della cirrosi, l'infezione batterica è associata ad un aumento IMA e IMA-R in cirrosi. CONCLUSIONE: Lo studio randomizzato è in corso ma i dati preliminari sono incoraggianti. Lo studio coorte, ha dimostrato che la cirrosi è associata da alterazioni post-trascrizionali che coinvolgono il N-terminale ed i siti di legame Cys-34.

Valutazione del rilascio ionico in pazienti portatori di protesi di rivestimento d'anca BHR: confronto a lungo termine con artroplastica totale d'anca metallo-metallo

Lo scopo di questo studio è stato quello di determinare se a lungo termine le concentrazioni sieriche di ioni nei pazienti con protesi di rivestimento d’anca metallo-metallo (MOM-HR, metal-on-metal hip resurfacing) fossero differenti da quelle valutate nei pazienti con protesi totale d’anca metallo-metallo e testa del diametro di 28 mm (MOM-THA, metal-on-metal total hip arthroplasty); inoltre è stato valutato se le concentrazioni ioniche fossero al di sopra dei valori di riferimento e se fosse possibile stabilire l’esistenza di una relazione tra sesso e concentrazioni di ioni con riferimento al tipo di impianto. Il gruppo MOM-HR era costituito da 25 pazienti mentre il gruppo MOM-THA era di 16 pazienti. Per poter ricavare i valori di riferimento sono stati reclutati 48 donatori sani. La misurazione delle concentrazioni degli ioni cobalto (Co), cromo (Cr), nickel (Ni) e molibdeno (Mo) è stata effettuata utilizzando la spettrofotometria ad assorbimento atomico su fornace di grafite. A parte il Ni, le concentrazioni di ioni nei pazienti con MOM-HR erano più elevate rispetto ai controlli. Il rilascio di ioni Cr e Co nei pazienti con MOM-HR è risultato superiore rispetto ai soggetti con MOM-THA. Da un’analisi basata sul sesso, è emerso che nelle femmine con MOM-HR i livelli di ioni Cr e Co sono risultati significativamente aumentati rispetto alle femmine con MOM-THA. Indipendentemente dal tipo di impianto, gli accoppiamenti metallo-metallo (MOM) producono concentrazioni di ioni metallici significativamente più alte a follow-up a lungo termine rispetto a quelle osservate nei soggetti sani. Un fattore che deve essere attentamente considerato nella scelta dell’impianto, e in particolar modo nei soggetti giovani, è il cospicuo rilascio di ioni Cr e Co nella popolazione femminile con MOM-HR.