Bifidobacterium - Human Host Interaction: Role of Human Plasminogen

Bifidobacterium is an important genus of the human gastrointestinal microbiota, affecting several host physiological features. Despite the numerous Bifidobacterium related health-promoting activities, there is still a dearth of information about the molecular mechanisms at the basis of the interaction between this microorganism and the host. Bacterial surface associated proteins may play an important role in this interaction because of their ability to intervene with host molecules, as recently reported for the host protein plasminogen. Plasminogen is the zymogen of the trypsin-like serine protease plasmin, an enzyme with a broad substrate specificity. Aim of this thesis is to deepen the knowledge about the interaction between Bifidobacterium and the human plasminogen system and its role in the Bifidobacterium-host interaction process. As a bifidobacterial model, B. animalis subsp. lactis BI07 has been used because of its large usage in dairy and pharmaceutical preparations. We started from the molecular characterization of the interaction between plasminogen and one bifidobacterial plasminogen receptor, DnaK, a cell wall protein showing high affinity for plasminogen, and went on with the study of the impact of intestinal environmental factors, such as bile salts and inflammation, on the plasminogen-mediated Bifidobacterium-host interaction. According to our in vitro findings, by enhancing the activation of the bifidobacterial bound plasminogen to plasmin, the host inflammatory response results in the decrease of the bifidobacterial adhesion to the host enterocytes, favouring bacterial migration to the luminal compartment. Conversely, in the absence of inflammation, plasminogen acts as a molecular bridge between host enterocytes and bifidobacteria, enhancing Bifidobacterium adhesion. Furthermore, adaptation to physiological concentrations of bile salts enhances the capability of this microorganism to interact with the host plasminogen system. The host plasminogen system thus represents an important and flexible tool used by bifidobacteria in the cross-talk with the host.

Cell-free cryopreserved arterial allografts from multiorgan donors: a new strategy to fabricate artificial blood vessels suited for peripheral vascular surgery

Critical lower limb ischemia is a severe disease. A common approach is infrainguinal bypass. Synthetic vascular prosthesis, are good conduits in high-flow low-resistance conditions but have difficulty in their performance as small diameter vessel grafts. A new approach is the use of native decellularized vascular tissues. Cell-free vessels are expected to have improved biocompatibility when compared to synthetic and are optimal natural 3D matrix templates for driving stem cell growth and tissue assembly in vivo. Decellularization of tissues represent a promising field for regenerative medicine, with the aim to develop a methodology to obtain small-diameter allografts to be used as a natural scaffold suited for in vivo cell growth and pseudo-tissue assembly, eliminating failure caused from immune response activation. Material and methods. Umbilical cord-derived mesenchymal cells isolated from human umbilical cord tissue were expanded in advanced DMEM. Immunofluorescence and molecular characterization revealed a stem cell profile. A non-enzymatic protocol, that associate hypotonic shock and low-concentration ionic detergent, was used to decellularize vessel segments. Cells were seeded cell-free scaffolds using a compound of fibrin and thrombin and incubated in DMEM, after 4 days of static culture they were placed for 2 weeks in a flow-bioreactor, mimicking the cardiovascular pulsatile flow. After dynamic culture, samples were processed for histological, biochemical and ultrastructural analysis. Discussion. Histology showed that the dynamic culture cells initiate to penetrate the extracellular matrix scaffold and to produce components of the ECM, as collagen fibres. Sirius Red staining showed layers of immature collagen type III and ultrastructural analysis revealed 30 nm thick collagen fibres, presumably corresponding to the immature collagen. These data confirm the ability of cord-derived cells to adhere and penetrate a natural decellularized tissue and to start to assembly into new tissue. This achievement makes natural 3D matrix templates prospectively valuable candidates for clinical bypass procedures

Epidemiologia e caratterizzazione molecolare di virus emergenti responsabili di Zoonosi: Calcivirus e Virus dell'Epatite E

Il virus dell’Epatite E (HEV) e i calicivirus (norovirus e sapovirus) causano rispettivamente epatite acuta e gastroenterite. Questi virus sono considerati agenti eziologici emergenti rappresentando un problema di sanità pubblica e di sicurezza alimentare. Per HEV, è ormai confermata la trasmissione zoonotica, e il suino è considerato il principale serbatoio asintomatico. Norovirus e sapovirus infettano sia i bambini che gli adulti. Sebbene questi virus siano stati identificati anche negli animali, la possibile trasmissione zoonotica non è stata dimostrata in modo conclusivo. Il lavoro sperimentale condotto durante il Dottorato di Ricerca è stato focalizzato sullo studio degli aspetti biologici ed epidemiologici dell’infezioni causate da HEV e da calicivirus. Per la prima volta in Italia, i risultati ottenuti hanno dimostrato la presenza del virus HEV nei fegati di suini in fase di macellazione ed hanno confermato, attraverso la ricerca di anticorpi, un’elevata esposizione degli animali al virus. Inoltre, mediante la produzione di antigeni e reattivi immunologici, sono stati messi a punto test diagnostici per la ricerca di anticorpi contro HEV nel suino e nei cinghiali. Il lavoro svolto per la ricerca di calicivirus nel suino e nel bovino ha dimostrato la circolazione dei sapovirus in popolazioni di suini asintomatici e la presenza di norovirus nei vitelli affetti da diarrea acuta.Sono stati inoltre sviluppati reattivi immunologici, utilizzando proteine del capside di norovirus umano e bovino espresse con il sistema ricombinante baculovirus. Questi hanno permesso di evidenziare la presenza di anticorpi contro norovirus umano e bovino, in sieri di veterinari professionalmente esposti. Inoltre, sono stati utilizzati per sviluppare metodi per la concentrazione dei virus da matrici a bassa concentrazione.Infine, le VLP sono state utilizzate per valutare l’attivazione del sistema immunitario umano ex vivo. I risultati hanno dimostrato che le VLP di NoV stimolano il sistema immunitario attivando risposte di tipo Th1 e Th2 .

Caratterizzazione citogenetico-molecolare alla diagnosi di pazienti con leucemia mieloide cronica in fase cronica trattati con inibitori delle tirosinchinasi: ruolo prognostico.

L’applicazione della citogenetica convenzionale e molecolare può identificare: Ph-negatività, traslocazioni t(9;22) varianti e alterazioni citogenetiche addizionali (ACA) al cromsoma Ph in pazienti con LMC alla diagnosi. Prima dell’introduzione della terapia con Imatinib, esse mostravano un impatto prognostico negativo o non chiaro. Nel nostro studio, 6 casi di LMC Ph- erano trattati con Imatinib. La FISH identificava 4 casi con riarrangiamento BCR/ABL sul der(9q), 1 sul der(22q) e 1 su entrambi i derivativi. Quattro pazienti (66,7%) raggiungevano la RCgC, 2 fallivano il trattamento e 1 sottoposto a TMO. A causa dello scarso numero di casi, non era possibile nessuna correlazione con la prognosi. Nell’ambito di studi prospettici multicentrici del GIMEMA-WP, abbiamo valutato: traslocazioni varianti e ACA. Dei 559 pazienti arruolati, 30(5%) mostravano traslocazioni varianti, 24 valutabili in FISH: 18(75%) mostravano meccanismo 1-step, 4(16,7%) meccanismo 2-step e 2(8,3%) meccanismo complesso. Abbiamo confermato che le varianti non influenzano la risposta e la sopravvivenza dei pazienti trattati con Imatinib. Dei 378 pazienti valutabili alla diagnosi con citogenetica convenzionale, 21(5,6%) mostravano ACA: 9(43%) avevano la perdita del cromosoma Y, 3(14%) trisomia 8, 2(10%) trisomia 19, 6(28%) altre singole anomalie e 1 cariotipo complesso. La presenza di ACA influenzava la risposta: le RCgC e RMolM erano significativamente più basse rispetto al gruppo senza ACA e le curve di sopravvivenza EFS e FFS non erano significativamente diverse. Le curve di PFS e OS erano sovrapponibili nei due gruppi, per il basso numero di eventi avversi oppure perché alcuni raggiungevano la risposta con TKI di seconda generazione. Le anomalie “major route” mostravano decorso clinico peggiore, ma non è stato possibile determinare l’impatto prognostico in relazione al tipo di alterazione. Pertanto, le ACAs alla diagnosi rivestono un ruolo negativo nella prognosi dei pazienti trattati con Imatinib, che quindi rappresentano una categoria più a rischio per la risposta.

Studio di caratteri correlati a stress idrico in una collezione di cultivar di frumento duro (Triticum durum Desf.)

L’agricoltura si trova ad affrontare una diminuzione della disponibilità d’acqua ed una crescente domanda della produzione di cereali per scopi alimentari. Sono perciò necessarie strategie di coltivazione innovative per migliorare la produttività e nuovi genotipi migliorati nell'efficienza dell’uso delle risorse in condizioni di siccità. Questi rappresentano gli obietti principali del progetto “DROPS” (Drought tolerant yielding Plants) all’interno del quale ha avuto luogo il mio progetto di Dottorato. La mia attività di ricerca è stata svolta come segue: 1. Caratterizzazione molecolare di un panel di188 accessioni di frumento duro con marcatori SSR e DaRT; 2. Esperimenti in serra su 100 accessioni del panel per valutare la Water-Use Efficiency (WUE) in sei repliche secondo un Alpha Lattice design; 3. Prove sul campo, effettuate secondo un Alpha Lattice design, in due stagioni di crescita: a. 2010/11, valutazione di 100 accessioni presso l’Azienda sperimentale dell'Università di Cadriano (BO); b. 2011/12, valutazione del panel completo in 3 ambienti, con due diversi regimi irrigui In entrambi gli anni, abbiamo valutato caratteri agronomici correlati con il ciclo di sviluppo, la resa di granella e sue componenti, nonché diversi fattori ambientali e del suolo. Per quanto riguarda WUE, abbiamo trovato differenze altamente significative tra accessioni; inoltre, cinque accessioni hanno mostrato elevati valori di WUE e cinque accessioni valori molto bassi di WUE in tutte e sei le repliche. Gli esperimenti di campo nelle stagioni 2011 e 2012 hanno evidenziato differenze altamente significative tra le accessioni del panel per la maggior parte dei caratteri analizzati, confermando inoltre che il panel di fiorisce entro una settimana. L'esperimento del secondo anno ci ha permesso osservare un significativa interazione Genotipo X Ambiente. Questi risultati saranno integrati con ulteriori analisi QTL, per identificare regioni cromosomiche coinvolte nel controllo genetico dei caratteri di interesse e verificare la stabilità dei QTL in diversi ambienti.

Caratterizzazione biomolecolare delle neoplasie lipomatose

Tra i liposarcomi, il tumore lipomatoso atipico/liposarcoma ben differenziato e il liposarcoma dedifferenziato rappresentano i sottotipi più frequenti. Spesso è difficile distinguere questi tumori da altri con caratteristiche morfologiche simili. Da un punto di vista citogenetico sono caratterizzati dalla presenza di cromosomi soprannumerari giganti e cromosomi ad anello costituiti principalmente da sequenze amplificate della regione 12q13-15. In questa regione mappano numerosi geni tra cui il gene MDM2 (murine double minute-2). La caratterizzazione molecolare di tali sottotipi diventa estremamente importante sia a fini diagnostici sia per un corretto indirizzo terapeutico, soprattutto oggi, dopo l’introduzione nella pratica clinica di terapie biologiche mirate (targeted therapies). Nel presente studio viene analizzato il ruolo dell’analisi FISH per la valutazione dello status di MDM2 nelle neoplasie lipomatose e per stabilire se questo marcatore possa essere utilizzato nella diagnosi differenziale di questi tumori. Sebbene questo studio confermi l’utilità diagnostica dell’amplificazione di MDM2 nella diagnosi del tumore lipomatoso atipico/liposarcoma ben differenziato ed il liposarcoma dedifferenziato, questo marcatore potrebbe avere in futuro anche una più ampia applicazione. Data la recente introduzione degli inibitori selettivi di MDM2 tale ricerca risulta importante non solo a fini diagnostici ma anche per la selezione dei pazienti che potranno in futuro beneficiare del trattamento con tali inibitori. Questo studio è stato effettuato anche per analizzare la rilevanza biologica del percorso che vede coinvolto il gene AKT nel liposarcoma ben differenziato e dedifferenziato e per stabilire se questo percorso possa rappresentare un utile bersaglio terapeutico in questi tumori. I dati ottenuti dimostrano che AKT è espresso ed attivato in tutti i casi di tumore lipomatoso atipico/liposarcoma ben differenziato e liposarcoma dedifferenziato.

Microbial ecology of biotechnological processes

The investigation of phylogenetic diversity and functionality of complex microbial communities in relation to changes in the environmental conditions represents a major challenge of microbial ecology research. Nowadays, particular attention is paid to microbial communities occurring at environmental sites contaminated by recalcitrant and toxic organic compounds. Extended research has evidenced that such communities evolve some metabolic abilities leading to the partial degradation or complete mineralization of the contaminants. Determination of such biodegradation potential can be the starting point for the development of cost effective biotechnological processes for the bioremediation of contaminated matrices. This work showed how metagenomics-based microbial ecology investigations supported the choice or the development of three different bioremediation strategies. First, PCR-DGGE and PCR-cloning approaches served the molecular characterization of microbial communities enriched through sequential development stages of an aerobic cometabolic process for the treatment of groundwater contaminated by chlorinated aliphatic hydrocarbons inside an immobilized-biomass packed bed bioreactor (PBR). In this case the analyses revealed homogeneous growth and structure of immobilized communities throughout the PBR and the occurrence of dominant microbial phylotypes of the genera Rhodococcus, Comamonas and Acidovorax, which probably drive the biodegradation process. The same molecular approaches were employed to characterize sludge microbial communities selected and enriched during the treatment of municipal wastewater coupled with the production of polyhydroxyalkanoates (PHA). Known PHA-accumulating microorganisms identified were affiliated with the genera Zooglea, Acidovorax and Hydrogenophaga. Finally, the molecular investigation concerned communities of polycyclic aromatic hydrocarbon (PAH) contaminated soil subjected to rhizoremediation with willow roots or fertilization-based treatments. The metabolic ability to biodegrade naphthalene, as a representative model for PAH, was assessed by means of stable isotope probing in combination with high-throughput sequencing analysis. The phylogenetic diversity of microbial populations able to derive carbon from naphthalene was evaluated as a function of the type of treatment.

Caratterizzazione bio-molecolar e ruolo di specie di Fusarium associate alla Fusariosi della spiga su frumento duro

La Fusariosi della spiga (FDS) è una fitopatia diffusa a livello mondiale che colpisce le colture cerealicole, tra cui il frumento duro, ed è in grado di causare gravi danni di tipo qualitativo ed economico. Le specie fungine responsabili appartengono al genere Fusarium, tra cui F. graminearum, F. culmorum e più recentemente F. poae. La conseguenza più rilevante riguarda la contaminazione della granella da micotossine, molecole prodotte dai miceti, considerate dalla comunità scientifica ad alto rischio per la salute dell’uomo e animali. L’eziologia è molto complessa, dal momento che su una stessa spiga di frumento possono coesistere più specie fungine che contribuiscono ad influenzare i quantitativi di micotossine prodotte. Lo scopo della ricerca è incentrato sulla caratterizzazione di ceppi di F. poae, in termini di potenziale patogeno e aggressività. Tramite l’allestimento di un saggio di inoculazione in vitro “Petri-dish” è stato possibile attribuire un indice di aggressività a ciascun isolato fungino, basato su parametri quali AUHPC e AUDPC standard, insieme ad altre variabili come la riduzione della lunghezza del coleottile e del tasso di germinazione. Il saggio è stato esteso anche a F. culmorum, per valutare la riproducibilità del test su altre specie fungine. Il test in vitro offre diversi vantaggi, tra cui affidabilità e rapidità di esecuzione ed è quindi adatto allo screening di ceppi patogeni da utilizzare in successive sperimentazioni. Gli stessi ceppi di F. poae, provenienti da una prova di inoculazione artificiale in serra su piante di frumento duro, sono stati caratterizzati dal punto di vista bio-molecolare. Poichè lo studio della fusariosi della spiga richiede la determinazione quantitativa della biomassa dei patogeni nei tessuti della pianta-ospite, anche in assenza di sintomi, il protocollo di Real-Time PCR con chimica SYBR® Green I qui sviluppato, ha dimostrato essere un buon compromesso tra attendibilità, rapidità e costi complessivi della metodica.

Characterization of new molecular targets involved in iodide flux in the thyroid gland: the anoctamins

Iodide transport is necessary for the synthesis of thyroid hormones following accumulation in the follicular lumen out of thyroid cells, via channels unknown with the exception of pendrin. According to our hypothesis, TMEM16A could be the main molecular identity of the channel mediating iodide efflux in the thyroid gland. TMEM16A is the prior candidate for calcium-activated chloride conductance (CaCC). TMEM16A belongs to the TMEM16/anoctamin family comprising ten members (TMEM16A-K). Higher affinity of TMEM16A for iodide and predicted expression in the thyroid gland suggest its mediation of iodide efflux. The aim of this project was to identify the role of TMEM16A in iodide transport in the thyroid gland, by characterizing its molecular expression and functional properties. We demonstrated that TMEM16F, H, K transcripts are expressed in FRTL-5 thyroid cells, as well as TMEM16A, which is TSH-independent. Tumor tissue from human thyroid maintains TMEM16A expression. Functional in vivo experiments in FRTL-5, stably expressing YFP-H148Q/I152L fluorescent protein as a biosensor, showed that iodide efflux is stimulated by agonists of purinergic receptors with an order of potency of ATP>UTP>ADP (compatible with an involvement of P2Y purinergic receptors), and by agonists of adrenergic receptors (epinephrine, norepinephrine and phenylephrine). Iodide efflux was blocked by α-receptor antagonists prazosin and phentolamine, consistent with a role of α1 adrenergic receptors. Iodide efflux was specifically dependent on calcium mobilized from intracellular compartments and induced by the calcium ionophore ionomycin. CaCC blockers suppressed ionomycin-/ATP-/epinephrine-stimulated iodide efflux. Heterologous expression of TMEM16A in CHO K1 cells induced calcium-activated iodide fluxes. All these results support the hypothesis of the involvement of TMEM16A in calcium-dependent iodide efflux induced by receptor agonists in thyroid cells. TMEM16A may represent a new pharmacological target for thyroid cancer therapy, since its blockade may enhance the retention of radioiodide by tumour cells enhancing the efficacy of radioablative therapy.

Molecular and functional characterization of the chemotactic genes in the PCBs-degrader Pseudomonas pseudoalcaligenes KF707

Although bacteria represent the simplest form of life on Earth, they have a great impact on all living beings. For example the degrader bacterium Pseudomonas pseudoalcaligenes KF707 is used in bioremediation procedures for the recovery of polluted sites. Indeed, KF707 strain is know for its ability to degrade biphenyl and polychlorinated biphenyls - to which is chemotactically attracted - and to tolerate the oxydative stress due to toxic metal oxyanions such as tellurite and selenite. Moreover, in bioremediation processes, target compounds can be easily accessible to KF707 through biofilm formation. All these considerations suggest that KF707 is such a unique microorganism and this Thesis work has been focused on determining the molecular nature of some of the peculiar physiological traits of this strain. The genome project provided a large set of informations: putative genes involved in the degradation of aromatic and toxic compounds and associated to stress response were identified. Notably, multiple chemotactic operons and cheA genes were also found. Deleted mutants in the cheA genes were constructed and their role in motility, chemotaxis and biofilm formation were assessed and compared to those previously attributed to a cheA1 gene in a KF707 mutant constructed by a mini-Tn5 transposon insertion and which was impaired in motility and biofilm development. The results of this present Thesis work, taken together, were interpreted to suggest that in Pseudomonas pseudoalcaligenes KF707 strain, multiple factors are involved in these networks and they might play different roles depending on the environmental conditions. The ability of KF707 strain to produce signal molecules possibly involved in cell-to-cell communication, was also investigated: lack of a lux-like QS system - which is conversely widely present in Gram negative bacteria – keeps open the question about the actual molecular nature of KF707 quorum sensing mechanism.

Characterization of optical transduction-based molecular systems and nanoparticles for the development of chemical sensors

With the increasing importance that nanotechnologies have in everyday life, it is not difficult to realize that also a single molecule, if properly designed, can be a device able to perform useful functions: such a chemical species is called chemosensor, that is a molecule of abiotic origin that signals the presence of matter or energy. Signal transduction is the mechanism by which an interaction of a sensor with an analyte yields a measurable form of energy. When dealing with the design of a chemosensor, we need to take into account a “communication requirement” between its three component: the receptor unit, responsible for the selective analyte binding, the spacer, which controls the geometry of the system and modulates the electronic interaction between the receptor and the signalling unit, whose physico-chemical properties change upon complexation. A luminescent chemosensor communicates a variation of the physico-chemical properties of the receptor unit with a luminescence output signal. This thesis work consists in the characterization of new molecular and nanoparticle-based system which can be used as sensitive materials for the construction of new optical transduction devices able to provide information about the concentration of analytes in solution. In particular two direction were taken. The first is to continue in the development of new chemosensors, that is the first step for the construction of reliable and efficient devices, and in particular the work will be focused on chemosensors for metal ions for biomedical and environmental applications. The second is to study more efficient and complex organized systems, such as derivatized silica nanoparticles. These system can potentially have higher sensitivity than molecular systems, and present many advantages, like the possibility to be ratiometric, higher Stokes shifts and lower signal-to-noise ratio.