Análise morfológica in vitro da ação de antifúngicos em cepas de Fonsecaea pedrosoi

A cromoblatomicose (CBM) é uma doença causada por implantação transcutânea de várias espécies de fungos melanizados. O estado do Pará é a principal área endêmica do país, sendo Fonsecaea pedrosoi o principal agente etiológico. O tratamento desta doença não é padronizado e diversas formas de intervenção são relatadas na literatura. Por outro lado, os testes de susceptibilidade in vitro aos fármacos antifúngicos podem ajudar na escolha do esquema terapêutico e na identificação de cepas resistentes. Este trabalho tem como objetivo avaliar a susceptibilidade in vitro ao itraconazol (ITZ), ao cetoconazol, (CTZ), ao fluconazol (FCZ) e a terbinafina (TBF) em 20 isolados clínicos de Fonsecaea pedrosoi, bem como as possíveis alterações morfológicas induzidas por ITZ ou TBF na Concentração Inibitória Mínima (CIM) e em altas concentrações. Os testes de susceptibilidade foram conduzidos de acordo com as recomendações do Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, documento M38-A2). As concentrações finais de ITZ, TBF e CTZ em cada teste variaram de 16 a 0.03 μg/mL e de 64 a 0.125 μg/mL para o FCZ. A CIM para cada fármaco utilizado foi obtida após cinco dias de incubação a 30°C, sendo definida como a mínima concentração do fármaco capaz de reduzir em 100% o crescimento visual do fungo quando comparado com o grupo controle. O ITZ demonstrou ser o fármaco mais efetivo in vitro contra conídios de F. pedrosoi (CIM ₉₀= 1μg/mL). A TBF apresentou baixa atividade in vitro, com 70% das cepas apresentando CIM ≥ 0.5 μg/mL. Quando se analisa morfologicamente os conídios tratados com a CIM para ITZ observa-se um aumento no diâmetro celular, a presença de conídios em processo de divisão e formação de pequenas cadeias. Na maior concentração do teste de susceptibilidade (16 μg/mL) observou-se a irregularidade no contorno celular, o desprendimento de material pigmentado da parede celular e a vacuolização. Em 32 μg/mL e 64 μg/mL notou-se a ruptura da parede celular e conídos amorfos. Não foram observadas - em nenhuma das concentrações analisadas - alterações morfológicas significativas induzidas pela TBF. Além disso, a 5-Fluorocitosina (5-FC) e o FCZ não impediram o crescimento dos conídios, mesmo em altas concentrações. No entanto, alterações ultraestruturais foram notadas após tratamento com 5-FC 64 μg/mL. Portanto, sugere-se um comportamento morfológico diferente de conídios frente ao ITZ ou TBF durante os testes de susceptibilidade in vitro. Em síntese, dentre os fármacos estudados, ITZ apresentou a melhor atividade antifúngica in vitro, enquanto a 5-FC somente provocou alterações estruturais em hifas e conídios na mais alta concentração utilizada no estudo.

Avaliação in vitro dos possíveis efeitos citotóxicos, genotóxicos e mutagênicos das drogas antimaláricas artemisinina e artemeter em linfócitos humanos

A artemisinina é uma substância extraída da planta chinesa Artemisia annua L., sendo bastante utilizada na medicina natural como um terapêutico em várias patologias. Já o artemer é uma substância sintetizada a partir da artemisinina. Estas drogas se enquadram em um grupo especial de moléculas denominadas de lactonas sesquiterpênicas sendo amplamente administradas na terapêutica da malária. Embora sejam considerados eficientes anti-maláricos, muito pouco se sabe sobre os efeitos genotóxicos e citotóxicos destes fármacos. Portanto, no presente trabalho, avaliamos os efeitos citotóxicos, genotóxicos e mutagênicos da artemisinina e do artemeter em cultura de linfócitos humanos por meio do ensaio cometa, do teste do micronúcleo e do ensaio de citotoxicidade para detecção de necrose e apoptose por marcação fluorescente diferencial com laranja de acridina/brometo de etídio (LA/BE), respectivamente. Nossos resultados demonstraram um aumento significativo (p<0,05) no índice de dano do DNA avaliado pelo ensaio do cometa, bem como na frequência de micronúcleos em ambas as substâncias testadas. Foi observado também, que apenas a artemisinina induziu um aumento estatisticamente significativo (p<0.05) no número de células necróticas nos linfócitos em 48 h de tratamento. Desta forma, demonstrou-se em nosso trabalho, que estas duas drogas exercem efeitos citotóxicos, genotóxicos e mutagênicos em culturas de linfócitos humanos, nas condições avaliadas. Nossos dados apontam a necessidade de cautela no uso de tais medicamentos, uma vez que efeitos genotóxicos/mutagênicos podem aumentar o risco de carcinogênese.

Avaliação in vitro do efeito genotóxico e neurotóxico da rotenona em populações neuronais de encéfalo de ratos

A doença de Parkinson (DP) é uma doença neurodegenerativa, que afeta principalmente neurônios dopaminérgicos da substância negra que projetam para o estriado. A rotenona, um composto amplamente usado como pesticida, pode estar relacionada a influências ambientais que aumentam o risco do aparecimento da DP. Estudo com análise de danos no DNA, como o ensaio em eletroforese do cometa foi introduzido neste trabalho para uma melhor compreensão de efeitos neurotóxicos da rotenona em modelo experimental da DP. O teste do cometa foi aplicado em neurônios provenientes de culturas mesencefálicas mistas de ratos expostas a diferentes concentrações em dois tempos de exposição, 24 e 48 horas. A média do índice de dano dos cometas mostrou-se, segundo análise estatística, significativamente diferente em relação ao grupo controle em todas as concentrações de rotenona testadas e nas duas durações analisadas. No entanto, na análise comparativa do índice de dano considerando o tempo de exposição para concentrações equivalentes, somente 20 e 30 nano molares demonstraram diferença significativa entre 24 e 48 horas de exposição. Este trabalho demonstrou que, nas condições empregadas, o teste do cometa detectou danos no material genético sem alteração detectável no teste de viabilidade celular pelo MTT (5 nM de rotenona por 24h), sugerindo que alterações genotóxicas podem anteceder alterações de viabilidade celular em neurônios expostos à rotenona. Entretanto, não é possível afirmar se tais alterações possuem caráter irreversível ou não.

Ação do metabólito secundário 5-hidroxi-2-hidroximetil gama-pirona isolado de fungos do gênero Aspergillus sobre monócitos humanos in vitro

O 5-hidroxi-2-hidroximetil-gama-pirona (HMP) é um metabólito secundário sintetizado por algumas espécies de fungos dos gêneros Aspergillus, Penicillium Acetobac-ter. O HMP tem várias aplicações, sendo utilizado como antioxidante, inibidor da tirosinase, agente protetor contra a radiação e antitumoral. Recentemente, foi também demonstrado que esse metabólito atua como ativador de macrófagos. No entanto, o efeito do HMP em mo-nócitos humanos é desconhecido. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos de HMP sobre a viabilidade e diferenciação celular de monócitos do sangue humano in vi-tro. Leucócitos humanos do sangue periférico foram obtidos a partir de bolsas de san-gue doadas pela Fundação Centro de Hemoterapia e Hematologia do Pará (HEMOPA). O isolamento das células foi realizado por meio de gradiente de densidade com Histopaque ®1077. Os monócitos foram tratados durante 24, 48 e 72 horas com 50 e 100 μg / mL de HMP. A análise ultraestrutural dos monócitos tratados revelou que essas células apresen-tam maior espraiamento, elevado número de projeções citoplasmáticas e vacúolos, caracterís-ticas que são frequentemente observadas em células ativadas. A análise da expressão da proteína de superfície específica para macrófago (F4/80) por imunofluorescência, de-monstrou que os monócitos humanos tratados com 50 e 100 μg / mL de HMP por 48 e 72 horas, mostrou um padrão de expressão semelhante ao verificado em macrófagos humanos originados de monócitos tratados com o M-CFS. Os testes de viabilidade utilizados (Método thiazolyl blue, Potencial de membrana mitocondrial, Vermelho Neutro e Azul de Tripan) mostraram que o HMP não tem nenhum efeito citotóxico em monócitos humanos quando tra-tados com 50 e 100 μg/ mL do bioproduto. Estes resultados demonstram um novo papel pa-ra HMP como um agente imunomodulador, induzindo a diferenciação de monócitos em macrófagos.

Produção in vitro de embriões bovinos: uso da glutationa durante o processo de lavagem e capacitação espermática

O objetivo deste trabalho foi verificar o efeito da glutationa (GSH – 0,3mg/mL), no processo de separação, lavagem e capacitação espermática sobre a taxa de produção in vitro de embriões bovinos. O sêmen de um touro foi separado através de gradientes de Percoll e centrifugados duas vezes em meio de fecundação in vitro (lavagem). Espermatozóides foram capacitados in meio de FIV durante 1 h em estufa úmida a 38,5°C e 5% de CO2. Os grupos experimentais foram: Controle (não possui a etapa de lavagem; Grupo 1: sem GSH nas três etapas; Grupo2: GSH somente na capacitação; Grupo3: GSH somente na separação e na lavagem (primeira lavagem); Grupo 4: GSH em todas as etapas. Oócitos provenientes de abatedouro foram maturados in vitro e fertilizados após as preparações feitas no sêmen. Os embriões foram cultivados durante 7 dias com análise da clivagem no 2º dia, taxa de blastocisto e número total de células embrionárias no 7º dia. As taxas de desenvolvimento embrionário foram analisadas pelo qui-quadrado (χ2) e a qualidade embrionária pela ANOVA através do programa Bio Estat 3.0 (AYRES, et al., 2003) com nível de significância de 5%. Não houve diferença estatística efeito do uso da GSH nas diferentes etapas do processo de preparação espermática sobre as taxas de clivagem, blastocisto e eclosão (Grupo Controle: 52, 35 e 50%; Grupo 1: 60, 37 e 44%; Grupo 2: 57, 40 e 50; Grupo 3: 56, 37 e 51%; Grupo 4: 47, 30 e 48%, respectivamente, p>0,05). Também não foi observado diferença estatística quanto ao número de células embrionárias (Grupo Controle: 30,9±21,87, Grupo 1: 57,8±18,26; Grupo 2: 66,2±20,14; Grupo 3: 62,1±22,48; Grupo 4: 76,7±29,28; p>0,05).

Utilização do DELI-teste para avaliação da sensibilidade in vitro do Plasmodium vivax à Cloroquina em condições de campo no município de Tucuruí, Pará

O Estado do Pará é um dos responsáveis pela maioria das notificações de malária na Região Amazônica. Plasmodium vivax é a espécie mais freqüente e a avaliação da sensibilidade do mesmo à cloroquina é essencial para verificar se tal droga mantém sua eficácia. Entretanto, isso não era factível em função da não disponibilidade de metodologia de cultivo de curto prazo e da dificuldade de avaliação da maturação desse parasito. Recentemente, um sistema para cultivo de curto prazo de P. vivax foi introduzido, assim como uma metodologia de mensuração (DELIteste) da maturação/crescimento do parasito baseada na detecção da enzima Lactato Desidrogenase do parasito (pLDH), permitindo estudos de sensibilidade dessa especie plasmodial aos antimaláricos. O objetivo desse trabalho foi então avaliar o desempenho dessa metodologia para avaliar a quimiossensibilidade de P. vivax a cloroquina em condições de campo no município de Tucuruí, no Estado do Para. Foram utilizados 44 pacientes positivos para malária vivax, diagnosticados pelo exame de gota espessa, dos quais, após consentimento, foram coletados 5mL de sangue. Uma suspensão de hemácias de cada paciente, preparada em meio de cultura especial (meios RPMI e Waymouth, soro AB+, hematocrito de 1,8%), foi colocada em cultivo in vitro de curto prazo (48 horas), a 37°C e microaerofilia, frente a uma gama de concentrações (2,34-600ng/mL) de cloroquina. As placas foram então congeladas e, posteriormente, os parasitos foram lisados por congelamento e descongelamento, liberando a pLDH. A mensuração da pLDH foi feita por ELISA-sanduiche (DELI-teste), utilizando como anticorpos de captura os monoclonais 6C9 (anti-pLDH de Plasmodium) e 11D (anti-LDH de P. vivax) e como anticorpo de detecção o monoclonal 19G (anti-pLDH de Plasmodium). Os valores de densidade ótica obtidos permitiram, na maioria dos casos, traçar curvas de sensibilidade a droga e o conseqüente calculo da concentração inibitória de 50% (IC50). Do total de amostras, 53,8% apresentaram melhores curvas com o monoclonal 11D e 46,1% com o monoclonal 6C9. Das 44 amostras, 26 (59,2%) permitiram traçar curvas interpretáveis de sensibilidade a cloroquina. O rendimento de 59% pode ser considerado satisfatório em função da conhecida dificuldade de se cultivar P. vivax in vitro, e das precárias condições de infra-estrutura para realização das culturas. Doze (46,2%) dessas 26 amostras apresentaram IC50 superior ao limiar de 100nM, sendo consideradas resistentes. Esse elevado percentual de amostras com perda e sensibilidade a cloroquina é preocupante e indica que esse tipo de avaliação deve ser continuada e estendida a outras localidades para se ter uma caracterização mais clara dessa situação. O DELIteste é o único capaz de avaliar a resistência in vitro do P. vivax e sua utilização em condições de campo pode contribuir para direcionar estratégias terapêuticas para malária em nosso País.

Atividade antiproliferativa e antineoplásica de flavonóides da espécie Brosimum acutifolium em modelo de glioblastoma in vitro

Dentre os tumores que acometem o sistema nervoso, o glioblastoma multiforme (GBM), destaca-se por seu alto grau de agressividade e baixo prognóstico, apresentando em média uma sobrevida de 15 meses a partir do diagnóstico. O presente estudo objetivou investigar a atividade antiproliferativa e antineoplásica de quatro flavonoides isolados da espécie Brosimum acutifolium (Huber), duas flavanas: 4’-hidroxi-7,8-(2”,2”-dimetilpirano) flavana (BAS-1) e 7,4’-dihidroxi-8,(3,3-dimetilalil)-flavana, (BAS-4); e duas chalconas: 4,2’-dihidroxi-3’,4’-(2”,2”-dimetilpirano)-chalcona (BAS-6) e 4,2’,4’-trihidroxi-3’-(3,3-dimetilalil)-chalcona (BAS-7), em glioblastoma C6 de rato in vitro. Nossos resultados mostraram boa atividade citotóxica para as flavanas (BAS-1, -4) e para a chalcona BAS-7, com IC50 menor que 100 μM em teste de viabilidade pelo MTT, já a chalcona BAS-6, não demonstrou atividade citotóxica nas concentrações testadas. Estes flavonoides mostram ser menos citotóxico para célula não neoplásica (glia), com grau de segurança maior para a BAS-4 e BAS-7, uma vez que apresentaram menor efeito citotóxico à célula não neoplásica e menores índices hemolíticos. A análise de migração celular mostrou que o tratamento com BAS-1, BAS-4 e BAS-7 em baixas concentrações foi efetivo em promover inibição da migração celular. Estes três flavonoides também foram muito promissores em inibir a formação e o crescimento de colônia, além de promover parada no ciclo celular, com substancial aumento na população SubG0 para o tratamento com BAS-1 e BAS-4 com 100 μM. As flavanas BAS-1 e BAS-4 também mostraram maior capacidade de promover a perda na integridade do potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) e aumento para marcação com anexina V, indicativo de que estas drogas promovem morte por apoptose. No entanto a análise por microscopia eletrônica demonstrou marcantemente no tratamento com a BAS-4 a presença de vacúolos autofágicos, sugestivo que o processo de morte neste tratamento ocorre tanto por apoptose quanto autofagia. Com base nestes resultados pode-se concluir que dos flavonoides testados a BAS-1, BAS-4 e BAS-7 possuem potencial como agente antineoplásico na terapia do GBM, sendo a BAS-4 a mais promissora de todas.

Uso da L-arginina nos processos de capacitação espermática e fecundação in vitro de oócitos bovinos

O objetivo deste trabalho foi avaliar o uso da L-arginina nos processos de capacitação espermática e fecundação in vitro (FIV), analisando sua influência no desenvolvimento embrionário, utilizando o sêmen de dois touros (Bos taurus e Bos indicus). No experimento 1, os espermatozóides foram incubados, sem a presença de oócitos, durante 0, 1, 2 e 3 h em meio de FIV adicionado de 0, 1, 10 e 50 mM de L-arginina, sendo analisada a taxa de reação acrossômica. No experimento 2, espermatozóides e oócitos foram incubados em meio de FIV acrescido com as concentrações de L-arginina citadas anteriormente, durante aproximadamente 30 h. Os oócitos bovinos foram maturados in vitro (MIV) e o subsequente cultivo embrionário (CIV) foi realizado sobre monocamada de células da granulosa, em meio SOF, sendo avaliadas as taxas de fecundação (18 hpi), clivagem e blastocisto (2º e 7º dia de cultivo, respectivamente). A dosagem de NO₃ ^-/NO₂ ^- produzido durante a FIV foi realizada através do método colorimétrico de Griess. Para análise estatística dos dados, foi utilizado a ANOVA, com nível de significância de 5%. A Larginina (1 mM), quando adicionada ao meio de capacitação espermática, durante duas horas, aumentou a taxa de reação acrossômica em relação ao controle (31,1±2,78 vs 23,4±2,65) em Bos taurus. A adição de L-arginina (50 mM) ao meio de FIV (experimento 2), tanto em Bos taurus quanto em Bos indicus, diminuiu as taxas de clivagem (78,7±2,17 vs 65,7±9,32; 72,7±3,36 vs 45±7,12; respectivamente) e blastocisto (39,4±3,78 vs 15,2±6,12; 39,4±4,39 vs 16±8,54; respectivamente) em relação ao controle. Sendo assim, observou-se que a L-arginina aumentou a taxa de reação acrossômica em Bos taurus, porém reduziu as taxas de clivagem e blastocistos em ambos os touros, sem influenciar na qualidade do embrião.

Estudo fitoquímico, avaliação da toxicidade oral aguda e da atividade antimalárica in vitro e in vivo das cascas de Parahancornia fasciculata (Poir.) Benoist (Apocynaceae)

Parahancornia fasciculata (Poir.) Benoist (Apocynaceae), também conhecida como Parahancornia amapa (Hub.) Ducke, é uma espécie vegetal empregada popularmente no tratamento da malária, infecções no útero, gastrite, anemia, problemas respiratórios, entre outros. Os objetivos do presente trabalho foram realizar o estudo fitoquímico, avaliar a toxicidade oral aguda e a atividade antimalárica in vitro e in vivo de extratos, frações e substância isolada obtidas a partir de cascas do caule de P. fasciculata. Foram realizados dois tipos de extrações com o pó das cascas de P. fasciculata, por maceração / percolação, com etanol 96°GL e diclorometano, esta última tendo sido realizada a com o pó das cascas alcalinizado com hidróxido de amônio, obtendo-se os extratos secos EEPF e EDAPF, respectivamente. Uma terceira extração foi realizada a partir do EEPF por aquecimento sob refluxo, sucessivamente, com Hex:DCM (1:1), AcOEt:DCM (1:1) e AcOEt. EEPF foi, também, submetido a fracionamento por extrações ácido-base resultando nas frações de neutros (EEPFN) e de alcalóides (EEPFA). A prospecção fitoquímica realizada com o EEPF foi desenvolvida por CCD em cromatoplacas de sílica gel tendo sido detectada a presença de triterpenos, esteróides, heterosídeos flavônicos, saponinas, polifenóis, taninos, heterosídeos antracênicos e heterosídeos cardiotônicos. EDAPF foi submetido à cromatografia em coluna de sílica gel. Foram recolhidas 30 frações sendo que as frações Fr1-3, Fr4, Fr5-7 e Fr11 concentraram a maior parte da massa do extrato cromatografado. Da Fr5-7 foi isolada uma mistura de ésteres do lupeol que representam os componentes majoritários do EDAPF. Esta fração passou por um processo de hidrólise alcalina e o produto obtido (Fr5-7Hid) foi analisado por espectrometrias no IV, RMN de ¹H e ¹³C e foi identificado como o triterpeno lupeol. A fração insolúvel em AcOEt obtida a partir do EEPF, por aquecimento sob refluxo, apresentou resultado positivo para o teste de proantocianidinas e foi submetido a doseamento desta classe de metabólitos. Os resultados foram expressos em porcentagem dos teores para a amostra não diluída (10,46±0,3419%), amostra diluída a 1:10 (9,94± 0,1598%) e amostra diluída a 1:100 (10,55± 0,9299%). A avaliação da atividade antiplasmódica in vitro em culturas de cepas W2 de Plasmodium falciparum foi realizada pelo teste da Proteína II Rica em Histidina (HRP-II) tendo sido testados EEPF, EEPFN, EEPFA, Fr1-3, Fr4, Fr5-7(ésteres do lupeol), Fr11 e o Fr5-7Hid (lupeol). Os melhores resultados obtidos foram para EEPF, EEPFA E EEPFN (CI₅₀= ~ 50 μg/mL) sendo considerados moderadamente ativos. As demais amostras apresentaram CI₅₀ > 50 μg/mL e foram consideradas inativas. Realizou-se também a avaliação da atividade antimalárica in vivo em camundongos fêmeas suíços infectados com cepas ANKA de P. berghei com o EEPF e o EEPF-HEX:DCM (1:1) em concentrações de 500, 250 e 125mg/kg de peso. EEPF foi parcialmente ativo, somente no 8° dia, em todas as concentrações. Já EEPF-HEX:DCM (1:1) foi parcialmente ativo na dose de 500mg/kg de peso e nas demais doses foi inativo. O teste de toxicidade oral aguda foi realizado em camundongos fêmeas suíços, pelo método da dose fixa (5.000mg/kg), com EEPF e não apresentou nenhum sinal de toxicidade evidente, o que foi confirmado pela ausência de alterações nos exames anátomohistopatológicos realizados.

Evaluation of metallic brackets adhesion after the use of bleaching gels with and without amorphous calcium phosphate (ACP): in vitro study

OBJETIVO: avaliar, in vitro, a influência do clareamento dentário com gel contendo fosfato de cálcio amorfo (ACP) na resistência da união adesiva de braquetes metálicos. MÉTODOS: trinta e seis dentes incisivos bovinos foram seccionados no limite coronorradicular e tiveram suas coroas incluídas em cilindros de PVC. Os corpos de prova foram divididos em três grupos (n = 12), de acordo com a realização do tratamento clareador e tipo de gel utilizado, sendo: G1 (controle) - sem clareamento; G2 - clareamento com gel sem ACP (Whiteness Perfect, FGM); G3 - clareamento com gel contendo ACP (Nite White ACP, Discus Dental). Os grupos G2 e G3 foram submetidos a 14 ciclos de clareamento, seguidos de intervalo de espera de 15 dias para a fixação adesiva dos braquetes metálicos. O ensaio mecânico de cisalhamento foi realizado em máquina universal Kratos, com velocidade de 0,5mm/min. Após o teste mecânico, os corpos de prova foram avaliados quanto ao índice de remanescente adesivo (ARI). Os resultados foram submetidos à ANOVA, ao teste de Tukey e ao de Kruskall-Wallis (α = 5%). RESULTADOS: diferenças significativas foram observadas entre os grupos testados. O grupo controle G1 (11,1MPa) mostrou uma resistência ao cisalhamento estatisticamente superior aos grupos submetidos ao clareamento (G2 = 5,40MPa; G3 = 3,73MPa), os quais não diferiram entre si. Não se observou diferença significativa para o ARI entre os grupos estudados. CONCLUSÃO: o clareamento dentário reduz a resistência da união adesiva de braquetes metálicos, enquanto a presença de ACP no gel clareador não influencia os resultados encontrados.