Caracterização molecular dos genes PSO2 e PSO4 de Saccharomyces cerevisiae envolvidos na reparação do DNA : análise funcional e identificação de interações proteína-proteína

O alelo mutante termo-condicionalmente letal pso4-1 do gene PRP19, que codifica uma proteína associada ao spliceossoma, permitiu investigar a influência deste gene no processamento de pré-mRNA, reparação do DNA e esporulação. Fenótipos relacionados a genes portadores de introns foram correlacionados à temperatura. Sistemas repórteres para processamento de pré-mRNA e RT-PCR mostraram que eficiência de processamento de mRNA no mutante pso4-1 é inversamente correlacionada com a temperatura de crescimento. Uma mutação pontual, substituindo uma leucina por uma serina foi identificada dentro da região codificadora N-terminal do alelo Pso4-1 e afeta as propriedades bioquímicas de Pso4-1p. Entre 24 clones isolados utilizando o sistema doishíbridos, 7 foram identificados como partes dos genes RAD2, RLF2 e DBR1. RAD2 codifica uma endonuclease indispensável para a via reparação por excisão de nucleotídeos (NER), RLF2 codifica a subunidade maior do fator de montagem da cromatina I, cuja deleção resulta em sinsibilidade à radiação UVC, enquanto que DBR1 codifica uma enzima que atua sobre substratos de RNA na forma lariat, degradando estruturas lariat em introns durante o processamento de mRNA. A caracterização dos fenótipos após tratamentos com mutágenos em linhagens mutantes simples e duplos de rad2∆, rlf2∆ e pso4-1 mostraram sensibilidade aumentada para para mutantes rad2∆/pso4-1 e rlf2∆/pso4-1, sugerindo uma interferência funcional destas proteínas no processo dereparação do DNA em Saccharomyces cerevisiae. O mecanismo exato de reparação de pontes inter-cadeia (ICL) em S. cerevisiae não é ainda totalmente conhecido. Identificando novos fenótipos e isolando proteínas potencialmente capazes de interagir com Pso2p através da técnica do sistema dois-híbridos, foi possível extender a caracterização deste gene específica para reparação de pontes intercadeia. Tratamentos com acetaldeído (ACA), um metabólito natural da via glicolítica, foi mais tóxico a linhagem mutante pso2 em comparação com a linhagem selvagem e também capaz de induzir a expressão da fusão contendo o promotor de PSO2 à lacZ (PSO2-lacZ) por um fator comparável à tratamentos com outros agentes indutores de ICLs, indicando que o metabólito natural ACA pode causar danos do tipo ICL em S. cerevisiae. A utilização do sistema dois-híbridos permitiu isolar partes de proteínas codificadas por nove diferentes genes, entre eles a proteína quinase Pak1p, um supressor de mutações termosensíveis da DNA Polimerase alfa. Pak1p interage com a extremidade C-terminal conservada de Pso2p, uma região da proteína recentemente nomeada β-CASP entre v ortólogos conhecidos do gene PSO2. A integridade do domínio β-CASP é essencial para a reparaçãode DNA proficiente como demonstrado em ensaios de complementação com mutantes pso2 ∆. Comparação da sobrevivência após tratamento com agentes mutagênicos de simples mutantes pso2 ∆ e pak1 ∆ assim com o dulpo mutante pso2 ∆/pak1 ∆ revelaram que o gene PAK1 é necessário para reparação do DNA proficiente como na linhagem selvagem. A interação epistática dos dois alelos mutantes na linhagem duplo mutante sugere que Pak1p atua na mesma via de reparação a qual PSO2 pertence e que PAK1 constitui um novo locus envolvido na reparação do DNA em S. cerevisiae.

Efeito do glutamato sobre a secreção da proteína S100B em cultura de astrócitos hipocampais

A proteína S100B pertence à família S100 de proteínas ligantes de Ca+2. Sua expressão dá-se primariamente em astrócitos, os quais também secretam esta proteína, exercendo um papel trófico sobre as células vizinhas. A adição de S100B tem promovido a sobrevivência de neurônios em cultura e, recentemente, tem sido proposto um papel protetor da S100B contra a excitoxicidade. Neste trabalho investigamos a liberação de S100B na presença de alta concentração de glutamato. A secreção de S100B em astrócitos de ratos em cultura foi quantificada, pelo método de ELISA, durante 24 horas após uma privação de soro de 30 minutos (condição estimulada) ou não (condição basal). A integridade dos astrócitos foi analisada por ensaios de exclusão de azul de tripan e medida da LDH. Glutamato (1 mM) não teve efeito sobre a secreção basal de S100B, mas diminuiu a liberação 1h depois da privação de soro. A privação de soro que estimulou a liberação de S100B foi dependente de síntese protéica e reduzida por Rp-AMPc e H-89, sugerindo o envolvimento da via AMPc/PKA, possivelmente sobre o elemento sensível ao AMPc no gene de S100B. Além disso, a privação de soro foi acompanhada por um aumento transitório do conteúdo intracelular de AMPc. Nossos resultados sugerem que o proposto papel neurotrófico da S100B, pelo menos em cultura de astrócitos hipocampais, poderia estar prejudicado por altos níveis de glutamato. Não está claro ainda se o efeito do glutamato é medeado por receptores. Na tentativa de investigar o mecanismo envolvido usamos inibidores do transporte de glutamato e agonistas de glutamato. Os resultados indicam que ambos receptores metabotrópicos do Grupo I/II e transportadores de glutamato estão envolvidos no decréscimo da secreção de S100B induzida pelo glutamato.

Efeito de nutrientes energéticos no metabolismo de aminoácidos em células de sertoli em cultura

Estudos previos de nosso laboratório (Monteiro,1999), demonstraram que os aminoácidos além de incorporarem-se às proteínas, também podem ser usados como nutrientes energéticos metabólicos. Grootegoed e Cols.,(1986), mostraram o envolvimento de diferentes substratos e de diferentes caminhos na obtenção de energia em células de Sertoli. Neste trabalho, verificamos a capacidade que diferentes aminoácidos possam ter para a produção de energia em células de Sertoli de ratos de 16-18 dias de idade, investigando a oxidação a CO2, conversão a lipídeos e incorporação a proteínas de alguns aminoácidos, na presença ou ausência de outros nutrientes energéticos, tais como ác. palmítico, glicose e/ou glutamina. No capítulo I do presente trabalho, realizou-se um estudo utilizando os aminoácidos alanina, leucina, glicina, glutamina e valina em cultura de células de Sertoli, na presença ou ausência de nutrientes energéticos tais como: ácido palmítico, glicose e/ou glutamina. Nossos resultados mostraram que a glicina parece ser um pobre substrato energético sendo principalmente incorporada a proteínas e parcialmente convertida à lipídeos. O catabolismo da glicina não é alterado na presença de ácido palmítico, glicose e/ou glutamina. A presença de ác. palmítico não tem efeito no metabolismo dos aminoácidos estudados, no que se refere à oxidação a CO2, conversão a lipídeos e incorporação em proteínas pelas células de Sertoli em cultura. Por outro lado, a presença de glicose parece alterar significativamente a produção de CO2, bem como a síntese de lipídeos e proteínas a partir dos aminoácidos alanina, leucina e valina. A respeito da presença da glutamina, os resultados mostram diminuição na oxidação a CO2 da alanina, leucina e valina nas células de Sertoli, mesmo na presença de glicose, enquanto que a conversão destes aminoácidos a lipídeos não foi alterada. Contudo, quando glutamina e glicose foram adicionadas juntas, somente a conversão a lipídeos a partir da leucina foi aumentada. A glutamina causou uma diminuição na incorporação da alanina em proteínas sem alterar a incorporação da leucina e da valina. Por outro lado, tanto alanina quanto leucina diminuíram a oxidação da glutamina a CO2. No capítulo II estudou-se o efeito conjunto de dois nutrientes energéticos (glicose, glutamina, ácido palmítico e piruvato) no metabolismo dos aminoácidos leucina, glutamina e valina em cultura de células de Sertoli, no que diz respeito à produção de energia, procurando esclarecer aspectos referentes à oxidação a CO2, conversão a lipídeos e incorporação em proteínas. Nossos resultados mostram que a adição do ácido palmítico junto à glicose não alterou o metabolismo da leucina, no que se refere à oxidação a CO2, conversão a lipídeos e incorporação a proteínas. Por outro lado, a presença de glicose e de ác. palmítico diminuiu a oxidação do CO2, não modificando a conversão a lipídeos e incorporação de valina a proteínas. Quanto ao metabolismo da glutamina, tanto a adição de glicose juntamente com ácido palmítico, não modificaram o metabolismo da glutamina na oxidação a CO2, conversão a lipídeos e incorporação a proteínas. Sendo assim, entre os substratos energéticos utilizados neste trabalho, a glutamina foi o mais utilizado pelas células de Sertoli para a obtenção de energia, mesmo na presença de outros nutrientes tais como: glicose, ácido palmítico e piruvato. Por outro lado, entre os nutrientes energéticos o ácido palmítico é o menos proveitoso para a obtenção de energia pelas células de Sertoli.

Estudo da influência da variabilidade em genes de apolipoproteínas sobre níveis lipídicos e parâmetros de massa e gordura corporal na população de Porto Alegre

Apolipoproteínas constituem a parte proteica das lipoproteínas e de uma maneira geral desempenham papéis como proporcionar estabilidade estrutural, solubilizar lipídeos altamente hidrofóbicos, servir como ligantes a receptores ou agir como co-fatores para enzimas envolvidas no metabolismo. Diversos estudos têm mostrado que a variabilidade dos genes que codificam estas proteínas podem influenciar os níveis lipídicos em diversas populações. A variabilidade da apo A-IV também foi associada com variáveis antropométricas. Nesta investigação foram analisados 8 RFLPs nos genes das apolipoproteínas C-I (HpaI), C-II (AvaII), C-III (SacI, FokI e MspI) e A-IV (XbaI, HinfI e PvuII). A amostra foi composta por 391 indivíduos caucasóides de Porto Alegre (RS) e dados sobre hábitos de vida, dosagens lipídicas e medidas antropométricas foram obtidas para cada indivíduo. Os fragmentos de interesse de cada gene foram amplificados por PCR e os genótipos foram identificados por eletroforese em géis de agarose ou poliacrilamida corados com brometo de etídio.

Efeito in vivo e in vitro da prolina sobre a atividade da Na+, K+-ATPase de cérebro de ratos

A hiperprolinemia tipo II é um erro inato do metabolismo de aminoácido causado pela deficiência na atividade da Ä1 pirrolino-5-carboxilato desidrogenase. O bloqueio dessa reação resulta no acúmulo tecidual de prolina. A doença caracteriza-se fundamentalmente por epilepsia, convulsões e um grau variável de retardo mental, cuja etiopatogenia ainda é desconhecida. No tecido nervoso, a Na+, K+ - ATPase controla o ambiente iônico relacionado com a atividade neuronal, regulando o volume celular, o fluxo de íons e o transporte de moléculas ligadas ao transporte de Na+, tais como, aminoácidos, neurotransmissores e glicose. Evidências na literatura mostram que recém nascidos humanos com baixos níveis de Na+, K+ -ATPase cerebral apresentam epilepsia e degeneração espongiforme. Alterações na atividade desta enzima têm sido associadas a várias doenças que afetam o sistema nervoso central, como isquemia cerebral e doença de Parkinson. Considerando que a inibição da Na+, K+ - ATPase por ouabaína tem sido associada com liberação de neurotransmissores, incluindo glutamato, em uma variedade de preparações neuronais, e que alguns autores sugerem que o efeito da prolina sobre a sinapse glutamatérgica possa ser, pelo menos em parte, responsável pelos sintomas neurológicos encontrados nos pacientes com hiperprolinemia, no presente trabalho verificamos efeitos dos modelos experimentais agudo e crônico de hiperprolinemia tipo II sobre a atividade da Na+, K+ - ATPase de membrana plasmática sináptica de córtex cerebral e hipocampo de ratos. No modelo crônico, a prolina foi administrada a ratos Wistar duas vezes ao dia do 6o ao 28o dia de vida, enquanto que no modelo agudo os animais, com 15 dias de vida, receberam uma única injeção de prolina e foram sacrificados 1hora após a administração da droga. Os animais tratados crônicamente com prolina não apresentaram alterações significativas no peso corporal, do encéfalo, do hipocampo e do córtex cerebral, bem como nas quantidades de proteínas do homogenizado cerebral e da membrana plasmática sináptica de córtex cerebral e hipocampo. Nossos resultados mostraram uma diminuição significativa na atividade da Na+, K+ - ATPase de membrana plasmática sináptica de cérebro de animais tratados aguda e crônicamente com prolina. Foram também testados os efeitos in vitro da prolina e do glutamato sobre a atividade da Na+, K+- ATPase. Os resultados mostraram que os dois aminoácidos, nas concentrações de 1,0 e 2,0 mM, inibiram significativamente a atividade da enzima. O estudo da interação cinética entre prolina e glutamato, sugere a existência de um sítio único de ligação na Na+, K+ - ATPase para os dois aminoácidos. É possível que a inibição na atividade da Na+, K+- ATPase possa estar envolvida nos mecanismos pelos quais a prolina é neurotóxica. Acreditamos que nossos resultados possam contribuir, pelo menos em parte, na compreensão da disfunção neurológica encontrada em pacientes com hiperprolinemia tipo II.

Metabolismo da glutationa e atividade ATPase de S-conjugados de glutationa no câncer

Pacientes terminais de câncer apresentam um quadro de caquexia que está associado ao estado de imunossupressão que acompanha esta patologia. Nestes pacientes é possível detectar aumento das taxas de prostaglandinas ciclopentenônicas plasmáticas, as quais são reconhecidamente antiproliferativas. Na presença de câncer ocorre a superprodução destas CP-PGs, que são rapidamente captadas pelas células, tanto do sistema imune quanto do próprio tumor. Porém, esta atividade antiproliferativa é mais significativa nas células do tecido imune, enquanto as células de tecido tumoral seguem seu crescimento, aparentemente sem sofrer os distúrbios de proliferação inferidos pelas CP-PGs. É sabido que estas CP-PGs de anel ciclopentano α,β-insaturado são eletrofílicas, o que permite sua conjugação com substâncias nucleofílicas, como a glutationa (GSH). A presença da ATPase MRP/bomba GS-X, responsável pela extrusão de conjugados de glutationa para o espaço extracelular seria uma explicação razoável para o fato das células tumorais serem resistentes à ação antiproliferativa das CP-PGs. Estas ponderações foram confirmadas, anteriormente, através de estudos in vitro, porém ainda não haviam sido determinadas in vivo. Neste estudo foi investigado o papel da MRP/bomba GS-X em animais normais e portadores do tumor de Walker 256. Verificou-se que os animais com tumor, ao longo de, aproximadamente, 21 dias perderam massa corporal, que se fez acompanhar por um quadro de caquexia. Observou-se que a capacidade de exportação de S-conjugados de GSH através da MRP/bomba GS-X (um indicativo da capacidade de eliminação de CP-PG para o espaço extracelular) foi 21 vezes menor em linfócitos que nas células do tumor de Walker 256. Identificou-se que as taxas de GSH estavam diminuídas nas células do tecido imune mas esta depleção não teve caráter oxidativo, uma vez que estiveram mantidos os níveis de GSSG. Isto sugere que linfócitos devam estar sendo desafiados com alguma substância eletrofílica não oxidante que depleta GSH (por exemplo, uma CP-PG). Não houve diferença entre a atividade da glutationa-S-transferase e da γ-glutamilcisteína sintetase (enzimas responsáveis, respectivamente, pela conjugação e síntese de GSH) entre linfócitos de animais normais e portadores do tumor de Walker 256. Como dado corroborante, foi observada, em linfócitos de animais com tumor, indução da expressão de proteínas de choque térmico (HSP70), as quais são induzidas, entre outros agentes, pelas CP-PGs. Os resultados sugerem que a MRP/bomba GS-X, responsável pela extrusão de conjugados de GSH/CP-PG, tem baixa atividade nos linfócitos o que pode ser uma das causas do quadro de imunossupressão nos estágios terminais de câncer.

Efeitos da mal nutrição protéica sobre o metabolismo da glicina em cerebelo de ratos durante o seu desenvolvimento

Malnutrition is a worldwide problem affecting millions of unborn and young children during the most vulnerable stages of brain development (1). All restriction of protein during the perinatal period of life can alter the development of mammalian fetus and have marked repercussions on development of the Central Nervous System (CNS). The brain is vulnerable to protein malnutrition with altered morphologic and biochemical maturation, leading to impaired functions. The focus of this study is to investigate [U-14C]glycine metabolism in malnourished rats submitted to pre- and postnatal protein deprivation (diet: 8% protein with addition and without addition of L-methionine) on glycine metabolism of rats (normonourished group: 25% protein). It was observed that protein malnutrition alters oxidation to CO2, conversion to lipids and protein synthesis from [U-14C]glycine in cerebellum of malnourished rats without addition of L-methionine on a diet at 7 and 21 days of postnatal life. Our results also indicate that protein malnutrition causes a retardation in the normally ordered progression of brain development, and the malnourished groups have smaller cells, reduction in cell numbers and smaller cerebellar weight comparing to the control group.

Clonagem, caracterização e expressão de cDNAs similares a calreticulina e paramiosina isolados de glândula salivar do carrapato Boophilus microplus (Canestrini, 1887)

O carrapato Boophilus microplus é um dos mais importantes ectoparasitas dos rebanhos bovinos, estando em todas as áreas tropicais e subtropicais entre o paralelo 32 °N e 32 °S, abrangendo regiões que se dedicam à pecuária na América, África, Ásia e Oceania. O controle do carrapato B. microplus é realizado principalmente com o uso de acaricidas, entretanto devido a crescente preocupação com os problemas criados pela poluição química do ambiente, ao alto custo e toxicidade das drogas e ao aparecimento de carrapatos resistentes aos acaricidas, alternativas para o controle do B. microplus devem ser encontradas. A sobrevivência dos carrapatos depende grandemente da sua capacidade de evadir o sistema imunológico dos hospedeiros, portanto antígenos da glândula salivar poderiam ser alvos para intervenção imunoprofilática. Neste trabalho foram isolados cDNAs não previamente descritos correspondentes a antígenos presentes na glândula salivar. cDNAs que codificam para proteínas similares a paramiosina e calreticulina foram seqüenciados, expressos em Escherichia coli e as proteínas recombinantes purificadas, tendo sido produzidos soros policlonais contra as proteínas recombinantes em coelhos. As seqüências foram caracterizadas e alinhamentos múltiplos com outras seqüências foram determinados. O gene da calreticulina mostrou ser expresso em todos os estágios e tecidos testados, tanto em experimentos de RT-PCR quanto de Western blot, tendo sido demonstrado também a sua secreção pela saliva. Análise filogenética indica o agrupamento do gene de B. microplus com seqüências de outros artrópodos. Soros de bovinos infestados não reconhecem a calreticulina recombinante, apesar dela ser reconhecida pelo soro de cães infestados pelo carrapato Rhippicephalus sanguineus. A paramiosina mostrou-se, em ensaios de Western blot, também estar presente em todos os estágios testados, porém não na saliva. A paramiosina recombinante foi capaz de ligar colágeno e IgGs. Ambas as proteínas correspondem a proteínas multi-funcionais possivelmente envolvidas na imunomodulação do hospedeiro, tendo sido sugeridas como imunógenos protetores contra outros parasitas.

Estudo da proteína S100B em pacientes com esquizofrenia

O projeto de pesquisa que deu origem a esta Dissertação de Mestrado foi desenvolvido em caráter colaborativo entre o Departamento de Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Departamento de Psiquiatria e Medicina Legal da Universidade Federal do Rio Grande do Sul e Serviço de Psiquiatria do Hospital de Clínicas de Porto Alegre. O Protocolo deste estudo foi aprovado, em março de 1999 sob o número 99027, pelas Comissões Científica e de Pesquisa e Ética em Saúde, reconhecida pela CONEP como Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital de Clínicas de Porto Alegre.

Estudo sobre o papel da HSP27 na tolerância à isquemia cerebral em um modelo in vivo e em culturas organotípicas de hipocampo de ratos

A HSP27 é um membro da família das proteínas de choque térmico que protege as células contra diversos tipo de estresse, sendo expressa principalmente em astrócitos depois da isquemia. Neste trabalho, nós estudamos o papel da HSP27 na tolerância à isquemia cerebral, usando um modelo in vivo e culturas organotípicas. Foram estudados diferentes tempos de reperfusão in vivo (1, 4, 7, 14, 21, 30 dias) usando 2 min, 10 min ou 2+10 min de isquemia global transitória pela oclusão dos 4 vasos (4VO). Foi observado um aumento no imunoconteúdo no DG depois de todos os tratamentos, com uma diminuição na porcentagem de HSP27 fosforilada. Em CA1, região vulnerável, observou-se um aumento no imunoconteúdo depois de 10 ou 2+10 min de isquemia; em 10 min o aumento de fosforilação foi paralelo ao imunoconteúdo, enquanto com 2+10min de isquemia, quando a região CA1 se tornou resistente, houve uma diminuição na porcentagem de HSP27 fosforilada. Os resultados sugerem que a HSP27 pode estar atuando como chaperona, protegendo outras proteínas da desnaturação nos astrócitos, os quais podem auxiliar os neurônios a sobreviverem por manter a homeostase do tecido. Em culturas organotípicas, foram usados 5 ou 10 min de privação de glicose e oxigênio (OGD) ou 1µM de NMDA para induzir tolerância ao tempo letal, 40 min, de privação de glicose e oxigênio (OGD). Nesse caso, foi observado um aumento no imunoconteúdo de HSP27 depois de todos os tratamentos, mas a porcentagem de HSP27 fosforilada se manteve constante ou aumentou quando o pré-condicionamento ocorreu. A HSP27 pode estar modulando os filamentos de actina ou bloqueando o processo apoptótico, facilitando a sobrevivência das células. Em conjunto, os resultados sugerem que o mecanismo que leva à morte de células pode ser diferente nos dois modelos, exigindo atuações distintas da proteína.

Estudo do potencial carcinogênico de poluentes utilizando simulação molecular

Substâncias carcinogênicas são diariamente lançadas no meio ambiente, tanto na atmosfera quanto em corpos hídricos. Estas são capazes de ligar-se a proteínas constituintes de tecidos vivos produzindo um carcinoma, cuja probabilidade de formação depende da afinidade do poluente com os grupos funcionais presentes nos substratos protéicos. Contudo, os mecanismos pelos quais ocorre a formação do carcinoma não estão totalmente esclarecidos. Alguns modelos baseados em propriedades moleculares foram formulados na tentativa de prever quais serão os mecanismos, compostos intermediários e produtos finais de reação. Porém, esses modelos apresentam sérias limitações por não levarem em conta a dinâmica do processo reativo. Para que se possa estimar os mecanismos, é preciso detectar a formação ou ruptura de ligações ao longo do tempo, o que torna necessário utilizar modelos transientes. O presente trabalho apresenta um modelo que resolve a equação de Schrödinger dependente do tempo para verificar qual o mecanismo de reação entre uma substância carcinogênica e um aminoácido. A simulação do cenário transiente proposto requer um baixo tempo de processamento e possibilita uma fácil interpretação dos resultados obtidos.

Morfologia e citologia das células compartimentadas em Araucaria angustifolia (BERT.)O.KTZE.(ARAUCARIACEAE)

As células compartimentadas do gênero Araucaria Juss. foram primeiramente descritas como células incomuns, caracterizadas pela ocorrência de partições pécticas no lume celular, formando um sistema de compartimentos. Entretanto, várias questões sobre essas células ainda não haviam sido esclarecidas, por isso, o presente trabalho envolveu a observação e descrição dos estádios de desenvolvimento das células compartimentadas nas plantas jovens e adultas da espécie Araucaria angustifolia, sob microscopia óptica e eletrônica, além de elucidar as funções e a dinâmica celular desempenhada pelas mesmas. A diferenciação das células compartimentadas ocorria ainda no ápice caulinar, iniciando quando a célula aumentava de volume (estádio 1). A mucilagem era continuamente secretada, através do Golgi e retículo endoplasmático rugoso, preenchendo o citoplasma e reduzindo o vacúolo (estádio 2). A quantidade citoplasmática se reduzia, praticamente, em torno do núcleo (estádio 3). Finalmente, a célula era totalmente preenchida de mucilagem, constituída por uma rede lamelar, perdendo sua forma poligonal (estádio 4). Núcleo e citoplasma degeneravam. Com base nesses resultados, constatou-se que as células compartimentadas de Araucaria angustifolia eram semelhantes às células de mucilagem de algumas famílias de dicotiledôneas. A função de controle hídrico foi comprovada, baseado, principalmente, nos resultados obtidos pelo traçador apoplástico HPTS (hidroxi-ácido pirenetrissulfônico), que demonstrou a rota de translocação e regulação hídrica na folha. A morte celular programada também mostrou-se evidente com a degeneração do vacúolo, condensação e descromatização do núcleo e degeneração geral do sistema de membranas A utilização de anticorpos monoclonais para determinados epitopos pécticos, são importantes ferramentas nos estudos da dinâmica da parede celular. Ao longo do desenvolvimento das células compartimentadas (células mucilaginosas), havia um gradiente de distribuição com relação a rápida de-esterificação, ao aumento da concentração de galactanos e ligações de cálcio e diminuição nas concentrações de arabinanos e de proteínas arabinogalactanos (AGPs). Alguns resultados mostraram-se diferentes nas células parenquimáticas, justificando as diferenças na elasticidade da parede celular nas células mucilaginosas de Araucaria angustifolia. Observou-se que proteínas arabinogalactanos e pectinas com alto grau de metil-esterificação estavam presentes na mucilagem. A degeneração das AGPs na maturidade das células mucilaginosas, tanto na parede celular, como na mucilagem, poderia estar envolvida no processo de morte celular programada.

Avaliação da função pulmonar e estresse oxidativo em pacientes com insuficiência renal crônica em hemodiálise

A insuficiência renal crônica (IRC) é uma síndrome caracterizada pela perda geralmente progressiva e irreversível da função renal. O tratamento da IRC terminal envolve alguma forma de diálise ou transplante renal. O objetivo deste estudo foi avaliar a repercussão de uma sessão de hemodiálise (HD) na função pulmonar e estresse oxidativo de doentes renais crônicos. Foram estudados 33 pacientes, 17 mulheres e 16 homens com média de idade 42,76 ± 14,25 anos, que realizavam HD na Unidade de Nefrologia do Hospital de Clínicas de Porto Alegre. Para participar do estudo, os pacientes não podiam apresentar doença pulmonar de base e nenhum episódio respiratório nos seis meses que o antecederam. A avaliação respiratória deu-se através de exames de espirometria, manovacuometria, oximetria e gasometria, realizados antes e após uma sessão de HD. As variáveis espirométricas foram analisadas em percentagens de valores de referência em substituição a valores absolutos com o objetivo de eliminar efeitos de idade, altura e sexo. A capacidade vital forçada (CVF), o volume expiratório forçado no primeiro segundo (VEF1) e o pico de fluxo expiratório (PFE) apresentaram um aumento significativo após sessão de HD. O fluxo expiratório forçado, 25 a 75% da manobra de capacidade vital forçada (FEF25-75%), também apresentou melhora após HD, porém, esta não foi estatisticamente significativa O aumento observado nas variáveis espirométricas se refletiu numa variação nos laudos espirométricos em 27% dos pacientes, ocorrendo principalmente naqueles que apresentavam quadro de distúrbio ventilatório restritivo. Houve um aumento significativo no número de espirometrias normais, passando de 12 (37%) para 17 (52%). A manovacuometria foi utilizada para medir a força muscular respiratória e os dados foram analisados em percentagens de valores previstos. A força muscular inspiratória e expiratória, medida pela pressão inspiratória máxima (PImáx) e pressão expiratória máxima (PEmáx) respectivamente, apresentaram aumento significativo. A oximetria não acompanhou as variáveis espirométricas e força muscular respiratória, permanecendo inalterada após HD. Isso pode ser explicado pelos resultados encontrados na gasometria, após HD houve um aumento substancial no pH e nos níveis de bicarbonato, caracterizando um quadro de alcalose metabólica. Observou-se também queda na pressão parcial de oxigênio e aumento na pressão parcial de dióxido de carbono, provavelmente na tentativa de restabelecer o valor do pH Assim, constatou-se que, mesmo sem apresentar sintomas respiratórios, pacientes renais crônicos, na maioria das vezes, apresentam alteração na função pulmonar que melhora após tratamento com HD. Dos 33 pacientes avaliados do ponto de vista respiratório, 17 foram selecionados para análise de estresse oxidativo. Utilizaram-se como critérios de exclusão, pacientes com doenças hepáticas, processos inflamatórios crônicos, doença cardíaca conhecida, tabagistas e alcoolistas. Como não existem valores de referência para estresse oxidativo, 18 indivíduos saudáveis e não fumantes formaram o grupo controle. A lipoperoxidação (LPO) em eritrócitos foi medida por quimiluminescência (QL). Os doentes renais crônicos apresentaram níveis expressivamente maiores que os controles, que permaneceram os mesmos após uma sessão de HD. O dano às proteínas no plasma observado através da técnica das carbonilas, não mostrou variação relevante após sessão de HD, e os níveis apresentados pelos pacientes foram significativamente superiores aos observados nos controles. Nos eritrócitos, o sistema antioxidante enzimático, foi verificado através da atividade das enzimas superóxido dismutase (SOD) e catalase (CAT). Ambas apresentaram o mesmo perfil: atividade consideravelmente diminuída quando comparada com controles, não modificando após uma sessão de HD. No plasma, a capacidade antioxidante total (TRAP), foi muito superior nos pacientes quando comparados aos controles, com importante redução após sessão de HD Analisou-se também o metabolismo do óxido nítrico (NO) através de seus metabólitos: nitritos e nitratos. Os nitritos mostraram-se expressivamente aumentados nos doentes renais, e ainda mais após sessão de HD. Os nitratos quando comparados aos controles, apresentaram valor semelhante. Seus níveis aumentaram após tratamento, porém, de forma estatisticamente irrelevante. Portanto, após HD, houve incremento no estresse oxidativo caracterizado por elevação nos níveis de nitritos e redução do TRAP, apesar do dano a lipídios e proteínas não ter aumentado neste tempo de avaliação.

Imunoquantificação da proteína S100beta em líquor, soro e tecido cerebral por um ensaio de quimioluminescência

A proteína S100β pertence a uma família de proteínas ligantes de cálcio ácidas e de baixo peso molecular, e tem sido implicada no desenvolvimento e manutenção do sistema nervoso. Esta proteína tem atividade neurotrófica e gliotrófica e está localizada principalmente no Sistema Nervoso Central em astrócitos e células de Schawnn, mas pode ser detectada em menores concentrações em outras células, como melanócitos e adipócitos. Relatos sugerem que a S100β está envolvida nos mecanismos da neuropatologia principalmente na doença de Alzheimer e Síndrome de Down, onde astrócitos reativos expressam altos níveis desta proteína. Neste trabalho foi padronizado uma técnica imunoluminométrica muito sensível (0,02 µg/L) que utiliza um anticorpo marcado com o isoluminol como molécula “tracer”. A emissão de luz na fase final da reação é diretamente proporcional a concentração de proteína S100β das amostras. Na fase inicial do trabalho utilizamos amostras biológicas (soro, LCR e tecido cerebral) de ratos e também realizamos alguns ensaios metodológicos para se avaliar a sensibilidade, especificidade e a reprodutibilidade do imunoensaio. Demonstramos que o método empregado para se coletar sangue e LCR de ratos influencia na quantificação da proteína S100β. Finalmente, utilizamos este imunoensaio em investigações clínicas. Observamos que níveis desta proteína em pacientes diagnosticados com mielopatia associada ao vírus HTLV-I estava aumentada no soro, mas não em LCR. Também quantificamos a proteína em fluído amniótico, sendo que nas gestantes com fetos diagnosticados com Síndrome de Down os níveis foram mais elevados.

Estudo da fosforilação e estrutura de filamentos intermediários em astrócitos permeabilizados com digitonina

O dinâmico processo de polimerização e despolimerização dos filamentos intermediários de astrócitos é modulado principalmente por fosforilação da proteína ácida fibrilar glial (GFAP). Os sítios de fosforilação da GFAP estão localizados na porção N-terminal, onde atuam proteínas quinases dependentes de AMPc e Ca2+. Este processo vem sendo investigado em fatias cerebrais, culturas de astrócitos, frações citoesqueléticas ou sistemas purificados. Neste trabalho estamos descrevendo uma nova técnica para o estudo do sistema fosforilante da GFAP que consiste na permeabilização de astrócitos em cultura com digitonina, Este modelo permite o acesso aos sítios intracelulares mantendo preservada, ainda que parcialmente, a compartimentalização celular. As condições de permeabilização foram estebelecidas com base na exclusão ao azul de Tripan. A incubação das células com AMPc e Ca2+ promoveram o aumento da fosforilação da GFAP, enquanto imunocitoquímica com anti-GFAP mostrou que em condições basais astrócitos permeabilizados mantém sua morfologia protoplasmática típica e apresenta a estrutura dos filamentos intermediários preservada. Ao incubar os astrócitos permeabilizados com AMPc estes filamentos aparentemente condensaram formando longos processos. Estes resultados sugerem que esta técnica tem potencial considerável para o estudo de alterações estruturais nos filamentos gliais em paralelo com a fosforilação de proteínas por permitir o uso de moduladores específicos de proteínas quinases e fosfatases.